医療機器のための細菌撥ポリマーのハイスループット同定

このポリマーマイクロアレイ技術の全体的な目的は、非生物的な表面への細菌の付着を調節できる合成ポリマーを同定することです。本手法は、医療機器への細菌付着を抑制する、簡便で費用対効果の高いバイオマテリアルの発見を加速させるのに役立ちます。一度に1つの材料を試験する従来のバイオマテリアル研究と比較した本技術の主な利点は、単一のアセットで数百種類のポリマーを同時にスクリーニングできる点にあります。

まず、テキストプロトコルに従ってポリマー溶液を調製し、384ウェルプレートのウェルに分注します。48行32列に配置された1536個のスポットからなる、ポリマーを4連（quadruplicate）でプリントするためのルーチンを作成します。ピンの洗浄を行うため、プリンターをセクションごとに停止できるよう、一度に32種類のポリマー溶液をプリントするように設定します。次に、アガロースコートスライドをプラットフォームに設置し、スライドを固定するために真空シールが適切に機能していることを確認します。

すべてのピンが同じ高さになるようにプリントヘッドを調整するため、手動でヘッドをガラススライドの上に下ろし、すべてのピンが同時に上昇することを確認します。ウェルプレートをプレートホルダーに設置し、ウェルA1がホルダーの右上にくるようにして、プレートがしっかりと固定されていることを確認してください。指示が表示されたら、スライドとウェルプレートが正しい位置にあることを確認します。

セクションごとに1回ずつプリントし、セクション間にピンの洗浄時間を設けます。次に、アセトンに浸したペーパータオルを使用して、ピンを徹底的に洗浄します。その後、乾いたティッシュペーパーで拭き、ピンが完全に乾燥していることを確認します。

マイクロアレイのプリントが完了したら、スライドホルダーにセットし、40 °Cに設定した真空乾燥機に移して、ポリマースポット内のN&Pを除去します。次に、UVライトを用いてプレートを30分間滅菌します。スライドに細菌を接種する前に、テキストプロトコルに従って背景蛍光の測定を行ってください。

テキストプロトコルに従って、マイクロアレイ用の培養および接種液の調製を行った後、UV滅菌済みのポリマーマイクロアレイを4ウェル長方形プレートに配置し、混合細菌培養液6 mLを添加します。プレートを37 °Cで、緩やかに振盪しながら5日間インキュベートします。インキュベーション後、PBSを用いてマイクロアレイを2回優しくすすぎます。

次に、PBSで調製した1 µg/mLのDAPIを加え、30分間インキュベートします。続いて、マイクロアレイを新しい4ウェルプレートに移し、PBSで覆い、静かに旋回させます。その後、PBSを一度交換し、洗浄を繰り返します。

洗浄後、空気の流れでマイクロアレイを乾燥させ、シーリングフィルムを適用し、マイクロアレイのスライドにガラスカバースリップを貼り付けます。接着剤が乾いた後、70% ethanolを用いて外表面を滅菌します。20倍の対物レンズを装着した蛍光顕微鏡を使用し、各ポリマースポットの明視野およびストリピーチャネルの単一画像をキャプチャします。

カバーガラスをポリマーでコーティングするには、テトラヒドロフランまたはその他の適切な溶媒を用いてHITポリマー溶液を調製します。スピンコーターを使用し、適切なサイズの円形ガラスカバーガラスにポリマー溶液を2000 RPMで10秒間スピンコートします。コーティングしたカバーガラスをコンベクションオーブンで40 degrees celsiusにて一晩乾燥させます。

また、細菌を接種する前に、UVライトを用いてカバースリップを30分間滅菌します。UV滅菌したカバースリップを標準的な12ウェルまたは24ウェルプレートに配置し、本ビデオの前半で示した方法で細菌と共にインキュベートします。インキュベート後、0.1 M cacodylate緩衝液を用いてコーティングしたカバースリップを2回洗浄し、その後2.5% (w/v) glutaraldehydeおよび0.1 M cacodylate緩衝液を用いて、サンプルを2時間固定します。

カバースリップを1%オスミウムテトラキシドで室温にて1時間後固定します。その後、各濃度のエタノール系列で30分ずつ脱水処理を行います。次に、スパッタコーターを用い、金と白金が60:40の割合の合金混合物を使用して、電流30 milliamps、真空度0.75 torrの条件で試料をコーティングします。

SEMで画像を撮影した後、コーティングしていないカバーガラスと、アガロースまたはHITポリマーでコーティングしたカバーガラスの画像を視覚的に比較し、ポリマーの細菌結合能または忌避能を確認します。カテーテルの末端ウェリング部分との適合性と、HITポリマーの溶解能を評価するため、カテーテル片を各種溶媒に浸漬し、12時間インキュベートした後、カテーテルの完全性と溶媒の透明度を視覚的に評価します。SEMを用いてカテーテル上の細菌付着を解析するために、アセトンで10%ポリマー溶液を調製します。

200 µLのマイクロピペットチップをカットしたカテーテル片の中央部に押し込んで固定し、ポリマー溶液に約30秒間浸します。コーティングした断片を室温で30分間乾燥させた後、再びカテーテル片をポリマー溶液に浸して2回目のコーティングを行い、室温で一晩乾燥させます。テキストのプロトコルに従い、コーティング済みおよび未コーティングのカテーテル片を接種済みのLBでインキュベートした後、1 mLのPBSを用いてカテーテルを洗浄します。

次に、PBSで調製した10%パラホルムアルデヒドを用いて、細菌を30分間固定します。PBSで洗浄した後、DAPIを用いてカテーテル片上の細菌を20分間染色します。その後、1 mLのPBSで洗浄します。

チャンバー内のサンプルの配置を確認します。以下の設定を用いて、カテーテル片の共焦点画像を取得します。カテーテルの100 µmの長さにわたって50枚の画像をzスタック撮影し、共焦点イメージングを完了させます。

UV処理および細菌とのインキュベーション後、1 mLのPBSを用いて2回洗浄し、PBSで調製した10%ホルムアルデヒドを含む48ウェルプレートに30分間移して固定します。サンプルの固定後、再びPBSで洗浄し、室温で一晩乾燥させます。その後、導電性カーボンディスクを用いてスタブにマウントし、スパッタコーターを用いて金コーティングを行います。

走査電子顕微鏡を用いたイメージング前の状態。この図は、マイクロアレイ解析によって決定された、いくつかのポリマーに対する細菌の付着を示している。ポリマーをプリントせずにスポットしたものは陰性対照として機能する。これは、アガロースが細菌の結合を強く阻害するため、蛍光強度が非常に低くなるからである。

提示されたポリマーは合金結合性ですが、ほとんどの場合、ポリマーの忌避特性はテストした細菌種によって大きく異なります。これは、種によって付着メカニズムに大きな違いがあることを反映しています。低結合性ポリマーは、アガロースと比較することで容易に特定できます。

結合能の高いポリマーをアレイ内で特定でき、それらを後続の実験のポジティブコントロールとして使用することが可能です。DAPIチャンネルで自己蛍光を示さないポリマーについては、スポット画像の定性的な比較を視覚的に行うことができます。特定された適切な22種類のポリマーについて、その細菌 repellent 特性を確認するため、より広い表面へのコーティングをテストするスケールアップ実験が行われました。

ここでは、SEMで分析した、ガラスカバースリップのコーティングに使用した最も性能の高いサンプルを示します。これらの図は、共焦点顕微鏡およびSEMによって分析されたカテーテル切片を示しています。どちらの顕微鏡法も、表面上の細胞数を直接カウントできるという利点があり、細胞接着の減少が容易に視認できるため、明確なデータを得ることができます。

この手順に従い、血清や血液成分を試験して、細菌結合への影響を判定することができます。また、ポリマーコーティングの臨床応用の可能性を評価するために、動物モデルを用いることができます。化学物質や病原性生物を取り扱う際は、危険が伴うことに留意してください。

また、個人および環境へのリスクを軽減するため、取り扱いおよび廃棄の際には必要な管理措置を講じる必要があります。