オリゴヌクレオチド指向溶出を用いて細胞から同族RNA-タンパク質複合体の単離

このRNA免疫沈降技術の全体的な目標は、特定のオリゴヌクレオチド指向性濃縮を介して真核細胞で形成される内因性RNAタンパク質複合体を選択的に単離し、特性評価することです。この方法は、レトロウイルス転写産物の遺伝子発現を調節するための5つの主要なUTRを定義するRNA結合タンパク質の組成など、転写後制御分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、研究者が目的の特定のRNAタンパク質複合体を選択的に分離して特性評価すると同時に、下流のRNPのよりグローバルな分析を行う可能性を維持できることです。

この手法の意味するところは、ウイルス感染や多数の細胞疾患の基本的な理解にまで及びます。また、遺伝子発現の転写後制御のメカニズムに関する重要な洞察を提供します。それは、新たな実行可能な薬物標的を意味する可能性があります。

細胞を培養し、テキストプロトコルに従ってFLAGタグ付きタンパク質の免疫沈降を行った後、pro-TG磁気ビーズスラリーのIPあたり60マイクロリットルを1.7ミリリットルの微量遠心チューブに移します。チューブを磁気ラックに置き、慎重にピペッティングして保存溶液を取り出します。次に、チューブをラックから取り外します。

600マイクロリットルの1x洗浄バッファーを追加します。そして、チューブを室温で3分間ローテーターの端から端まで置き、ビーズを洗浄して平衡化します。チューブを磁気ラックに置き、ウォッシュバッファーを取り外します。

次に、10容量の新鮮な1x洗浄バッファーを加えます。免疫沈降FLAG抗体を平衡化したpro-TG磁気ビーズに添加します。次に、チューブを室温で少なくとも30分間回転させて、免疫沈降抗体を標識します。

チューブを磁石の上に置き、上清を取り除きます。次に、チューブを磁石から取り外し、ビーズに1x洗浄バッファーを加え、室温で3分間回転させます。洗浄ステップを2回繰り返し、最終的なバッファーを取り出します。

吸引して細胞から培地を取り出し、1.5ミリリットルの氷冷PBSを使用して細胞を2回洗浄します。セルスクレーパーを使用して、湿った付着細胞を取り除きます。細胞懸濁液を新しいチューブにピペットで移し、培養物を摂氏4度でGの226倍で4分間遠心分離します。

375マイクロリットルの氷冷低塩緩衝液を細胞ペレットに加え、サンプルを氷上で5分間インキュベートして膨潤させます。低塩溶解バッファーに細胞ペレットを添加および再懸濁する際には、早期の機械的混乱なしに完全な浸漬と膨潤を確実にするために注意することが重要です。細胞質細胞溶解物を採取するには、125マイクロリットルの氷冷溶解バッファーを添加し、次に事前に冷却したDounceホモジナイザーを使用して10回のストロークを行います。

放出された細胞質溶解物の原形質膜溶解および汚染物質を可能にするのに十分な力でホモジナイズします。ただし、機械的な混乱を過度に拡大し、核汚染、RNAタンパク質複合体の破壊、または放出されたホモジネートの損失のリスクを冒さないように注意してください。次に、上清を氷上にあった新しい1.7ミリリットルのチューブに移します。

総タンパク質濃度を決定します。ウェスタンブロット解析用に10%を確保し、入力コントロールとして使用します。免疫沈降を行うには、所望の量の回収細胞ライセートを標的抗体標識ビーズに添加します。

1x洗浄バッファーを使用して、総容量を最大600マイクロリットルにし、サンプルを室温で回転させます。90分間のインキュベーション後、IPチューブをマグネットラックに置き、ビーズを回収します。次に、上澄みを収集し、フロースルーとして予約します。

次に、10容量の氷冷NETN 150洗浄バッファーをRNP結合抗体標識ビーズに加え、サンプルを室温で3分間回転させます。固定化したRNP複合体をテキストプロトコルに従って1x結合バッファーに再懸濁した後、氷冷1x結合バッファーの残りの容量を100マイクロリットルに調整します。そして、チューブを摂氏70度で3分間加熱します。

同族のRNAタンパク質複合体を単離するには、目的のRNAの3つの主要な配列境界に相補的な約30ヌクレオチドDNAオリゴを追加します。そして、室温で30分間、穏やかに揺さぶってインキュベートします。チューブに5〜10ユニットまたはRNase Hを加え、サンプルを室温で1時間インキュベートして、RNA DNAハイブリッドからRNAを切断します。

次に、捕捉された目的のRNP複合体を含む上清を滅菌済みの1.7ミリリットル微量遠心チューブに移します。免疫沈降したRNAを回収するには、捕捉したRNA複合体の全サンプルの半分を750マイクロリットルの酸性チオシアン酸グアニジン試薬に再懸濁します。チューブに200マイクロリットルのクロロホルムを加え、10秒間激しく振とうし、室温で3分間インキュベートします。

遠心分離後、水相を新しいチューブに集め、等量のイソプロパノールを加えます。よく混合し、サンプルを室温で少なくとも10分間インキュベートします。1マイクロリットルのグリコールブルーをサンプルに加え、マイナス20°Cで保存して、効率的な沈殿または将来の処理を実現します。

チューブを摂氏4度でGの16, 000倍で10分間遠心分離します。P200マイクロピペットを使用して、RNAペレットを乱さないように上清を慎重に収集して廃棄します。各チューブに500マイクロリットルの75%エタノールを追加します。.

チューブをボルテックスし、5分間遠心分離します。先ほど示したように、上清を慎重に収集して廃棄します。ペレットを2〜3分間風乾し、100マイクロリットルのRNaseフリー水を使用して再懸濁します。

100マイクロリットルのRNAサンプルをRNAクリーンアップカラムにアプスします。そして、メーカーのプロトコルに従ってそれを処理します。最後に、30マイクロリットルのRNase遊離水でRNAを溶出し、摂氏マイナス80度で最大3か月間保存します。

転写後制御要素、または増殖細胞で形成されるPCE、GAG、RNA、RHAリボ核タンパク質複合体を単離します。FLAG-MS2 RNP免疫沈降は、トランスフェクションしたHECK293細胞溶解物で行いました。その結果、FLAG-MS2タンパク質が効率的に沈殿することが示されています。

DHX9/RHAはRNP複合体に存在し、IgG同位体コントロールやネガティブコントロールには含まれていません。ここに示されているのは、RNase H消化されたRNA DNA複合体からのウェスタンブロットです。RNase HはPCE GAG RNAを切断し、5つのプライムUTRに特異的に結合したRNP複合体を放出しました。

DHX9/RHA関連RNPは、溶離液に濃縮されています。重要なことに、FLAG-MS2に結合したRNPは抗体標識ビーズとともに残っていました。この実験では、細胞内および溶離液中にレトロウイルスPCE GAG RNAを含むMS2ステムループのHO免疫沈降をRT-PCRおよびQRT-PCRによって検証しました。

その結果、DHX9/RHAとレトロウイルスのファイブプライムUTRとの間に選択的な関連性が確認され、これは標的翻訳制御に重要なユニークなRNPとして強調されています。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば、約5時間で完了します。この手順を試行する際は、無傷のRNP複合体の維持と目的の特定のRNP複合体の分離を確実にするために、すべての手順を効率的かつ慎重に実行することを覚えておくことが重要です。

この手順に続いて、質量分析やRNA-Seqなどの他の方法を実行して、ターゲットRNAとの全球的なタンパク質の会合などの追加の質問に答えることができます。また、特定のRNPに関与するすべての転写産物の領域分析または完全な分析。この技術は、その開発後、転写後遺伝子制御の分野の研究者が、病原性ウイルス遺伝子の有効期限を支配する明確なRNAタンパク質複合体と細胞遺伝子発現制御の一般的なメカニズムを探求する道を開きました。

このビデオを見れば、無傷の細胞RNP複合体を回収する方法と、選択的オリゴヌクレオチド指向濃縮を使用してその組成を決定する方法について十分に理解できるはずです。また、病原性ウイルスや生物学的サンプル、酸やフェノールなどの危険な化学物質を扱うことは、非常に危険であることを忘れないでください。この手順を実行するときは、適切な個人用保護具などのすべての予防措置を常に講じる必要があります。