Name: ヒトメラノーマ腫瘍浸潤リンパ球から誘導多能性幹細胞の生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: 学ぶヒトメラノーマ腫瘍浸潤リンパ球からiPSCを生成する方法。センダイウイルスを用いた再プログラミングにより、がん免疫療法のための無限のT細胞供給源を確立し、転移性黒色腫治療への応用を探索する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

私たちは、組織調達コアのデボラ・ポスティフさんとジャックライン・バリクダーさん、そしてミシガン大学の多能性幹細胞コア研究所のシンディ・デロング博士の技術支援に感謝します。 この研究は、ミシガン大学のスタートアップ資金と、Central Surgical Association、American College of Surgeons、Melanoma Research Alliance、および NIH/NCI (1K08CA197966-01) から F. Ito. への助成金によって支援されました。

注：患者は、治験審査委員会に参加するためにインフォームドコンセントを与えるべきであり、ヒト多能性幹細胞の委員会は、研究を承認しました。 1.単離とのTILの文化<ol><li>病理サービス/組織の調達コアからの病理組織学的診断のために必要とされない腫瘍材料を入手します。メディアを収集する30ミリリットルの腫瘍（ 表1）を用いて50 mlチューブに腫瘍標本の20〜100グラムを置きます。 </li><li>固体、しっかりと、はさみを使用して、脆弱および/または血の壊死領域からの腫瘍標本の正常組織を解剖。壊死組織を除去した後、可能な限り小さく、試料をミンチするはさみを使用してください。 </li><li>製造者の指示に従って解離および腫瘍解離キット（ヒト）を使用して単一細胞懸濁液に刻んだ試料を解離させます。 50ミリリットルチューブに設定されている70μmのセルストレーナーでサスペンションを濾過して、ストレーナを2回洗浄RPMI1640培地2mlの。 </li><li> 5分間、室温で200×gで遠心分離します。上清を捨て、T細胞培地（ 表1）の10ミリリットル中に細胞を懸濁します。 </li><li> 100％勾配液及びダルベッコのリン酸で希釈した75％の勾配溶液30mlの中間ステップを10mlの下段で、50 mlチューブにかかるフィコール（勾配液）としての2段階勾配液を調製緩衝生理食塩水、無カルシウム、無マグネシウム（D-PBS（ - ））。 </li><li> （ステップ1.5）の勾配溶液に（工程1.4からの）細胞懸濁液レイヤ。 45分間20℃で400×gで遠心分離します。 </li><li> 100％勾配溶液、50 mlチューブ75％勾配液との界面に濃縮されたのTILを含む層を集め。 （ - ）D-PBS 20〜30 mlで添加することによって富化のTILの溶液の層を希釈します。 </li><li> 5分間、室温で200×gで遠心分離します。上清を捨て、10mlのTIL濃縮画分を再懸濁T細胞メディア。 </li><li> 37℃、5％CO 2で6ウェルプレート中のT細胞培地を2ml 6,000 IU / mlの組換えヒト（RH）IL-2との培養（工程1.8からの）画分。 </li><li>培養開始後5日目に半分メディアを変更し、その後2〜3日ごと。 </li><li> 80〜90％コンフルエントに達したとき、ウェルの数を2倍、そっと懸濁した後、トリプシン処理することなく、2：1の割合で細胞を分割します。 6000 IU / mlで新鮮なT細胞培地とのrhIL-2の半分の体積（1ミリリットル）を追加します。 </li></ol>マイトマイシンC処理したSNLフィーダー細胞プレートの調製<ol><li> 0.1％ゼラチンでコーティングした10cmディッシュ上のSNLフィーダー細胞培地（ 表1）10ml中の培養SNLフィーダー細胞を80〜90％コンフルエンス（3-4×10 6細胞）に到達するまで。 </li><li>直接SNLフィーダー細胞培養皿に0.4 mg / mlでマイトマイシンC溶液310μLを加え、37℃で2時間15分間、5％CO 2でインキュベートします。メディアAを吸引（ - ）ND 5ミリリットルのD-PBSで2回細胞を洗浄します。 </li><li> 0.5ミリリットル0.25％のトリプシン/ 1mMのEDTAを添加し、細胞を解離するために1分間室温でインキュベートします。単一の懸濁液に細胞を中和し、再懸濁するためにSNLフィーダー細胞培地の4.5ミリリットルを追加します。 </li><li> 5分間、200×gで15ミリリットルチューブと遠心分離機に細胞を移します。メディアを吸引し、SNLフィーダー細胞培地10mlに再懸濁した後、血球計算板を用いて細胞を数えます。 </li><li>プレート10cmディッシュ上のSNLフィーダー細胞のウェル当たり1.5×10 6細胞を、37℃、5％CO 2でインキュベートします。 3日以内のSNLフィーダー細胞を使用してください。 </li></ol>センダイウイルス（SeVの）ベクトルを用いたiPS細胞の3世代<ol><li> （ステップ1.11から）のTILを収穫し、プレート結合マウス抗ヒトCD3（1μg/ ml）および可溶性マウス抗ヒトCD28（5μg/ ml）でのTILの5×10 5細胞を活性化し、のrhIL-2と3で6ウェルプレート中のT細胞培地2ml中（6,000 IU / ml）を7℃で、5日間、5％CO 2。 </li><li>ピペットを用いて15mlチューブ（ステップ3.1）からのTILを採取し、血球計で細胞数を数えます。 </li><li> 500μlの中のrhIL-2（60 IU / ml）で、プレートに結合したマウス抗ヒトCD3（1μg/ mlの）および可溶性マウス抗ヒトCD28（5μg/ ml）でのTILの1×10 5個の細胞を再活性化37℃で24ウェルプレート中のウェルあたり再プログラム培地（ 表1）、24時間、5％CO 2の。センダイウイルス感染のための3つのウェルを準備します。OCT3 / 4、SOX2、KLF4、およびc-MYC（1ウェル）。センダイウイルス感染（GFP：緑色蛍光タンパク質）（1ウェル）。細胞数（1ウェル）。 </li><li> （ステップ3.3から）24時間後、血球計数器を用いて細胞数をカウントし、感染症の様々な（3-20）多重度（MOI）のために各ウイルスの量を決定します。 -80℃ストレージからセンダイウイルスベクター管の1セットを削除してください。水浴（37℃）で急速センダイウイルスベクターを解凍し、氷の上に置きます。 ウイルスの容量（μL）ウイルスの細胞/力価（CIU / ml）を×10-3（μL/ ml）を= MOI（CIU /セル）x個</li><li>活性化のTILを含む培地中に10〜20 MOIでセンダイウイルスベクターの混合物を添加することにより、個別にOCT3 / 4、SOX2、KLF4、およびc-MYCを担持4センダイウイルスベクターチューブのそれぞれの計算されたボリュームを追加します。 </li><li>形質導入効率を決定するために、活性化したのTILのウェルにのSeV-GFPの計算されたボリュームを追加します。 </li><li> 24時間、37℃、5％CO 2のインキュベーター内（ステップ3.5およびステップ3.6から）の皿を置きます。 24時間後、蛍光顕微鏡下でのSeV-GFPに感染したTILを使用して、感染効率を推定します。 </li><li> 15ミリリットルチューブに（ステップ3.5から）の細胞を収集します。 5分間、室温で200×gで遠心分離します。 </li><li>上清を捨て、霊長類ES細胞用培地および塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF、4 ngの/ ml）でのhESC培地0.5mlにペレットを再懸濁。 </li><li>コンタ10cmの皿にサスペンションを移しインのhESC培地10mlにSNLフィーダー細胞をマイトマイシンCで処理しました。コロニーが成長するまで一日おきのhESCのメディアを変更します。 </li><li> 18〜21日頃、クリーンベンチ内で10μlのチップを用いて、顕微鏡下でコロニーの周りのSNLフィーダー細胞を除去します。 </li><li> 10μlのチップを用いてコロニーを掻き取り、96ウェル組織培養プレートのウェルあたりiPS細胞培地100μlの中に200μlのチップを使用して転送します。 2-3時間で上下ピペット50から100ミクロンの平均サイズが小さな塊にコロニーを破壊します。 </li><li>塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF、4 NG / ml）を用いてiPS細胞培地のウェルあたり2ml中の（工程2から）マイトマイシンC処理したSNLフィーダー細胞を6ウェル組織培養プレートに小塊を移します。毎日iPS細胞のメディアを変更します。 </li><li>すべての5-6日に1mg / mlのコラゲナーゼIVで新鮮マイトマイシンC処理したSNLフィーダー細胞を6ウェル組織培養プレートにiPS細胞を移します。 IMMUNのために各クローンのプレート当たり2つのウェルを準備ostaining。 </li><li>多能性マーカー（SSEA3、SSEA4、TRA-1-60、TRA-1-81、およびOCT3 / 4）1の免疫組織化学染色により各クローンの完全な再プログラミングを決定します。 注：多能性の可能性をさらに評価するために、完全に再プログラムIPSCラインが胚様体形成および分化アッセイまたはテラトーマ形成アッセイ16により三胚葉に分化することができることを確認します。 </li><li>完全に再プログラムIPSCラインは細胞遺伝学的解析により、正常な核型を示すことを確認してください。 </li><li>テラトーマ形成のために、6〜8週齢の雌NOD / SCIDマウスの皮下組織に10％FCSを含むDMEM100μl中の未分化TIL由来のIPSC（1×10 6）の懸濁液を注入します。ヘマトキシリンおよびエオシンで染色奇形腫セクション。 </li></ol> SSEA3、SSEA4、TRA1-60およびTRA1-81のためのiPS細胞の4.免疫蛍光染色<ol><li> 1 mlのPBSと4％のPAの1ミリリットルでiPS細胞を固定で洗浄性IPSC10分間raformaldehydeソリューション。 4％パラホルムアルデヒド溶液を除去し、1mlのPBSで3回iPS細胞を洗います。 注：パラホルムアルデヒドを使用しているとき、それは毒性があるので注意してください。 </li><li> 30分間緩衝液（ 表1）を遮断してiPS細胞を前処理。一方、PBSおよびトリトンで希釈した一次抗体（ラット抗ヒトSSEA3、マウス抗ヒトSSEA4、マウス抗ヒトTRA1-60、およびマウス抗ヒトTRA1-81）1時50分1.5％ヤギ血清溶液を希釈-100（総容量：1ミリリットル）。 </li><li>ブロッキングバッファー（ 表1）を取り外します。希釈した一次抗体溶液を加え、室温で1時間インキュベートします。一方、1.5％ヤギ血清溶液中で二次抗体（抗マウスIgGおよびIgMまたは抗ラットIgM抗体）1:50に希釈します。 </li><li>希釈した一次抗体溶液を除去し、1mlのPBSで3回、5分間ごとにiPS細胞を洗います。希釈された二次抗体溶液を添加し、暗室において室温で45分間インキュベートします。 </l私&gt; <li>希釈した二次抗体溶液を除去し、1mlのPBSで3回、5分間ごとにiPS細胞を洗います。免疫蛍光顕微鏡を用いてiPS細胞を観察します。 </li></ol> Oct3 / 4用のiPS細胞の5.免疫蛍光染色<ol><li> 1 mlのPBSと10分間、4％パラホルムアルデヒド溶液の1mlでiPS細胞を固定と洗浄性IPSC。 4％パラホルムアルデヒド溶液を除去し、PBSで3回iPS細胞を洗います。 </li><li>透過化緩衝液（ 表1）を加え、室温で10分間インキュベートします。透過化緩衝液を除去し、緩衝液（ 表1）をブロックに追加します。 </li><li>室温で30分間インキュベートします。一方、ブロッキング緩衝液中で一次抗体（マウス抗ヒトのOct3 / 4）1:50に希釈します。 </li><li>希釈した一次抗体溶液を加え、4℃で一晩インキュベートします。 </li><li>希釈した一次抗体溶液を除去し、5分間、PBSの1ミリリットルで3回、それぞれのiPS細胞を洗います。一方、ディブロッキング緩衝液で100：二次抗体（ヤギ抗マウスIgG / IgM抗体）1リュート。 </li><li>希釈された二次抗体溶液を添加し、45分間、暗室において室温でインキュベートします。 </li><li>希釈した二次溶液を除去し、1mlのPBSで3回、5分間ごとにiPS細胞を洗います。免疫蛍光顕微鏡下でiPS細胞を観察します。 </li></ol>

<ol><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Wernig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reprogramming+of+fibroblasts+into+a+pluripotent+ES-cell-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state.</a> Nature. 448, 318-324 (2007).</li>
<li>Maherali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directly+reprogrammed+fibroblasts+show+global+epigenetic+remodeling+and+widespread+tissue+contribution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution.</a> Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).</li>
<li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448, 313-317 (2007).</li>
<li>Loh, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+T+cells+from+human+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of T cells from human peripheral blood.</a> Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).</li>
<li>Seki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+terminally+differentiated+circulating+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).</li>
<li>Staerk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+peripheral+blood+cells+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).</li>
<li>Nishimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+rejuvenated+antigen-specific+T+cells+by+reprogramming+to+pluripotency+and+redifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation.</a> Cell Stem Cell. 12, 114-126 (2013).</li>
<li>Vizcardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+Human+Tumor+Antigen-Specific+T+Cells+from+iPSCs+Derived+from+Mature+CD8%28%2B%29+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Regeneration of Human Tumor Antigen-Specific T Cells from iPSCs Derived from Mature CD8(+) T Cells.</a> Cell Stem Cell. 12, 31-36 (2013).</li>
<li>Wakao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+functional+human+mucosal-associated+invariant+T+cells+via+reprogramming+to+pluripotency+and+redifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Expansion of functional human mucosal-associated invariant T cells via reprogramming to pluripotency and redifferentiation.</a> Cell Stem Cell. 12, 546-558 (2013).</li>
<li>Dudley, M. E., Wunderlich, J. R., Shelton, T. E., Even, J., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+tumor-infiltrating+lymphocyte+cultures+for+use+in+adoptive+transfer+therapy+for+melanoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">Generation of tumor-infiltrating lymphocyte cultures for use in adoptive transfer therapy for melanoma patients.</a> J Immunother. 26, 332-342 (2003).</li>
<li>Gros, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+identifies+the+patient-specific+CD8%28%2B%29+tumor-reactive+repertoire+infiltrating+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">PD-1 identifies the patient-specific CD8(+) tumor-reactive repertoire infiltrating human tumors.</a> J Clin Invest. 124, 2246-2259 (2014).</li>
<li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Durable+Complete+Responses+in+Heavily+Pretreated+Patients+with+Metastatic+Melanoma+Using+T-Cell+Transfer+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Durable Complete Responses in Heavily Pretreated Patients with Metastatic Melanoma Using T-Cell Transfer Immunotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 17, 4550-4557 (2011).</li>
<li>Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+immunotherapy+for+cancer%3A+harnessing+the+T+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response.</a> Nat Rev Immunol. 12, 269-281 (2012).</li>
<li>Saito, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+Melanoma+Tumor-Infiltrating+Lymphocytes+to+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of Melanoma Tumor-Infiltrating Lymphocytes to Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2016, 11(2016).</li>
<li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus%2C+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Jpn+Acad+Ser+B+Phys+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).</li>
<li>Ban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+transgene-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+%28iPSCs%29+by+temperature-sensitive+Sendai+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 14234-14239 (2011).</li>
<li>Fujie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Type+of+Sendai+Virus+Vector+Provides+Transgene-Free+iPS+Cells+Derived+from+Chimpanzee+Blood%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">New Type of Sendai Virus Vector Provides Transgene-Free iPS Cells Derived from Chimpanzee Blood.</a> PLoS One. 9, e113052(2014).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

ここでは、OCT3 / 4、SOX2、KLF4、およびc-MYCは、4つの転写のセンダイウイルス媒介形質導入によりiPS細胞に黒色腫のTILを再プログラミングするためのプロトコルを要因を明らかにしました。このアプローチは、T細胞を再プログラムするためのSeVシステムを使用して、非組込み方法7の利点を提供します。 以前の研究では、センダイウイルスの再プログラミング・システムは、線維芽細胞だけでなく、末梢血T細胞7,17のみならずを再プログラムするために高効率で信頼性の高いことが示されました。また、我々は最近、より分化しており、末梢血T細胞は、センダイウイルスベクター16を使用して再プログラムすることができるよりも、例えば、PD-1のような阻害性受容体の高いレベルを発現するメラノーマのTILを示しています。センダイウイルスベクターを用いた抗CD3 / CD28による刺激や感染のタイミングが再プログラミングのTI​​Lで重要でした。末梢血T細胞を被験者7、whilから収穫後直ちに再プログラミングのため...

転写因子の定義されたセットの過剰発現を介して人工多能性幹細胞（iPS細胞）の生成を可能にする細胞再プログラミング技術は、細胞ベースの治療法1,2の分野において非常に有望です。これらのiPS細胞は、転写およびエピジェネティックな特徴を示すと同様に、胚性幹細胞（ESC）3-5の自己再生および多能性の能力を有します。過去10年間にリプログラミング技術で作られた著しい進歩は、私たちはあっても、このようなT細胞6-8のような分化細胞からヒトiPS細胞を生成することができました。 T細胞由来のiPS細胞（TiPSCs）はTiPSCs 9-11からの抗原特異的T細胞の再生を可能にする、元のT細胞などのT細胞受容体（TCR）鎖遺伝子の再配列と同じ構成を保持します。 患者の腫瘍から得られた黒色腫浸潤リンパ球（TILを）のほぼ80％は、具体的には、A、腫瘍関連抗原を認識するNDオリジナルの癌細胞12に対する細胞傷害性を維持します。注目すべきこと、のTILのプログラム細胞死タンパク質1（PD-1）の発現は、突然変異した新生抗原特異的CD8 +リンパ球13を含む自己腫瘍反応性レパートリーを同定することが見出されました。取リンパ球枯渇レジメンおよびインターロイキン2（IL-2）の全身投与と組み合わせてex vivoで拡大した自己のTILの養子移入は、患者14のサブセットに転移性メラノーマの実質的な後退を引き起こす可能性があります。前臨床モデルおよび患者に結果を励みにもかかわらず、貧しい注入されたT細胞の生存および免疫抑制経路の存在は、養子T細胞療法の可能性を最大限に妥協するように見えます。現在の臨床プロトコルは、多数を得るために、自己T細胞の大規模なex vivoでの操作を必要とします。これは、悪い生存率を有する最終分化T細胞の生成をもたらす、減少proliferative容量、およびPD-1 15の高レベル。 養子T細胞療法のこの制限は、理論的には、免疫療法のための自己T細胞の無制限の供給源を提供することができるiPS細胞を使用することによって克服することができます。我々は最近、センダイウイルス（SeVを）4転写因子の媒介形質導入、OCT3 / 4、SOX2、KLF4、およびc-MYC 16によるPD-1の高レベルで発現メラノーマのTILの再プログラミングを報告しています。レトロウイルスベクターは、再プログラミング遺伝子を発現するために宿主染色体への統合を必要とするが、センダイウイルスベクターは、非組み込みがあり、最終的に細胞質から排除されています。リプログラミング効率がレンチウイルスまたはレトロウイルスベクターを6-8と比較したSeVシステムとはるかに高いです。レンチウイルスまたはレトロウイルスベクターにより生成されるいくつかのIPSCのクローンは非リンパ系系列6-8由来することができるしながらさらに、センダイウイルスは、具体的には、末梢血単核細胞（PBMC）中のT細胞を再プログラムすることができます。ここでは、詳細手順は、ヒトメラノーマのTILの単離および活性化のためにとのSeVの再プログラミング・システムを使用してTIL由来のiPS細胞の生成のために実装されています。

<table><tbody><tr><td>優しいMACS Cチューブ</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>優しいMACS解離者</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>腫瘍解離キット、ヒト</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-929</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 70 um Cell Strainer</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>BDファルコン50ml円錐形CntrifugeチューブBD</td><td></td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>の生命技術</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>ヒトAB血清</td><td>L</td><td></td>-グルタミン(200mM)34005100 <td></td></tr><tr>L<td>-グルタミン(200mM)</td><td>生命技術</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール(1000x、55mM)</td><td>生命技術</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン&nbsp;</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 15140-122</td><td></td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (-)</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 14040-133</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト (rh) IL-2</td><td>アルデスロイキン, Prometheus Laboratories Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>精製NA/LEマウス 抗ヒトCD3</td><td>BD</td><td>555329</td><td></td></tr><tr><td>精製NA/LEマウス 抗ヒトCD28</td><td>BD</td><td>555725</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15</td><td>ロンザ</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ギブコ</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>N-アセチルシステイン</td><td>カンバーランドファーマシューティカルズ株式会社</td><td>NDC 66220-207-30</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 組織培養プレート (6 ウェル)</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 組織培養プレート (24 ウェル)</td><td>Corning</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Sendai ウイルスベクター</td><td>DNAVEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SNL フィーダー細胞</td><td>Cell Biolabs, Inc</td><td>CBA-316</td><td></td></tr><tr><td>マイトマイシン C</td><td>SIGMA</td><td>M4287</td><td>水溶性 (0.5 mg/ml)</td></tr><tr><td>ゼラチン</td><td>SIGMA</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>基礎性線維芽細胞増殖因子(bFGF)</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ PHG0264</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒトメラノーマ腫瘍浸潤リンパ球から誘導多能性幹細胞の生成

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

ex vivoでの養子移入は、転移性黒色腫を有する患者のかなりの部分集合で、耐久性と完全な応答を媒介することができる自己腫瘍浸潤リンパ球（TILを）を拡大しました。このアプローチの主要な障害は、テロメアの短縮に起因する転送T細胞の減少生存率であり、のTILの限られた数の患者から得られました。長いテロメアを有するあまり分化T細胞は、養子T細胞療法のための理想的なT細胞のサブセットであろうが、これらのあまり分化T細胞を大量に生成することは問題があります。この養子T細胞療法の制限理論的にその自己複製人工多能性幹細胞（iPS細胞）を使用することによって克服することができる、多能性を維持するためには、テロメアの伸長、および免疫療法のための自己T細胞の無制限の供給源を提供しています。ここで、我々はのTILへの再プログラミング因子の伝達にセンダイウイルスベクターを用いてiPS細胞を生成するためのプロトコルを提示します。このプロトコルは、生成します完全に再プログラム、ベクトルフリーのクローンです。これらのTIL由来のiPS細胞は養子T細胞療法のためのあまり分化patient-および腫瘍特異的T細胞を生成することができるかもしれません。

図1は、抗CD3 / CD28による活性化とのTILにOCT3 / 4、KLF4、SOX2、およびc-MYCの遺伝子導入が続いているのrhIL-2と黒色腫のTILの初期膨張を伴う手順の概要を示していますiPS細胞の生成のため。通常、のrhIL-2開始と文化についてのTILは21-28日間培養開始後に球を形成しました。この時点で、のTILは、抗CD3 / CD28で活性化される準備ができていること、21日目のrhIL-2と文化を、。 図2AはのTILを示している抗CD3 / CD28で活性化される準備ができている。 図2Bは、GFPの導入を示しています20でトランスフェクトされたセンダイウイルス（SeVを）によってMOI。 図2Cは、18-21日のSeV感染後に表示されるのSNLフィーダー細胞上の典型的な多能性クローンを示している。 図2Dは、生成されたTIL由来のiPS細胞は、正常な核型を持っていること...

このプロトコルの目標は、メラノーマ腫瘍浸潤リンパ球を人工多能性幹細胞に再プログラミングするためのプロトコルを示すことです。

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

本実験の全体的な目的は、メラノーマ浸潤リンパ球から人工多能性幹細胞（iPS細胞）を樹立することです。この手法は、腫瘍免疫学、特にがん免疫療法の分野における重要な課題の解決に寄与します。本手法の主な利点は、腫瘍浸潤リンパ球からヒトiPS細胞を樹立できることで、免疫療法のために分化度の低い腫瘍特異的T細胞を無制限に供給できる可能性があることです。現在、臨床におけるT細胞の生存率の低さが適応T細胞療法の大きな制限となっているため、本手法は転移性メラノーマの治療に応用できる可能性があります。また、本方法は腫瘍微小環境におけるT細胞受容体レパートリーの解析にも有用であると考えられます。本手順の実演は、私の研究室の博士研究員であるDr.Kumiko Iwabuchiが行います。腫瘍組織を入手した後、5～20 gの腫瘍検体を選択し、ハサミを用いて、腫瘍サンプルの脆弱な領域や血性の壊死領域から、正常で固く、弾力のある組織を切り出します。切り出した検体を可能な限り細かく刻み、その後、解離装置とヒト腫瘍解離キットを用いて、製造元の指示に従い、刻んだ腫瘍片を単一細胞懸濁液に分散させます。解離後、細胞を70 µmのストレーナーでろ過して50 mLチューブに回収し、ストレーナーを2 mLのRPMI 1640で2回洗浄します。次に、遠心分離によって細胞をペレット化し、10 millilitersの新鮮なT細胞培地で再懸濁します。密度勾配による細胞分離を行うため、まずカルシウムおよびマグネシウム不含のDPBSで調製した75%勾配溶液30 millilitersを新しい50 milliliterチューブに入れ、その上に100%勾配溶液10 millilitersを積層します。その後、層を乱さないように注意しながら、勾配溶液の上に慎重に細胞を重層し、サンプルを遠心分離します。分離終了後、密度勾配溶液の界面に集積した濃縮腫瘍浸潤リンパ球（TIL）を新しい50 mLコニカルチューブに移し、20～30 mLの新鮮なDPBSで細胞を洗浄する。ペレットを10 mLの新鮮なT細胞培地で再懸濁し、6ウェルプレートの5つのウェルに1ウェルあたり2 mLのTILを分注する。その後、リコンビナントヒトIL-2を添加し、37℃、5%二酸化炭素条件下で5日間培養する。5日目に各ウェルの培地の半分を交換し、それ以降は2～3日ごとに培地交換を行う。培養細胞が80〜90%コンフルエントになったら、ピペットを用いて各ウェルの細胞を穏やかに再懸濁し、Recombinant Human IL-2を添加した1 mLの新鮮なT細胞培地で1:2の比率に分割します。ミトマイシンC処理したSNLフィーダープレートを調製するには、まずSNLフィーダー細胞を、0.1%ゼラチンコートした10 cmディッシュ上の10 mLのSNLフィーダー細胞培地で培養します。細胞が80〜90%コンフルエントになったら、フィーダー細胞を37 °C、5% CO2条件下で2時間15分間、ミトマイシンCで処理します。インキュベーション終了後、5 mLのDPBSで細胞を2回洗浄します。次に、室温のTrypsin-EDTAを用いてフィーダー細胞を剥離させます。1分後、4.5 mLの新鮮なSNLフィーダー培地を加えて解離反応を中和し、単一細胞懸濁液を15 mLコニカルチューブに移して遠心分離にかけます。カウントのため、ペレットを10 millilitersの新鮮なSNLフィーダー細胞培地で再懸濁します。次に、10 centimeterディッシュに1ウェルあたり1.5 × 10⁶個のSNLフィーダー細胞を播種し、37 °C、5% CO2条件下で最大3日間培養します。センダイウイルスを用いてiPSCを生成するには、Recombinant Human IL-2および可溶性マウス抗ヒトCD28を添加した2 millilitersの新鮮なT細胞培地を用い、マウス抗ヒトCD3でコーティングした新しい6ウェルプレートに、1ウェルあたり5 × 10⁵個のTILsを移します。TILsを細胞培養インキュベーター内で5日間活性化させます。次に、ピペットを使用して培養物を15 mLコニカルチューブに回収し、計数を行います。続いて、可溶性マウス抗ヒトCD28およびRecombinant Human IL-2を添加したリプログラミング培地500 µLを用い、抗ヒトCD3でコーティングした24ウェルプレートの1ウェルあたり1×10⁵個のTILsを播種します。細胞培養インキュベーターで24時間培養した後、各ウェルの細胞数を算出し、適切な感染多重度（MOI）でウイルスを必要量調製する。次に、10〜20 MOIのセンダイウイルスベクター混合液を適切な量の培地に加え、このウイルス含有培地をTILsの各ウェルに添加する。導入効率を決定するために、計算した量のセンダイウイルスGFPを活性化TILsのウェルに添加し、培養物をインキュベーターに戻して24時間培養する。翌日、蛍光顕微鏡でSendai Virus GFP感染細胞を観察し、導入による感染効率を推定します。各ウェルからウイルス感染細胞を15 milliliterチューブに回収して遠心分離し、primate embryonic stem cell mediumおよびbasic fibroblast growth factorを添加したヒト胚性幹細胞培地0.5 millilitersでペレットを再懸濁します。次に、細胞に新鮮なヒト胚性幹細胞培地9.5 millilitersを加え、懸濁液をmitomycin C処理したSNLフィーダー細胞プレートに移します。この画像では、組換えヒトIL-2を用いて21日間培養し、anti CD3およびCD28による活性化準備が整ったTILsを示しています。TILsは、感染多重度（MOI）20でセンダイウイルスを用いてトランスフェクションすることが可能です。ここでは、センダイウイルス感染から18〜21日後の、SNLフィーダー細胞上の典型的な多能性クローンを示しています。この代表的な核型分析の結果に見られるように、TIL由来iPSCは正常な核型を示しています。TIL由来iPSCsにおける多能性マーカーの発現を確認するための免疫蛍光染色の結果、これらの細胞は典型的な多能性マーカーの期待される発現レベルを示しています。さらに、メラノーマTILから誘導されたiPSCは、三胚葉由来の多様な細胞を含むテラトーマを形成することが可能です。さらに、TIL由来のiPSCsは、キャピラリー電気泳動による評価でT細胞受容体再構成を保持していることが確認されました。我々が初めて開発したこの手法は、腫瘍学分野の研究者が転移性メラノーマ患者にとってより効果的ながん免疫療法を探索するための道を開くものです。この手順を実施する際は、Sendai Virus感染前にT細胞の増殖と生存率を確認し、GFP発現のコンター図によって感染効率を評価することが重要です。このビデオを視聴することで、メラノーマTILからヒトTIL細胞を生成する方法について十分に理解することができます。

generation-induced-pluripotent-stem-cells-from-human-melanoma-tumor

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

人工多能性幹（iPS）細胞からTリンパ球の生成は、T細胞ベースの免疫療法のために胚性幹細胞を使用する代替アプローチを提供します。メソッドは、どちらを利用することによってことを示しています...

Tリンパ球に向かって誘導多能性幹細胞の分化の指示

ここでは、単一のレンチウイルスベクターを用いたプログラミング末梢血の3-4...

STEMCCAレンチウイルスベクターを用いた末梢血からのヒト人工多能性幹細胞の生成

このビデオは、腫瘍抗原特異的人工多能性幹細胞(iPSC)由来のCD8αβ+ T細胞を生成するアッセイを示しています。腫瘍抗原特異的iPS細胞は、間質細胞単層上で増殖し、造血前駆細胞(HPC)に分化します。HPCは、分化培地を用いてCD4+...

人工多能性幹細胞からの単一陽性CD8 T細胞の生成

この記事では、初代培養細胞に新たに取得したメラノーマ組織の調製を記述する方法、および腫瘍細胞から赤血球および線維芽細胞の汚染物を除去する。最後に、我々はどのように説明したCD133...

CD133の患者由来の細胞培養および分離<sup&gt; +</supメラノーマから&gt;推定されるがん幹細胞

この原稿は、抜毛された髪の毛からのヒトケラチノサイトの誘導と維持、およびその後のエピソームベクターによる統合フリーのヒト人工多能性幹細胞（hiPSCs）の生成のための段階的な手順を提供します。...

髪の由来ケラチノサイトを使用した統合フリーヒト誘導多能性幹細胞の生成

このプロトコルは、リプログラミング因子を含むマトリゲルとセンダイウイルスベクターの組み合わせを使用して、フィーダーフリーの状態でヒト末梢T細胞から人工多能性幹細胞(iPSC)を生成する方法を説明しています。...

フィーダーフリー条件にセンダイウイルスを用いてヒト末梢T細胞から人工多能性幹細胞の生成

この作品は、神経堤を介したヒト多能性幹細胞から色素沈着し、成熟したメラノサイトを生成し、無フィーダー、25日のプロトコルを使用して中間段階のメラノブラストするためのin vitroでの分化プロトコルを記述します。...

ヒト多能性幹細胞からメラノサイトのフィーダーフリーの導出

本論文では、三次元(3D)胸腺培養系により腫瘍抗原特異的誘導多能性幹細胞由来の甲状腺系(iTE)を生成する新しい方法について説明する。iTEは、増殖、記憶形成、腫瘍抑制の能力を有するナイーブT細胞と密接に関連するT細胞の均質なサブセットである。...

マウス誘導多能性幹細胞由来腫瘍抗原特異的胸腺移民を生成する三次元胸腺培養システム

本稿では、OP9/DLL1共培養系を用いて機能性腫瘍抗原特異的人工多能性幹細胞由来CD8αβ+単陽性T細胞を生成する方法について説明する。...

腫瘍抗原特異的T細胞の生成にヒト誘導多能性幹細胞を用いた

ここでは、メラノサイト用に最適化されたダイレクトリプログラミングシステムと、スムーズなダイレクトリプログラミングを保証する高効率で濃縮されたウイルスパッケージングシステムについて説明します。...

マウス線維芽細胞のメラノサイトへの直接リプログラミング

ここでは、新鮮なメラノーマ組織から解離細胞懸濁液を培養することにより、メラノーマ患者由来のオルガノイドを生成するプロトコルを紹介します。これらのオルガノイドは 、in vitro で患者特異的な腫瘍を忠実に再現し、腫瘍免疫抑制メカニズム、薬物スクリーニング、薬剤耐性メカニズム、およびがんサーベイランスアプローチを探索するための革新的なアプローチを提供します。...

メラノーマ患者由来オルガノイドモデルによる治療機会の解明

学ぶヒトメラノーマ腫瘍浸潤リンパ球からiPSCを生成する方法。センダイウイルスを用いた再プログラミングにより、がん免疫療法のための無限のT細胞供給源を確立し、転移性黒色腫治療への応用を探索する。

ヒトメラノーマ腫瘍浸潤リンパ球から誘導多能性幹細胞の生成

さらに動画を探す