Name: 医療機器のための細菌撥ポリマーのハイスループット同定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: 学ぶ 医療機器向け細菌撥ポリマーのハイスループット同定法。マイクロアレイ技術を用いて数百種類のポリマーを同時スクリーニングし、細菌付着を抑制する生体材料を効率的に発見する方法です。蛍光顕微鏡と走査型電子顕微鏡で評価します。

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著者は、EASTBIO(BBSRCが資金提供する東スコットランド生物科学博士課程研修パートナーシップ)と医学研究評議会（P.J.G.)に資金提供に感謝します。

<ol><li>Hansen, A., Mjoseng, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Density+Polymer+Microarrays%3A+Identifying+Synthetic+Polymers+that+Control+Human+Embryonic+Stem+Cell+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Healthc.+Mat%22%5BJournal%5D)">High-Density Polymer Microarrays: Identifying Synthetic Polymers that Control Human Embryonic Stem Cell Growth.</a> Adv. Healthc. Mat. 3 (6), 848-853 (2014).</li>
<li>Tourniaire, G., Collins, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+microarrays+for+cellular+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Polymer microarrays for cellular adhesion.</a> Chem. Commun. (20), 2118-2120 (2006).</li>
<li>Pernagallo, S., Wu, M., Gallagher, M. P., Bradley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonising+new+frontiers-microarrays+reveal+biofilm+modulating+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mat.+Chem%22%5BJournal%5D)">Colonising new frontiers-microarrays reveal biofilm modulating polymers.</a> J. Mat. Chem. 21 (1), 96-101 (2010).</li>
<li>Hay, D. C., Pernagallo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+screening+of+polymer+libraries+to+define+novel+substrates+for+functionala+hepatocytes+with+inducible+drug+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Unbiased screening of polymer libraries to define novel substrates for functionala hepatocytes with inducible drug metabolism.</a> Stem Cell Res. 6 (2), 92-102 (2011).</li>
<li>Anderson, D. G., Levenberg, S., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoliter-scale+synthesis+of+arrayed+biomaterials+and+application+to+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Nanoliter-scale synthesis of arrayed biomaterials and application to human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 22 (7), 863-866 (2004).</li>
<li>Venkateswaran, S., Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteria+repelling+poly%28methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide%29+coatings+for+biomedical+devices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mat.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Bacteria repelling poly(methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide) coatings for biomedical devices.</a> J. Mat. Chem. B. 2 (39), 6723-6729 (2014).</li>
<li>Pickering, H., Wu, M., Bradley, M., Bridle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Giardia+lamblia+Interactions+with+Polymer+Surfaces+Using+a+Microarray+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.l+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Giardia lamblia Interactions with Polymer Surfaces Using a Microarray Approach.</a> Environ.l Sci. Technol. 46 (4), 2179-2186 (2012).</li>
<li>Mizomoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Synthesis+and+Screening+of+Polymer+Libraries+using+a+High+Throughput+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The Synthesis and Screening of Polymer Libraries using a High Throughput Approach.</a> , (2004).</li>
<li>How, S. E., Yingyongnarongkul, B., Fara, M. A., Díaz-Mochón, J. J., Mittoo, S., Bradley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyplexes+and+lipoplexes+for+mammalian+gene+delivery%3A+from+traditional+to+microarray+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Comb.+Chem.+High+Throughput+Screen%22%5BJournal%5D)">Polyplexes and lipoplexes for mammalian gene delivery: from traditional to microarray screening.</a> Comb. Chem. High Throughput Screen. 7 (5), 423-430 (2004).</li>
<li>Thaburet, J. -F., Mizomoto, H., Bradley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Evaluation+of+the+Wettability+of+Polymer+Libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Rapid+Commun%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Evaluation of the Wettability of Polymer Libraries.</a> Macromol. Rapid Commun. 25 (1), 366-370 (2004).</li>
<li>Hook, A. L., Chang, C. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+discovery+of+polymers+resistant+to+bacterial+attachment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Combinatorial discovery of polymers resistant to bacterial attachment.</a> Nat. Biotechnol. 30 (9), 868-875 (2012).</li>
<li>Hall-Stoodley, L., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+concepts+in+biofilm+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evolving concepts in biofilm infections.</a> Cell. Microbiol. 11 (7), 1034-1043 (2009).</li>
<li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persister+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Persister Cells.</a> Ann. Rev. Microbiol. 64 (1), 357-372 (2010).</li>
<li>Sauer, K., Camper, A. K., Ehrlich, G. D., Costerton, J. W., Davies, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+Displays+Multiple+Phenotypes+during+Development+as+a+Biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa Displays Multiple Phenotypes during Development as a Biofilm.</a> J. Bacteriol. 184 (4), 1140-1154 (2002).</li>
<li>Reisner, A., Haagensen, J. A. J., Schembri, M. A., Zechner, E. L., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+maturation+of+Escherichia+coli+K-12+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development and maturation of Escherichia coli K-12 biofilms.</a> Mol. Microbiol. 48 (4), 933-946 (2003).</li>
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<li>Campoccia, D., Montanaro, L., Arciola, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+biomaterials+technologies+for+infection-resistant+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A review of the biomaterials technologies for infection-resistant surfaces.</a> Biomaterials. 34 (34), 8533-8554 (2013).</li>
<li>Imstar. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Pathfinder+Technology+for+High+Content+Cellular+Screening+in+Cell+Biology+and+Genetoxicity+Software+version%3A+6.04I%22">Pathfinder Technology for High Content Cellular Screening in Cell Biology and Genetoxicity Software version: 6.04I</a>. , (2012).</li>
<li>Williams, J. R., Clifford, A. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilliams%2C+JR+%22Supercritical+Fluid+Methods+and+Protocols%22">Supercritical Fluid Methods and Protocols</a>. 13, Humana Press. New Jersey. (2000).</li>
<li>Kuo, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKuo%2C+J+%22Electron+microscopy+methods+and+protocols%22">Electron microscopy methods and protocols</a>. , Humana Press. Totowa, NJ. (2007).</li>
<li>Leslie, D. C., Waterhouse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioinspired+omniphobic+surface+coating+on+medical+devices+prevents+thrombosis+and+biofouling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A bioinspired omniphobic surface coating on medical devices prevents thrombosis and biofouling.</a> Nat. Biotechnol. 32 (11), 1134-1140 (2014).</li>
<li>Bechert, T., Steinrücke, P., Guggenbichler, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+screening+anti-infective+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">A new method for screening anti-infective biomaterials.</a> Nat. Med. 6 (9), 1053-1056 (2000).</li>
<li>May, R. M., Magin, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+engineered+micropattern+to+reduce+bacterial+colonization%2C+platelet+adhesion+and+fibrin+sheath+formation+for+improved+biocompatibility+of+central+venous+catheters%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">An engineered micropattern to reduce bacterial colonization, platelet adhesion and fibrin sheath formation for improved biocompatibility of central venous catheters.</a> Clin. Transl. Med. 4, (2015).</li>
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</ol>

著者には、宣言すべき競合する金銭的利益はありません。

表面への細菌の付着は細菌種、表面の特性、周囲の媒体と物理的環境に依存する要因の広い範囲によって決定される複雑なプロセスです。ある種の化学基は、細菌の結合に影響することが知られているが（ポリグリコールを、例えば、典型的にはアタッチメント11をレジスト）、それらの化学構造を有するポリマーの生物学的影響を関連付けることは困難な特定の機能のためのポリマーの合理的な設計を行うことは困難です。詳細な取り付け機構の非存在下では、他の研究は長く豊富な最適化は、21を処理して、天然に存在する撥水表面を模倣することを試みてきました。ここで提示小型化ハイスループット法は、さらなる研究のためのリード線を識別するために重合体の数百のパラレルスクリーニングを容易にすることによって、これらの課題を克服します。 マイクロアレイ法からの結果は、主にIDEに役立ちますntify可能性の高いリード候補図3は、結合能力の明らかな低下を示していた。 図2は 、少なくとも1種の低い結合を持つ22の候補を示しています。 図2に示すすべての22の低結合性ポリマーは、スケールアップ実験に進められた、その間（撥水性とコーティング特性の面で）最高のPU83、PA13、及びPA515（ 図4、図 5）であると決定されました。ポリアクリレートは、重合方法の点でより大きな柔軟性を提供するので、最も低い結合ポリアクリレート、PA13は、カテーテルのコーティング試験のために選択した（ 図6および7）。他の候補者に関するより詳細なさらなる作業が行われた他の場所6報告されています。 実験反復回数を通して、私たちはマイナーなステップ数は成功と再現性への鍵だったが見つかりました。だけでなく、の付着を促進しますアガロースは、細菌のコロニー形成に対して非常に抵抗性であるように、クリーンな背景を提供するアンダーコーティングアガロースを用いてガラススライドにポリマー。同様に、ポリマー中の一貫性は、同じアレイ内およびアレイ間の両方、自分自身をスポット不可欠なため、アレイの印刷が慎重に制御されなければならないです。プリントヘッドのピンと384ウェルプレートのさらに均一な充填の注意深い調整が均一なスポットを確保するために必要とされます。我々が使用されるポリマーの一部として、細菌とのインキュベーションは不可欠だった前に、各スライドの背景蛍光データを取って、自家蛍光の程度を示しました。変動を考慮して、マイクロアレイの堅牢なデータ複製を取得することをお勧めします。 ここで用いた染色（DAPI）は、DNAに非特異的に結合し、細菌種のための選択性を有していません。汚染物質が見過ごさ得るような細菌培養物はinterpreを混乱、導入されたらそのため、良好な無菌技術が不可欠です結果のテーション。同じことは、ロッドと球菌を区別なく、属または種ではないことだけが可能である走査電子顕微鏡を使用して、後の実験の真のです。 マイクロアレイスクリーニングした後、有望なポリマーは、さらなる検証のために選択されるべきです。ここに示す例では、関心の7ポリマーは、マイクロアレイ上の蛍光におけるそれらの明確な減少によって同定し、付着の阻害は、より大きな表面上に塗布することにより確認した。4および図 5は、カバーガラス上で達成結合の減少を示しますバルクコーティングとしてではなく、マイクロアレイスポットとしてポリマーの動作をテストするための実用的な手段。続いて、これらのポリマーは完全に細菌付着の減少を定量するために、医療デバイス上にコーティングしました。保持しながら、これらのコーティング研究のための溶媒として選択したが（プロトコルセクション8を参照）（ここでは、カテーテル）所望の基板に良性であることが重要ですコーティングを可能にするために、目的のポリマーを溶解する能力がる。ここでは、低沸点を有し、均一なコーティングを残すために迅速に蒸発し、ならびに記載の特性、アセトンを使用しました。 選択された検証手段が検討されている特定の用途に依存します。電子および蛍光顕微鏡による細胞の観察は、個々の細胞付着の直接の定量化を可能にするように、我々はバルク染色マイクロアレイアッセイを補完するものとして、これらの技術を選択しました。結果は、無料の検証方法の重要性を実証する図6及び図7に示されています。 SEMは、ここに滑らかで均一であるポリマーの表面の評価を可能にする追加の利点を有している図6の共焦点画像は、個々の細胞の非常に鮮明な画像を提供します。これらの方法を使用する顕微鏡の視野によって制限され、従ってそれはimportaあるれていますNTは、結果の信頼性を持っている一連のスナップショットを取ります。上述の方法は、小領域の数からカバレッジを推論する、全面細菌の付着を定量することができません。我々は、これが記述されたアプリケーションのために十分であると考えています。細菌の結合の減少は、他の場所22に記載の方法を用いて、全体の被覆及び非被覆カテーテル片の表面付着した細菌を列挙することによって評価することができました。しかし、そのような方法は、アッセイは、多くの場合、複雑な形状を有する医療機器で実行されるときに維持することが困難であり、均一な表面積を有するようにスクリーニングされ、生体材料の表面を必要とします。 明らかに、臨床使用のために意図された任意のデバイスは、ヒトにおける安全性と有効性を確保するために、かなりのさらなるテストを通過する必要があります。ここで紹介する方法は、このプロセスの開始を表し、更なる作業は、 インビボ活性の確認を含める必要があります。この場合、静脈Cを勉強atheters、最初の作業は、血液成分およびポリマーへの全細胞の結合を調べることができます。細菌の結合の血液成分の効果は、おそらく不活性化血清または脱fibrinated血液23の存在下での結合アッセイを繰り返すことにより、考慮されるべきです。技術の決定的なテストは、皮下インプラント感染モデル24としてin vivoモデルになります。 我々は、表面改変ポリマーのスクリーニングのための高分子マイクロアレイ法の可能性を示します。このようなポリマーは、（両方の抵抗と結合細菌を促進する）この方法を意味する研究の多くの分野で有用である可能性がある、医学、食品産業とバイオテクノロジーのアプリケーションを多数持っています。仕事はここに細菌を使用するが、この方法は、他の細胞型と同様に、他の化学マイクロアレイに適合させることができます。

<html>ポリマーマイクロアレイは、最大7,000のポリマー1は、原核細胞または真核細胞2との平行分析のためにガラススライド上に印刷されたハイスループットプラットフォームを小型化しています。ここで紹介する方法は、我々が最初に2010年3で説明したものに基づいています。このスクリーニング系は、ヒト肝細胞4、幹細胞5、尿細管上皮細胞2、細菌3,6および原虫病原体7を含む多数の細胞型に適用されています。それぞれの場合において、促進または研究中の細胞の結合レジストポリマーは、8を同定しました。合成ポリカチオン性ポリマーとDNAの複合体はまた、遺伝子トランスフェクション候補9のハイスループットスクリーニングのためのマイクロアレイフォーマットで使用されてきました。同様に、細胞-基質相互作用のスクリーニングとして、ポリマーマイクロアレイはまた、材料特性10を評価するために使用されてきました。 &quot;&gt;表面への細菌の付着を調節する合成ポリマーの能力は十分3,6,11に確立されている。ポリマー表面の電荷、疎水性及び表面粗さを含む多数の因子が、細菌の結合に影響を与えることが知られている。生体材料を発見する従来のアプローチそれは順番に細菌の結合または経験的に設計し、一度に一つの材料をテストレジスト労働集約、コストと時間のかかるプロセスである。高分子マイクロアレイはそのような制限を回避するための魅力的な代替を提供しています。 表面に関連する細菌は、複雑な集団として成長するバイオフィルムと呼ばれる - このようなバイオフィルムは、多くの環境ストレスと抗生物質に耐性が高いです。これは、バイオフィルム13で堅牢な「persistor」細胞の存在の増加に起因する（タンパク質、多糖類および核酸から成る）、それらの密な細胞外マトリックス12に部分的には一部です。 Altho16 -うわ表面会合およびその後のバイオフィルム形成の正確な機構を特徴づけることが困難である、一般的に表面成長14の三つの異なる段階があると考えられています。最初、可逆付着、細胞の強い接着が続き、細胞外タンパク質の産生および多糖マトリックス及び細胞増殖によるバイオフィルムの確立。最後に、成熟したバイオフィルムのリリースでは、他の場所で新たな感染を開始することができる浮遊細胞を、自由生活します。細菌の初期付着を防止し、ひいてはバイオフィルム形成の初期段階を防ぐ細菌忌避ポリマー、潜在的に感染を最小限に抑えるための優れたソリューションを表します。抗生物質耐性の上昇（および表面結合細菌12の本質的に高い抵抗）が与えられると、感染を減少させる抗生物質を含まない手段は特に重要です。病院において、細菌撥ポリマーコーティングは、一般的に植え込まれたデバイス17の周囲に形成院内感染の低減に直接的な医療用途を持つことができます。 ここでは、ヒット確認およびその後のコーティングおよび中心静脈カテーテルの材料の分析、続い院内感染に関連する病原性細菌の範囲に対する忌避活性についての381のポリマーのスクリーニングのためのハイスループット法は、（ 図1）に記載されています。簡潔には、ポリマーは、乾燥及び滅菌後、小型化アレイは、臨床的に重要な細菌培養物と共にインキュベートした、接触印刷により、アガロースでコーティングされたガラススライド上にスポットしました。インキュベーションの後、マイクロアレイを穏やかに洗浄し、付着した細菌細胞を染色し、蛍光により可視化しました。その後、結合細菌阻害ポリマーは、ガラスカバースリップ上に塗布することにより大規模に調査し、電子顕微鏡で可視化しました。選択した反発貸与ポリマーは、その後の商業カテーテル上にコーティングし、約100倍の細菌の付着を低減することが示されました。

<table><tbody><tr><td>アガロース</td><td>シグマ</td><td>05066&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>シラン調製スライド</td><td>Sigma</td><td>S4651</td><td></td></tr><tr><td>ポリマー</td><td>社内合成</td><td>該当なし</td><td></td></tr><tr><td>NMP</td><td>Sigma</td><td>494496</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>Oxoid</td><td>CM1018</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>テトラヒドロフラン</td><td>Σ</td><td>401757</td><td></td></tr><tr><td>(3-アミノプロピル) トリエトキシシランコーティングガラススライド</td><td>シ</td><td>ラン調製</td><td></td></tr><tr><td>カコジル酸緩衝液</td><td>シグマ</td><td>97068</td><td></td></tr><tr><td>カテーテル 1</td><td>アロー インターナショナル</td><td>CS12123E</td><td></td></tr><tr><td>カテーテル 2</td><td>バクスター ヘルスケア</td><td>ECS1320</td><td></td></tr><tr><td>四酸化オスミウム</td><td>シグマ</td><td>201030</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>コンタクトプリンター</td><td>Genetix</td><td>Qarraymini</td><td></td></tr><tr><td>マイクロアレイ顕微鏡</td><td>IMSTAR</td><td>パスファインダー</td><td></td></tr><tr><td>スピンコーター</td><td>Speedline Technologies</td><td>6708D</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>SP5</td><td></td></tr><tr><td>画像解析ソフトウェア</td><td>Media Cybernetics</td><td>Image-Pro Plus</td><td></td></tr><tr><td>走査型電子顕微鏡</td><td>フィリップス</td><td>XL30CP</td><td></td></tr><tr><td>スパッタコーター</td><td>バルテック</td><td>SCD050</td><td></td></tr></tbody></table>

医療機器のための細菌撥ポリマーのハイスループット同定

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

医療機器は、しばしば院内感染と関連付けられ、患者や医療システムに多大な負担をかけるだけでなく、抗菌薬耐性にも寄与します。デバイス関連の感染を減らすための1つの可能な方法は、これらのデバイス用の細菌忌避ポリマーコーティングの特定であり、これにより、最初の付着ステップで細菌の結合を防ぐことができます。ここでは、マイクロアレイを用いた数百のポリマーの並列スクリーニングに基づく、このような撥水性ポリマーの同定方法について説明する。このハイスループット法により、臨床的に重要なさまざまな細菌種を個別に、また多種群集として結合することに抵抗する、さまざまな有望なポリマーが同定されました。1つのポリマーであるPA13(ポリ(メチルメタクリレート-co-ジメチルアクリルアミド))は、2つの市販の中心静脈カテーテルにコーティングすると、多くの病院分離株の付着が有意に減少することを示しました。記載されている方法は、細菌の付着修飾が重要な広範囲のアプリケーションのためのポリマーを同定するために適用することができます。

図2は、マイクロアレイ解析によって決定されるポリマーの数に対する細菌付着（正規化された蛍光強度）を示しています。アガロースが強く6を結合細菌をレジストとしてポリマー（のみNMP）なしで印刷されたスポットは、陰性対照である-記録された蛍光は非常に低いです。ほとんどの場合、ポリマーの撥水特性を試験細菌種間で大きく異なるが表示されたポリマーは、すべての低結合されています。これは、異なる種間の取付機構との間に広いの違いを反映しています。適切なポリマーの選択は、したがって、用途に依存するが、低結合性ポリマーは、容易にアガロースと比較することによって同定されます。高結合性ポリマーは、配列中で同定される可能性があり、その後の実験のためのポジティブコントロールとして使用することができます。 DAPIチャネルにおける自己蛍光を示さないポリマーについては、定性的な共同（ 図3に示すように、1つの代表的な高結合性ポリマー三実施例の低結合性ポリマーをハイライト）スポット像のmparisonを目視することができます。このような比較は、統計的分析よりも少ない情報を提供しながら、計算された強度値の有用な視覚的検証することができます。 22適切なポリマーは、マイクロアレイを用いて同定して、スケールアップ実験を、より大きい表面を被覆するために使用される場合、それらの細菌撥性を確認するために行われます。 （SEMによって分析した（ 図4、図 5））コートガラスカバースリップとカテーテルスライス（共焦点顕微鏡（ 図6）とSEMによって分析した（ 図7））に使用される最高の実行例は、示されています。両方の顕微鏡法は、明確なデータを提供し、表面に直接細胞計数を可能にするという利点を有します。細胞付着の減少はvisibl簡単です電子。これらの最高のスケールアップに自分の忌避特性を保持し、コーティング、ならびに大規模コーティング技術に適しているが、さらに調査しました。示された結果は、各段から最高の実行ポリマーを示しています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54382/54382fig1.jpg" /> 図1： 生物医学的用途のためのポリマーマイクロアレイを介して細菌忌避剤ポリマーの識別に必要な手順 SEM =走査電子顕微鏡。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54382/54382fig2.jpg" /> 図2： マイクロアレイ解析によって決定一連のポリマーに結合細菌は、低細菌の結合はポリアクリレート/アクリルアミド（PA）及びポリウレタン（PU）の数に見られています。いくつかの細菌のでプローブした高分子マイクロアレイからの結果<html> pecies（C。ジェジュニ 、C。ディフィシル 、 ウェルシュ菌 、 ストレプトコッカス・ミュータンス 、および2つのコンソーシアム; BacMix-1およびBacMix-2）が示されています。背景は、平均DAPI蛍光強度（正規化）を補正し、細菌が発現バインディング。エラーバーは標準偏差を表します。参照6から適応。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54382/54382fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54382/54382fig3.jpg" /> 図 3：代表的なポリマー上の細菌の付着を示すBacMix-2のポリマースポットの例の画像蛍光（DAPI）および明視野顕微鏡画像。強く結合ポリマーは、いくつかの非結合ポリマー（PU-20、PA-336及びPU-179）と比較するために含まれています。スケールバー=100μmです。参照6から適応。：//www.jove.com/files/ftp_upload/54382/54382fig3large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54382/54382fig4.jpg" /> 図4： ガラスカバースリップとスケールアップ実験 「ヒット」ポリマー（ 表1から選択された例）でコーティングされたコーティングされていないガラスとガラス上の細菌の付着を示すSEM画像。スケールバー=20μmです。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54382/54382fig5.jpg" /> 図5：SEM 画像から細胞数によって定量化した結合細菌最高の「ヒット」ポリマーで被覆された表面の単位面積あたりに付着した細胞との比較。アガロースは対照結合表面としてのガラスで、コントロールの非結合」面として使用しました。エラーバーは、表現します標準偏差。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/54382/54382fig6.jpg" /> 図6： 被覆及び非被覆カテーテルスライス上の細菌結合の比較 BacMix-2でインキュベーションした後のPA13（B）でコーティングされた未処理のカテーテル（カテーテル検査-1）（A）およびカテーテルを比較する共焦点像。対物レンズ40倍（スケールバー=20μm）を用いて撮影した画像。参照6から適応。 <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/54382/54382fig7.jpg" /> 図7： 被覆及び非被覆カテーテルスライス上の細菌結合の比較 SEM像はBacMix-2からなる細菌カクテルとのインキュベーション後にPA13（B）でコーティングされた未処理のカテーテル（カテーテル検査-1）（A）とカテーテルの比較を示す尺度。バー= 101;メートル。参照6から適応。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> ポリマー </td><td> モノマー1 </td><td> モノマー2 </td><td> モノマー3 </td><td colspan="3"> モノマーの比率 </td></tr><tr><td> PA465 </td><td> MEMA </td><td> DEAEMA </td><td> HEA </td><td> 8 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> PA475 </td><td> MEMA </td><td> DEAEA </td><td> HEMA </td><td> 6 </td><td> 1 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> PA513 </td><td> MEMA </td><td> DEAEMA </td><td> MMA </td><td> 8 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> PA515 </td><td> MEMA </td><td> DEAEA </td><td> MMA </td><td> 6 </td><td> 1 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> PA13 </td><tD&gt; MMA </td><td> DMAA </td><td> - </td><td> 9 </td><td> 1 </td><td> - </td></tr><tr><td> PU1 </td><td> PEG2000 </td><td> HDI </td><td> - </td><td> 4.9 </td><td> 5.2 </td><td> - </td></tr><tr><td> PU16 </td><td> PEG2000 </td><td> MDI </td><td> - </td><td> 4.9 </td><td> 5.2 </td><td> - </td></tr><tr><td> PU161 </td><td> PEG2000 </td><td> MDI </td><td> BD </td><td> 2.5 </td><td> 5.2 </td><td> 2.3 </td></tr><tr><td> PU7 </td><td> PEG900 </td><td>ビック</td><td> - </td><td> 4.9 </td><td> 5.2 </td><td> - </td></tr><tr><td> PU83 </td><td> PEG900 </td><td> HMDI </td><td> BD </td><td> 2.5 </td><td> 5.2 </td><td> 2.3 </td></tr><tr><td> PU227 </td><td> PPG-PEG-1900 </td><td> HDI </td><td> - </td><td> 4.9 </td><td> 5.2 </td><td> - </td></tr><tr><td> PU129</td><td> PPG425 </td><td>ビック</td><td> DMAPD </td><td> 2.5 </td><td> 5.2 </td><td> 2.3 </td></tr><tr><td> PU10 </td><td> PTMG2000 </td><td>ビック</td><td> - </td><td> 4.9 </td><td> 5.2 </td><td> - </td></tr><tr><td> PU179 </td><td> PTMG2000 </td><td> HDI </td><td> NMAPD </td><td> 2.5 </td><td> 5.2 </td><td> 2.3 </td></tr><tr><td> PU20 </td><td> PTMG2000 </td><td> MDI </td><td> - </td><td> 4.9 </td><td> 5.2 </td><td> - </td></tr><tr><td> PU5 </td><td> PTMG2000 </td><td> HDI </td><td> - </td><td> 4.9 </td><td> 5.2 </td><td> - </td></tr></tbody></table> 表1： 細菌の組成非結合図2の「ヒット」ポリマー。

医療機器上の細菌表面結合を減少させるポリマーの同定のためのハイスループットマイクロアレイ法が説明されています。

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

このポリマーマイクロアレイ技術の全体的な目的は、非生物的な表面への細菌の付着を調節できる合成ポリマーを同定することです。本手法は、医療機器への細菌付着を抑制する、簡便で費用対効果の高いバイオマテリアルの発見を加速させるのに役立ちます。一度に1つの材料を試験する従来のバイオマテリアル研究と比較した本技術の主な利点は、単一のアセットで数百種類のポリマーを同時にスクリーニングできる点にあります。まず、テキストプロトコルに従ってポリマー溶液を調製し、384ウェルプレートのウェルに分注します。48行32列に配置された1536個のスポットからなる、ポリマーを4連（quadruplicate）でプリントするためのルーチンを作成します。ピンの洗浄を行うため、プリンターをセクションごとに停止できるよう、一度に32種類のポリマー溶液をプリントするように設定します。次に、アガロースコートスライドをプラットフォームに設置し、スライドを固定するために真空シールが適切に機能していることを確認します。すべてのピンが同じ高さになるようにプリントヘッドを調整するため、手動でヘッドをガラススライドの上に下ろし、すべてのピンが同時に上昇することを確認します。ウェルプレートをプレートホルダーに設置し、ウェルA1がホルダーの右上にくるようにして、プレートがしっかりと固定されていることを確認してください。指示が表示されたら、スライドとウェルプレートが正しい位置にあることを確認します。セクションごとに1回ずつプリントし、セクション間にピンの洗浄時間を設けます。次に、アセトンに浸したペーパータオルを使用して、ピンを徹底的に洗浄します。その後、乾いたティッシュペーパーで拭き、ピンが完全に乾燥していることを確認します。マイクロアレイのプリントが完了したら、スライドホルダーにセットし、40 °Cに設定した真空乾燥機に移して、ポリマースポット内のN&amp;Pを除去します。次に、UVライトを用いてプレートを30分間滅菌します。スライドに細菌を接種する前に、テキストプロトコルに従って背景蛍光の測定を行ってください。テキストプロトコルに従って、マイクロアレイ用の培養および接種液の調製を行った後、UV滅菌済みのポリマーマイクロアレイを4ウェル長方形プレートに配置し、混合細菌培養液6 mLを添加します。プレートを37 °Cで、緩やかに振盪しながら5日間インキュベートします。インキュベーション後、PBSを用いてマイクロアレイを2回優しくすすぎます。次に、PBSで調製した1 µg/mLのDAPIを加え、30分間インキュベートします。続いて、マイクロアレイを新しい4ウェルプレートに移し、PBSで覆い、静かに旋回させます。その後、PBSを一度交換し、洗浄を繰り返します。洗浄後、空気の流れでマイクロアレイを乾燥させ、シーリングフィルムを適用し、マイクロアレイのスライドにガラスカバースリップを貼り付けます。接着剤が乾いた後、70% ethanolを用いて外表面を滅菌します。20倍の対物レンズを装着した蛍光顕微鏡を使用し、各ポリマースポットの明視野およびストリピーチャネルの単一画像をキャプチャします。カバーガラスをポリマーでコーティングするには、テトラヒドロフランまたはその他の適切な溶媒を用いてHITポリマー溶液を調製します。スピンコーターを使用し、適切なサイズの円形ガラスカバーガラスにポリマー溶液を2000 RPMで10秒間スピンコートします。コーティングしたカバーガラスをコンベクションオーブンで40 degrees celsiusにて一晩乾燥させます。また、細菌を接種する前に、UVライトを用いてカバースリップを30分間滅菌します。UV滅菌したカバースリップを標準的な12ウェルまたは24ウェルプレートに配置し、本ビデオの前半で示した方法で細菌と共にインキュベートします。インキュベート後、0.1 M cacodylate緩衝液を用いてコーティングしたカバースリップを2回洗浄し、その後2.5% (w/v) glutaraldehydeおよび0.1 M cacodylate緩衝液を用いて、サンプルを2時間固定します。カバースリップを1%オスミウムテトラキシドで室温にて1時間後固定します。その後、各濃度のエタノール系列で30分ずつ脱水処理を行います。次に、スパッタコーターを用い、金と白金が60:40の割合の合金混合物を使用して、電流30 milliamps、真空度0.75 torrの条件で試料をコーティングします。SEMで画像を撮影した後、コーティングしていないカバーガラスと、アガロースまたはHITポリマーでコーティングしたカバーガラスの画像を視覚的に比較し、ポリマーの細菌結合能または忌避能を確認します。カテーテルの末端ウェリング部分との適合性と、HITポリマーの溶解能を評価するため、カテーテル片を各種溶媒に浸漬し、12時間インキュベートした後、カテーテルの完全性と溶媒の透明度を視覚的に評価します。SEMを用いてカテーテル上の細菌付着を解析するために、アセトンで10%ポリマー溶液を調製します。200 µLのマイクロピペットチップをカットしたカテーテル片の中央部に押し込んで固定し、ポリマー溶液に約30秒間浸します。コーティングした断片を室温で30分間乾燥させた後、再びカテーテル片をポリマー溶液に浸して2回目のコーティングを行い、室温で一晩乾燥させます。テキストのプロトコルに従い、コーティング済みおよび未コーティングのカテーテル片を接種済みのLBでインキュベートした後、1 mLのPBSを用いてカテーテルを洗浄します。次に、PBSで調製した10%パラホルムアルデヒドを用いて、細菌を30分間固定します。PBSで洗浄した後、DAPIを用いてカテーテル片上の細菌を20分間染色します。その後、1 mLのPBSで洗浄します。チャンバー内のサンプルの配置を確認します。以下の設定を用いて、カテーテル片の共焦点画像を取得します。カテーテルの100 µmの長さにわたって50枚の画像をzスタック撮影し、共焦点イメージングを完了させます。UV処理および細菌とのインキュベーション後、1 mLのPBSを用いて2回洗浄し、PBSで調製した10%ホルムアルデヒドを含む48ウェルプレートに30分間移して固定します。サンプルの固定後、再びPBSで洗浄し、室温で一晩乾燥させます。その後、導電性カーボンディスクを用いてスタブにマウントし、スパッタコーターを用いて金コーティングを行います。走査電子顕微鏡を用いたイメージング前の状態。この図は、マイクロアレイ解析によって決定された、いくつかのポリマーに対する細菌の付着を示している。ポリマーをプリントせずにスポットしたものは陰性対照として機能する。これは、アガロースが細菌の結合を強く阻害するため、蛍光強度が非常に低くなるからである。提示されたポリマーは合金結合性ですが、ほとんどの場合、ポリマーの忌避特性はテストした細菌種によって大きく異なります。これは、種によって付着メカニズムに大きな違いがあることを反映しています。低結合性ポリマーは、アガロースと比較することで容易に特定できます。結合能の高いポリマーをアレイ内で特定でき、それらを後続の実験のポジティブコントロールとして使用することが可能です。DAPIチャンネルで自己蛍光を示さないポリマーについては、スポット画像の定性的な比較を視覚的に行うことができます。特定された適切な22種類のポリマーについて、その細菌 repellent 特性を確認するため、より広い表面へのコーティングをテストするスケールアップ実験が行われました。ここでは、SEMで分析した、ガラスカバースリップのコーティングに使用した最も性能の高いサンプルを示します。これらの図は、共焦点顕微鏡およびSEMによって分析されたカテーテル切片を示しています。どちらの顕微鏡法も、表面上の細胞数を直接カウントできるという利点があり、細胞接着の減少が容易に視認できるため、明確なデータを得ることができます。この手順に従い、血清や血液成分を試験して、細菌結合への影響を判定することができます。また、ポリマーコーティングの臨床応用の可能性を評価するために、動物モデルを用いることができます。化学物質や病原性生物を取り扱う際は、危険が伴うことに留意してください。また、個人および環境へのリスクを軽減するため、取り扱いおよび廃棄の際には必要な管理措置を講じる必要があります。

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