ヒトメラノーマ腫瘍浸潤リンパ球から誘導多能性幹細胞の生成

この実験の全体的な目標は、浸潤リンパ球に浸潤した黒色腫から人工多能性幹細胞またはiPS細胞を生成することです。この方法は、腫瘍免疫学、特にがん免疫療法の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、腫瘍浸潤リンパ球からヒトiPS細胞を作製する能力により、免疫治療のための低分化腫瘍特異的T細胞を無制限に提供できることです。

現在、臨床におけるT細胞の生存率が低いことが適応T細胞療法の主な制限となっているため、この技術は転移性黒色腫の治療に応用できる可能性があります。この方法は、腫瘍微小環境におけるT細胞受容体レパートリーの調査にも有用である可能性があります。その手順を実演していただくのは、私の研究室のポスドクフェローである岩渕久美子先生です。

腫瘍材料を入手した後、5〜20グラムの腫瘍標本を選択し、はさみを使用して、腫瘍サンプルの壊れやすいまたは血まみれの壊死領域から正常、固体、および固い組織を解剖します。解剖した検体をできるだけ細かく刻み、解離器とヒト腫瘍解離キットを使用して、メーカーの指示に従ってミンチした腫瘍片を単一細胞懸濁液に分散させます。解離の終わりに、70ミクロンのストレーナを通して細胞を50ミリリットルのチューブにろ過し、2ミリリットルのRPMI 1640でストレーナーを2回洗浄します。

次に、遠心分離によって細胞をペレット化し、細胞を10ミリリットルの新鮮なT細胞培地に再懸濁します。密度勾配によって細胞を分離するには、最初に30ミリリットルの75%勾配溶液を層詰め、続いてカルシウムまたはマグネシウムを含まないDPBSの100%勾配溶液を10ミリリットルの新しい50ミリリットルのチューブに層詰めます。次に、層を破壊したりサンプルを遠心分離したりしないように注意しながら、細胞をグラジエント溶液に慎重に重ね合わせます。

分離の終了時に、グラジエント溶液間の界面にある濃縮腫瘍浸潤リンパ球またはTILを新しい50ミリリットルの円錐管に移し、20〜30ミリリットルの新鮮なDPBSで細胞を洗浄します。ペレットを10ミリリットルの新鮮なT細胞培地に再懸濁し、次に6ウェルプレートの5つのウェルにウェルあたり2ミリリットルのTILを追加し、TIL培養物に組換えヒトIL-2を摂氏37度と5%二酸化炭素で5日間補給します。5日目に、各ウェルの培地の半分を交換し、その後は2〜3日ごとに交換します。

培養物が80〜90%のコンフルエント度に達したら、ピペットを使用して各ウェルの細胞を穏やかに再懸濁し、組換えヒトIL-2を添加した新鮮なT細胞培地1ミリリットルで培養物を1対2の比率で分割します。マイトマイシンC処理SNLフィーダープレートを調製するには、まず、0.1%ゼラチンでコーティングされた10cmの皿で10ミリリットルのSNLフィーダー細胞培地でSNLフィーダー細胞を培養します。細胞が80〜90%コンフルエントになったら、フィーダーをマイトマイシンCで摂氏37度、5%二酸化炭素中で2時間15分間処理します。

インキュベーションの終わりに、5ミリリットルのDPBSで細胞を2回洗浄します。次に、室温のトリプシン-EDTAでフィーダーを取り外します。1分後、4.5ミリリットルの新鮮なSNLフィーダー培地で解離反応を中和し、単一細胞懸濁液を15ミリリットルのコニカルチューブに移して遠心分離します。

ペレットを10ミリリットルの新鮮なSNLフィーダーセル培地に再懸濁してカウントします。その後、1ウェルあたり6つのSNLフィーダーセルに1.5×10を10cmの皿に1.5倍プレートし、5%二酸化炭素中で37°Cの培養物を最大3日間インキュベートします。センダイウイルスでiPS細胞を作製するためには、組換えヒトIL-2と可溶性マウス抗ヒトCD28を添加した新鮮T細胞培地2ミリリットル中にマウス抗ヒトCD3を被覆した新しい6ウェルプレートに、1ウェルあたり10〜5番目のTILを5回移します。

細胞培養インキュベーターでTILを5日間活性化します。次に、ピペットを使用して、培養物を15ミリリットルの円錐形チューブにプールしてカウントします。次に、500マイクロリットルのリプログラミング培地に抗ヒトCD3でコーティングされた24ウェルプレートに、組換えヒトIL-2に可溶性マウス抗ヒトCD28を添加した、ウェルあたり10〜5番目のTILを1回移します。

細胞培養インキュベーターで24時間後、各ウェルの細胞を列挙し、適切な感染の多様性で数量のウイルスを調製します。次に、10 MOI から 20 MOI のセンダイウイルスベクターの混合物を適切な量の培地に加え、ウイルス含有培地を TIL の各ウェルに加えます。形質導入効率を測定するには、計算した量のセンダイウイルスGFPを活性化TILのウェルに加え、培養物をインキュベーターに24時間戻します。

翌日、センダイウイルスGFP感染細胞を蛍光顕微鏡で観察し、形質導入の感染効率を推定します。各ウェルからウイルス感染した細胞を遠心分離用の15ミリリットルチューブにプールし、霊長類胚性幹細胞培地と塩基性線維芽細胞増殖因子を添加したヒト胚性幹細胞培地0.5ミリリットルにペレットを再懸濁します。次に、9.5ミリリットルの新鮮なヒト胚性幹細胞培地を細胞に加え、懸濁液をマイトマイシンC処理したSNLフィーダー細胞プレートに移します。

この画像では、抗CD3およびCD28で活性化する準備ができている組換えヒトIL-2による培養の21日目のTILが示されています。TILは、20回の感染の多重度でセンダイウイルスにトランスフェクションできます。ここでは、センダイウイルス感染の18〜21日後のSNLフィーダー細胞上の典型的な多能性クローンを示しています。

この代表的な核グラムで観察されたように、TIL由来のiPS細胞は正常な核型を示します。TIL由来iPS細胞上での多能性マーカー発現を確認するための免疫蛍光染色は、これらの細胞が典型的な多能性マーカーの期待される発現レベルを示すことを示しています。さらに、メラノーマTILに由来するiPS細胞は、3つの胚葉からさまざまな細胞を含む奇形腫を形成することができます。

さらに、TIL由来のiPS細胞は、キャピラリー電気泳動によって評価されたT細胞受容体の再配列を保持していました。私たちの最初の開発であるこの技術は、腫瘍学の分野の研究者が転移性黒色腫患者に対するより効果的ながん免疫療法を探求するための道を開くものです。この手技を試みる際には、センダイウイルス感染前にT細胞の増殖と生存率を確認し、コンターGFP発現による感染効率を評価することが重要です。

このビデオを見た後、メラノーマTILからヒトTIL細胞を生成する方法をよく理解しているはずです。