医療機器のための細菌撥ポリマーのハイスループット同定

このポリマーマイクロアレイ技術の全体的な目標は、非生物的表面への細菌の付着を調節できる合成ポリマーを特定することです。この方法は、医療機器への細菌の付着を抑制するシンプルで費用対効果の高い生体材料の発見の進歩を加速させるのに役立ちます。この手法は、一度に1つの材料を試験する従来の生体材料研究と比較した場合の主な利点は、1つの資産で数百のポリマーを同時にスクリーニングできることです。

まず、ポリマー溶液を調製し、テキストプロトコルに従って384ウェルプレートのウェルに加えます。1536個のスポットからなる4重のポリマーを48行32列で印刷し、一度に32個のポリマー溶液を印刷するルーチンを作成し、各セクションを印刷した後にプリンターを停止してピンのクリーニングを可能にするようにします。次に、アガロースコーティングされたスライドをプラットフォームに置き、スライドを所定の位置に保持するための良好な真空シールを確保します。

すべてのピンが同じ高さになるようにプリントヘッドを調整するには、手動でヘッドをスライドガラスの上に下げ、ピンが同時に上に移動することを確認します。ウェルプレートをプレートホルダーに置き、ウェルA1をホルダーの右上に置き、ウェルプレートがしっかりと固定されていることを確認します。プロンプトが表示されたら、スライドプレートとウェルプレートが所定の位置にあることを確認します。

一度に 1 つのセクションを印刷し、セクション間のピンをクリーニングできます。次に、アセトンに浸したペーパータオルを使用して、ピンを完全に清掃します。続いて、ピンが完全に乾いていることを確認するために、ティッシュペーパーを乾かします。

マイクロアレイが完全にプリントされたら、スライドホルダーに入れ、40°Cに設定した真空オーブンに移して乾燥させ、ポリマースポットのN&Pを除去します。次に、UVライトを使用してプレートを30分間滅菌します。スライドにバクテリアを接種する前に、テキストプロトコルに従ってバックグラウンド蛍光を測定してください。

マイクロアレイ用の接種物を培養し、調製した後、テキストプロトコルに従って、UV滅菌したポリマーマイクロアレイを長方形の4ウェルプレートに入れ、6ミリリットルの混合細菌培養物を加えます。プレートを摂氏37度で穏やかに攪拌しながら5日間インキュベートします。インキュベーション後、PBSを使用してマイクロアレイを2回穏やかにすすぎます。

次に、PBS中のDAPI1ミリリットルあたり1マイクログラムを加え、30分間インキュベートします。次に、マイクロアレイを新しい4ウェルプレートに移し、マイクロアレイをPBSで覆い、ゆっくりと渦巻きます。その後、PBSを一度交換し、洗濯を繰り返します。

すすぎ後、マイクロアレイを空気の流れで乾燥させた後、シールフィルムを貼り、ガラスカバースリップをマイクロアレイスライドに貼り付けます。接着剤が乾いたら、70%エタノールを使用して外面を滅菌します。20倍の主観を取り付けた蛍光顕微鏡を使用して、明視野およびストラップチャネルの各ポリマースポットの単一の画像をキャプチャします。

カバースリップをポリマーでコーティングするには、テトラヒドロフランまたは別の適切な溶媒でHITポリマーの溶液を準備します。スピンコーターを使用して、スピンコートは、ポリマー溶液で適切なサイズの円形ガラスカバースリップを2000RPMで10秒間カバーします。コーティングされたカバースリップを摂氏40度の対流式オーブンで一晩乾かします。

また、UVライトを使用して、バクテリアを接種する前にカバースリップを30分間滅菌します。UV滅菌したカバースリップを標準の12ウェルプレートまたは24ウェルプレートにセットし、このビデオで前述したようにバクテリアとインキュベートします。インキュベーション後、0.1モルのカコジル酸緩衝液を使用してコーティングされたカバースリップを2回洗浄し、次に1体積あたり2.5%の重量のグルタルアルデヒドと0.1モルのカコジル酸緩衝液でサンプルを2時間固定します。

カバースリップを1%四酸化オスミウムで室温で1時間ポストフィックスします。それらをエタノールシリーズで各濃度で30分間脱水する前に。次に、スパッタコーターと60〜40%の金とプラチナ合金の混合物を使用して、30ミリアンペアの電流と0.75トルの真空を使用してサンプルをコーティングします。

SEMで画像を撮影した後、コーティングされていないカバースリップとアガロースまたはHITポリマーでコーティングされたカバースリップの画像を視覚的に比較し、ポリマーの細菌吸着または反発能力を確認します。カテーテルの末端ウェル部分との適合性、およびHITポリマーを溶解する能力についてさまざまな溶媒を評価するには、カテーテル片を溶媒に浸し、12時間インキュベートしてから、カテーテルの完全性と溶媒の透明度を視覚的に評価します。カテーテルへの細菌付着をSEMで解析するには、アセトン中に10%ポリマー溶液を調製します。

200マイクロリットルのマイクロピペットチップをカテーテルの切断部分の中央部に押し込んで保持し、ポリマー溶液に約30秒間貼り付けます。コーティングされたピースを周囲条件で30分間乾燥させた後、カテーテルピースをポリマー溶液に再度浸して2番目のコーティングを塗布し、周囲条件下で一晩乾燥させます。被覆および非被覆のカテーテル片を接種LBでインキュベートした後、テキストプロトコルに従って、1ミリリットルのPBSを使用してカテーテルを洗浄する。

次に、PBSに10%のパラホルムアルデヒドを使用して、細菌を30分間固定します。PBSで洗浄した後、DAPIを使用してカテーテル片の細菌を20分間染色します。1ミリリットルのPBSで洗う前に。

チャンバー内のサンプルの配置を観察します。以下の設定を使用して、カテーテルピースの共焦点画像を撮影します。カテーテルの長さ100μmにわたって50枚の画像をzスタッキングすることにより、共焦点イメージングを完成させます。

UV処理とバクテリアとのインキュベーション後、1ミリリットルのPBSを使用してピースを2回洗浄し、PBSに10%ホルムアルデヒドを含む48ウェルプレートに30分間移します。サンプルを固定した後、PBSで再度洗浄し、室温で一晩乾燥させます。次に、導電性カーボンディスクでスタブにマウントし、スパッタコーターを使用して金をコーティングします。

イメージングの前に、走査型電子顕微鏡を使用します。この図は、マイクロアレイ分析によって決定された多数のポリマーへの細菌の付着を示しています。ポリマーなしで印刷されたスポットは、アガロースが細菌の結合に強く抵抗するため、蛍光が非常に低いため、ネガティブコントロールとして機能します。

表示されているポリマーは合金結合性ですが、ほとんどの場合、ポリマーの忌避特性はテストされた細菌種間で大きく異なります。これは、異なる種間での付着メカニズム間の大きな違いを反映しています。低結合ポリマーは、アガロースとの比較で容易に同定できます。

高結合ポリマーはアレイ内で同定される可能性が高く、その後の実験のポジティブコントロールとして使用できます。DAPIチャネルで自家蛍光を示さないポリマーの場合、スポット画像の定性的な比較を視覚的に行うことができます。より大きな表面のコーティングをテストするためのスケールアップ実験が行われ、特定された22の適切なポリマーの細菌忌避特性を確認しました。

ここに示されているのは、SEMによって分析されたガラスカバースリップのコーティングに使用される最も高性能なサンプルです。これらの図は、共焦点顕微鏡とSEMで分析されたカテーテルスライスを示しています。どちらの顕微鏡法も、細胞付着の減少が容易に見えるため、表面上の直接細胞数を測定でき、明確なデータを提供できるという利点があります。

この手順に続いて、血清または血液成分を検査して、細菌の結合への影響を判断できます。動物モデルを使用して、臨床使用のためのポリマーコーティングの可能性を評価することができます。化学物質や病原性生物を扱うことは危険であることを忘れないでください。

また、取り扱いや廃棄の際には、個人的および環境的リスクを軽減するために必要な管理を実施する必要があります。