階層化アルギン酸構築：異種細胞集団の共培養のためのプラットフォーム

本手順の全体的な目的は、3D共培養における異なる細胞集団間の関係を調査するために、再現性のある2層構造のアルギン酸ハイドロゲルディスクを作製することです。この手法は、空間的に不均一な3D培養における複数の細胞集団間の相互作用の研究を促進し、組織工学や荷重支持組織の生理学における重要な課題の解決に寄与します。本技術の主な利点は、機械的刺激に適した構造を持つ、細胞播種済みの多層アルギン酸ハイドロゲルを構築するための、簡便で経済的かつ再現性のある方法を提供することです。

この手順のデモンストレーションを行うのは、私の研究室の大学院生であるPoonam Sharmaです。アルギン酸ディスクを作成するには、まず3x3インチのエンドプレートの上に厚手のフィルターペーパーを重ね、その上にセルマイクロシーブメンブレンを配置します。滅菌済みのスパチュラを使用して、メンブレンとフィルターペーパーを平らにしてください。

次に、スタックをペーパータオルの山の上に反転させ、材料を圧縮して過剰な塩化カルシウム溶液を除去します。続いて、円筒状のウェルを持つゲル形成型をマイクロシーブメンブレンの上に置き、バインダークリップを使用して、型の左右をエンドプレートに軽く固定します。ここで、厚いフィルターペーパーを小さなエンドプレートの上に重ね、その上にマイクロシーブメンブレンを重ねて、先ほど示したようにスタックを反転させて過剰な塩化カルシウムを除去します。

モールドの両半分が準備できたら、目的の細胞を1 mLあたり10⁶個の濃度で、滅菌済みのアルギン酸培地に再懸濁します。細胞が適切に分散すると、混合液は均一に混濁します。次に、細胞懸濁液130 µLを、モールド構造の下半分にある直径6 mm、高さ3 mmの各ウェルに滴下して移します。

各ウェルの縁の上に、わずかに凸状のメニスカスが見えるはずです。すべての細胞を播種した後、滅菌スパチュラを使用して、モールド構造の上半分を注意深くならします。次に、マイクロシーブ膜がウェルの上にくるようにモールドを反転させ、細胞とアルギン酸の混合物を含むウェルを完全に覆うように注意しながら、モールドをウェルの上に配置します。

型がセットされたら、充填した型構造体を持ち上げ、中央を強く押し付けながら、型構造体の残りの2辺にバインダークリップを取り付けて型の上下半分を固定します。細胞入りアルギン酸溶液がウェルにしっかりと収まっていることを確認してください。次に、型構造体全体を、室温の細胞培養フード内で102 millimolar 塩化カルシウム浴に90分間浸漬させます。

インキュベーション終了後、構造体をペーパータオルの上に移し、モールドに上部エンドプレートを固定している2つのバインダークリップを取り外します。構造体の2つの半分を分離します。ウェル内に形成されたハイドロゲルに気泡がなく、ウェルが完全に満たされていることを確認してください。

残りの2つのバインダークリップを取り外し、ハイドロゲルを含むモールドをもう一方のエンドプレートから分離します。スパチュラを用いて、ハイドロゲルが入ったウェルの縁を慎重になぞり、ゲルをゆっくりと剥がします。その後、ハイドロゲルを塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムを含むDPBSのバスに直接移します。

1〜5分後、ハイドロゲルを6ウェルプレートの各ウェルに移します。各ウェルには、ゲルが完全に浸る十分な量のバジル成長培地溶液を入れておき、37 °C、5% CO2の条件下で少なくとも1時間インキュベートします。インキュベーションの最後の30分間に、ゲル形成用モールドの高さの半分となるウェルを持つモールドを、バインダークリップで左右の3×3インチまたは3×1.5インチのアルミニウムエンドプレートに固定し、カッティングモールドを作成します。次に、ゲル形成用モールドよりも直径が3 mm大きいウェルを持つモールドを、左右の3×3インチアルミニウムエンドプレートにクリップで固定し、アニーリングモードを作成します。

次に、ハイドロゲルをカッティングモールドのウェルに移します。各ゲルがウェルにぴったりと収まり、ゲルの半分がモールドの上に突き出している状態にします。そして、メスを用いてモールドの表面に沿って切り、ハイドロゲルを半分に切断します。

ゲルの上半分をひっくり返し、開いたモールドのウェルに入れます。ゲルの断片がウェルにぴったりと収まり、両方の半分がモールドと同じ高さになり、切断した内面が見えている状態にします。次に、乾燥したセルマイクロシーブ膜をウェルの上に置き、アニーリングするすべてのゲルの半分に膜が接触していることを確認し、膜を厚手のフィルターペーパーで覆います。

ゲルが完全に覆われたら、EDTAを添加したクエン酸ナトリウム溶液でろ紙を飽和させ、室温でゲルをインキュベートします。1分後、細胞マイクロシーブ膜と厚手のろ紙を廃棄し、バインダークリップを取り外します。次に、型を開き、ゲルの半分を、切断面を上にして準備したアニーリング型に転送します。

スパチュラを使用して、2枚目の処理済み半面ゲルを1枚目のゲルの上に、切断面同士が接触するように重ねます。すべてのゲルを配置した後、スパチュラでゲルを軽く押し付けて気泡を除去し、アニーリングモールドを塩化カルシウム浴に慎重に浸します。30分後、アニーリングモールドをペーパータオルの山の上に移動させ、バインディングクリップを取り外します。

次に、金型をエンドプレートから分離し、ゲルを短時間 DPBS バスに転移させた後、適切な細胞培養液に浸します。完成した二層ゲルでは、緑色または赤色のセルトラッカー染料で標識された 293 FT 細胞のこの画像に見られるように、細胞集団が完全に分離しています。アニーリング後に埋め込まれたヒト間葉系幹細胞の生存率は、バルクハイドロゲルで観察される細胞生存率と同様に、層状ハイドロゲル内でも高くなっています。

4時間の非拘束サイクリック圧縮における各サイクルのピーク応力を分離して解析した結果、細胞を含まない層状ハイドロゲルは、バルクの非層状細胞不含ハイドロゲルと比較して、サイクリック圧縮に対する応力応答の大きさが有意に小さいことが示されました。なお、どちらのタイプのハイドロゲルも、7日間の培養後も損なわれずに維持されていました。習得すれば、すべての材料調製を含むこの手法は、適切に行えば4時間半以内に完了させることができます。この手順を行う際は、誤りを防ぎ、異なるサンプルをより容易に管理できるよう、慎重にゆっくりと作業することが重要です。

本手順の後、機械的刺激や免疫染色などの他の手法を用いることで、形成される細胞外マトリックスにおける異なる細胞集団間の相互作用に関するさらなる疑問を明らかにすることができます。この手法により、メカノバイオロジーや組織工学分野の研究者は、間葉系幹細胞、軟骨細胞、および髄核細胞などの異なる細胞集団間の関係をより容易に調査することが可能になります。鋭利な器具、生物学的材料、特にヒト細胞の取り扱いは極めて危険であるため、本手順の実施中は、適切な個人用保護具の着用などの予防策を常に講じることを忘れないでください。