Name: 古典的なホジキンリンパ腫のリードステルベルグ細胞のフローソーティングとExome配列決定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 学ぶ 古典的ホジキンリンパ腫のリードステルベルグ細胞をフローソーティングで単離し、エクソーム配列決定を行う方法。高品質な腫瘍由来DNAを前増幅なしで取得し、ドライバー変異と免疫逃避変異を同定して診断・治療戦略の向上に貢献します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

このプロジェクト方法の開発は、Weill Cornell Medical Collegeの病理学および実験医学部門によって資金提供されました。私たちは、部分的な資金調達のために、計算生物学と医学の3つの機関のトレーニングプログラムを認めています。時間と知識を私たちと共有した科学者、特にMaryke Appelに感謝します。ダンバージェス; Iwanka Kozarewa;チャド・ロックリー; Jenny Zhang、Xiaobo（Shawn）Liang、Dong Xu、Wei Zhang、Huimin Shang、Tatiana Batson、Tuo Zhangを含むWeill Cornell Medical CollegeのGenomics Core Facilityの皆さんです。

<ol><li>Abrams, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((National+Cancer+Institute%27s+Precision+Medicine+Initiatives+for+the+new+National+Clinical+Trials+Network%5BTitle%5D)+AND+%22American+Society+of+Clinical+Oncology+educational+book+%2F+ASCO.+American+Society+of+Clinical+Oncology.+Meeting%22%5BJournal%5D)">National Cancer Institute's Precision Medicine Initiatives for the new National Clinical Trials Network.</a> American Society of Clinical Oncology educational book / ASCO. American Society of Clinical Oncology. Meeting. , 71-76 (2014).</li>
<li>Gagan, J., Van Allen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+to+guide+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+medicine%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing to guide cancer therapy.</a> Genome medicine. 7, 80(2015).</li>
<li>Matsuki, E., Younes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphomagenesis+in+Hodgkin+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cancer+biology%22%5BJournal%5D)">Lymphomagenesis in Hodgkin lymphoma.</a> Seminars in cancer biology. 34, 14-21 (2015).</li>
<li>Fromm, J. R., Kussick, S. J., Wood, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+purification+of+classical+Hodgkin+cells+from+lymph+nodes+by+flow+cytometry+and+flow+cytometric+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Identification and purification of classical Hodgkin cells from lymph nodes by flow cytometry and flow cytometric cell sorting.</a> Am J Clin Pathol. 126 (5), 764-780 (2006).</li>
<li>Fromm, J. R., Thomas, A., Wood, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+can+diagnose+classical+hodgkin+lymphoma+in+lymph+nodes+with+high+sensitivity+and+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry can diagnose classical hodgkin lymphoma in lymph nodes with high sensitivity and specificity.</a> Am J Clin Pathol. 131 (3), 322-332 (2009).</li>
<li>Roshal, M., Wood, B. L., Fromm, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+detection+of+the+classical+hodgkin+lymphoma%3A+clinical+and+research+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+hematology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric detection of the classical hodgkin lymphoma: clinical and research applications.</a> Advances in hematology. 2011, 387034(2011).</li>
<li>Reichel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+sorting+and+exome+sequencing+reveal+the+oncogenome+of+primary+Hodgkin+and+Reed-Sternberg+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Flow sorting and exome sequencing reveal the oncogenome of primary Hodgkin and Reed-Sternberg cells.</a> Blood. 125 (7), 1061-1072 (2015).</li>
<li>Kozarewa, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Modified+Method+for+Whole+Exome+Resequencing+from+Minimal+Amounts+of+Starting+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Modified Method for Whole Exome Resequencing from Minimal Amounts of Starting DNA.</a> PLoS ONE. 7 (3), e32617(2012).</li>
<li>Brunicardi, F. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrunicardi%2C+FC+%22Schwartz%27s+Principles+of+Surgery%22">Schwartz's Principles of Surgery</a>. , 10th ed, McGraw-Hill Education / Medical. (2014).</li>
<li>Kantor, A. B., Roederer, M. FACS analysis of leukocytes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKantor%2C+AB+%22Handbook+of+Experimental+Immunology%22">Handbook of Experimental Immunology</a>. 2, Blackwell Scientific. (1996).</li>
<li>Sanders, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathways+of+adhesion+in+spontaneous+rosetting+of+T-lymphocytes+to+the+Hodgkin%27s+cell+line+L428%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular pathways of adhesion in spontaneous rosetting of T-lymphocytes to the Hodgkin's cell line L428.</a> Cancer Res. 48 (1), 37-40 (1988).</li>
<li>Biosciences. FACSDiva Software v6.0. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.bdbiosciences.com/in/instruments/software/facsdiva/resources/overview.jsp">http://www.bdbiosciences.com/in/instruments/software/facsdiva/resources/overview.jsp</a> (2007).</li>
<li>Biosciences. <a target="_blank" href="https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSAria_II_User_Guide.pdf">FACSAria II User's Guide. Part No. 644832, Revision A</a>. , (2009).</li>
<li>Life Technologies. Qubit 3.0 Fluorometer, Catalog Number Q33216. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33216">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33216</a> (2017).</li>
<li>Roche Nimblegen. <a target="_blank" href="https://shop.roche.com/wcsstore/RASCatalogAssetStore/Articles/SeqCapEZLibrarySR_UGuide_v4p1.pdf">SeqCap EZ Library SR User's Guide ver. 4.1</a>. , (2013).</li>
<li>Illumina. HiSeq High-Throughput Sequencing System. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.illumina.com/systems/hiseq_2500_1500.html">http://www.illumina.com/systems/hiseq_2500_1500.html</a> (2016).</li>
<li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).</li>
<li>Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li>
<li>The Broad Institute. Picard Tools. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://broadinstitute.github.io/picard/">http://broadinstitute.github.io/picard/</a> (2016).</li>
<li>Saunders, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strelka%3A+accurate+somatic+small-variant+calling+from+sequenced+tumor-normal+sample+pairs%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Strelka: accurate somatic small-variant calling from sequenced tumor-normal sample pairs.</a> Bioinformatics. 28 (14), 1811-1817 (2012).</li>
<li>Cingolani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+program+for+annotating+and+predicting+the+effects+of+single+nucleotide+polymorphisms%2C+SnpEff%3A+SNPs+in+the+genome+of+Drosophila+melanogaster+strain+w1118%3B+iso-2%3B+iso-3%5BTitle%5D)+AND+%22Fly+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">A program for annotating and predicting the effects of single nucleotide polymorphisms, SnpEff: SNPs in the genome of Drosophila melanogaster strain w1118; iso-2; iso-3.</a> Fly (Austin). 6 (2), 80-92 (2012).</li>
<li>Dobin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAR%3A+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li>
<li>Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Genomics+Viewer+%28IGV%29%3A+high-performance+genomics+data+visualization+and+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration.</a> Briefings in bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).</li>
<li>DNA copy number data analysis. v.R package version 1.34.0. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://omictools.com/dnacopy-tool">https://omictools.com/dnacopy-tool</a> (2013).</li>
</ol>

著者は何も開示することはない。

この技術を習得した後のアプリケーションまたは方向 この研究により、少なくとも10ngのDNAを含むサンプルからのexomeシークエンシングが可能になります。臨床的な文脈において、この限界は、不十分な材料のために大部分の細針吸引試料を除外するが、適切な中核生検および切除生検試料を含む。これにより、可能なサンプルのより大きなセットからのデータの取得が可能になる。 プロトコル内の重要なステップ 実験の成功には、適切な凍結および解離技術が不可欠です。試料全体は、線維性切片を含めて可能な限り解離しなければならない。細胞の種類に130μmのノズルを使用することは、大きなHRS細胞およびDNAの収率を最大にするために重要であると思われる。複数のノズルサイズを用いて厳密に制御された実験は実施されなかったが、100μmと比較して大きなノズルを用いて細胞収量が観察され、スライドポスト85μmノズルのソート（未発表の観察）...

<html>次世代シークエンシングの結果としての癌ゲノミクスの進歩は、治療標的の同定および多くの血液学的および非血液学的新生物の予後診断において顕著なブレークスルーをもたらした。特定のゲノム改変に基づく新たな個別治療戦略は、多くの腫瘍型で急速に導入されている（参考文献1,2参照）。リンパ腫ゲノミクスの著しい進歩にもかかわらず、古典的ホジキンリンパ腫（CHL）における腫瘍性HRS細胞のゲノムは、過小発現していた。この研究は、反応性微小環境内の腫瘍性HRS細胞の不足により妨げられており、精製HRS細胞集団を単離することは困難である3 。 原発性腫瘍から生存可能なHRS細胞を単離するための方法は、Fromm et al。 図4に示すように 、この方法は、CD30、CD15、CD40、CD95、CD45 CD20、CD5およびCD64からなる8抗体カクテルを使用して、CHL腫瘍懸濁液からHRS細胞を明白に同定する。少なくとも10 7個の細胞（約10mgの組織）からなる腫瘍生検材料からの新鮮または凍結細胞懸濁液から少なくとも1,000個の生存可能なHRS細胞を単離することができる（フローサイトメトリー分析により90％以上であり、 10個の連続した症例のexomeゲノム分析によって少なくとも80％。 私たちは、フローサイトメトリーによる細胞単離技術を改良し、このプロセスを大幅に簡素化し、原発性CHL腫瘍から数千の生存可能なHRS細胞を迅速に単離することを可能にしました7 。本発明者らは、ホジキンリンパ腫の原発例における腫瘍細胞の最初の完全なエキソーム配列であると考えられるものを産生するためにこの技術を利用した。私たちの研究は、個々のCHL症例のゲノムワイドな高スループット研究の可能性を示しており、すでにCHL発症の側面を説明する可能性のある新規なゲノム改変の同定につながっている。 我々はさらに、ハイスループットゲノム研究のために抽出されたDNAを利用するためのパイプラインを開発した。 HRS細胞数が1,000個以下のHRS細胞からの信頼性の高い結果を得るために、アダプターライゲーション効率を高め、DNA断片ライブラリーを作製するための改変された次世代DNAライブラリー作製手順8を開発しました過度の増幅なしに。この方法は、ルーチンの臨床サンプルの分析と、再発性の突然変異および染色体の変化の検出を可能にする。

<table><tbody><tr><td>ペトリまたは細胞培養皿(滅菌)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640メディア</td><td>ロズウェルパークメモリアルインスティテュート</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胎児子牛血清(FCS)、(熱不活性化)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>凍結培地(RPMI、20%FCS、10%ジメチルスルホキシド(DMSO))-新鮮にし</td>、2%FCSで無菌<td></td><td></td><td></td>RPMIを保ち</tr><tr><td>ます(新鮮にするか、最大1ヶ月間保存してください)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>フレッシュブレード</td><td></td><td></td><td></td>付きメス</tr><tr><td>10 mLシリンジ(針なし)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>極低温バイアル50</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mLコニカル遠心チューブ、50 mLコニカル</td>遠心チューブを取り扱い、400gのHepesバッファーを提供できる力<td></td><td></td><td></td></tr>遠心<tr><td>分離</td><td></td><td></td><td></td></tr>機<tr><td>(1 M、細胞培養グレード)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pluoronic-F68</td><td>Thermo-Fisher</td><td>24040-032</td><td></td></tr><tr><td>DNAase-I</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>D4527-10KU</td><td>は、-200 &#176 の RPMI で 5 mg/mL として保存します。C</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ソーティングメディア (PBS + 2% BSA + 25 mM HEPES + プルオロン酸 &ndash;F68 (1x))</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD64-FITC (22)</td><td>Beckman Coulter, Miami, FL</td><td></td><td>20 &mu;Lは開始ボリュームを推奨しました。力価測定が推奨されます</td></tr><tr><td>CD30-PE (BerH83)</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td></td><td>20 &mu;Lは開始ボリュームを推奨しました。力価測定が推奨されます</td></tr><tr><td>CD5-ECD (BL1a)</td><td>Beckman Coulter, Miami, FL</td><td></td><td>10 &mu;Lは開始ボリュームを推奨しました。力価測定が推奨されます</td></tr><tr><td>CD40-PerCP-eFluor 710 (1C10)</td><td>Ebiosciences, San Diego, CA</td><td></td><td>5 &mu;Lは開始ボリュームを推奨しました。力価測定が推奨されます</td></tr><tr><td>CD20-PC7 (B9E9)</td><td>Beckman Coulter, Miami, FL</td><td></td><td>10 &mu;Lは開始ボリュームを推奨しました。力価は</td></tr><tr><td>CD15-APC(HI98)</td><td>BD Biosciences、サンノゼ、CA</td><td></td><td>20 &mu;Lは開始ボリュームを推奨しました。力価取得が推奨されます</td></tr><tr><td>CD45 APC-H7 (2D1)</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td></td><td>10 &mu;LはCD45-Krome Orange(J.33、Beckman Coulter)の推奨容量です。力価測定が推奨されます</td></tr><tr><td>CD95-Pacific Blue (DX2)</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td></td><td>5 &mu;Lは開始ボリュームを推奨しました。力価は</td></tr><tr><td>CD2(5 &mu;g;クローンRPA-2.10)</td><td>Biolegend、カリフォルニア州</td><td></td>サンディエゴ <td>オプションのプロトコルの場合。力価取得が推奨されます</td></tr><tr><td>CD54 (10 &mu;g;clone 84H10)</td><td>Serotec, Oxford, United Kingdom</td><td></td><td>オプションのプロトコルについて;力価は</td></tr><tr><td>CD58(10 &mu;g;クローン TS2/9)</td><td>eBioscience, San Diego, CA</td><td></td><td>オプションのプロトコル;力価は</td></tr><tr><td>LFA-1(12 &mu;g;クローンMHM23)</td><td>Novus Biologicals、Littleton、CO</td><td></td><td>オプションのプロトコル用。力価は</td></tr><tr><td>BD CS&をお勧めしますT Beads</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Accudrop Beads</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BC Versa Comp antibody capture beads</td><td>Beckman Coulter, Miami, FL</td><td></td><td>Compensation Beads</td></tr><tr><td>BD-FACS ARIA 5つのレーザーを使用した特別研究注文装置</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td></td><td>抗体パネル内の蛍光色素を検出する機能を備えた任意のBD-FACSアリアは、ウィザード</td></tr>プロ<tr><td></td><td>メガ</td><td>A2360</td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-Cl</td><td>バッファーNA</td><td></td><td></td></tr>量子<tr><td>ビットdsDNA HSアッセイキット</td><td>ライフテクノロジーズ、カールスバッド、CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>S2ソニケー</td><td>ターCovaris、ウォーバーン、マサチューセッツ州</td><td></td><td>代替案はmicroTUBE</td></tr><tr><td></td><td>で代用することができますCovaris, Woburn, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ロースループット ライブラリ調製キット</td><td>Kapa Biosystems, Wilmington, MA</td><td>KK8221</td><td></td></tr><tr><td>Sybr Green</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>S9430</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP Beads</td><td>Beckman Coulter, Miami, FL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SeqCap EZ Exome v.3.0</td><td>Roche Nimblegen</td><td>6465684001</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TruSeq-style Universal adapter</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT), アイオワ</td><td></td>州コーラルビル <td>HPLC 精製;AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGGCTCTTCCGAT*C*T</td></tr><tr><td>TruSeqスタイルインデックスアダプター</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa</td><td></td><td>HPLC purification; /5Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCTCTCTATATGCCGTCTTCTGCTTG</td></tr><tr><td>TruSeq-style PCR primer 1</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa</td><td></td><td>AATGATACGGCGACCACCGAGA</td></tr><tr><td>TruSeq-style PCR primer 2</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)、アイオワ</td><td></td>州コーラルビル <td>CAAGCAGAAGACGGCATACGAG</td></tr><tr><td>Nuclease Free Duplex Buffer</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)、アイオワ</td><td></td><td></td>州コーラルビル</tr><tr><td>BD FACSDIVA ソフトウェア</td><td>BD Biosciences、カリフォルニア州</td><td></td><td></td>サンノゼ</tr><tr><td>BD Falcon Tubes</td><td>BD Biosciences、カリフォルニア州サンノゼ</td><td></td><td></td></tr> BD <tr><td>Flow Tubes</td><td>BD Biosciences、カリフォルニア州</td><td></td><td>サンノゼ</td></tr></tbody></table>

古典的なホジキンリンパ腫のリードステルベルグ細胞のフローソーティングとexome配列決定

Flow-sorting and Exome Sequencing of the Reed-Sternberg Cells of Classical Hodgkin Lymphoma

古典的ホジキンリンパ腫のホジキンリード - スターンバーグ細胞は、炎症性リンパ球のバックグラウンド内にまばらに分布しており、典型的には腫瘍質量の1％未満を構成する。バルク腫瘍に由来する物質は、特徴付けに不十分な濃度で腫瘍含量を含む。したがって、8個の抗体を用いた蛍光活性化細胞選別、ならびに側方および前方散乱は、後の研究のために腫瘍から高純度のHRS細胞を迅速に分離および濃縮する方法としてここに記載されている。同時に、exomeシークエンシングの標準プロトコールでは、通常、フローソーティングでも高すぎることが多い100〜1,000 ngの入力DNAが必要であるため、高品質のライブラリー構築プロトコールを最適化して提供しますわずか10 ngの入力DNAからのデータ。この組み合わせは、全eのハイブリダイゼーション捕捉に適した次世代ライブラリーを作製することができるxome baitsまたはより集中したターゲットパネルを必要に応じて選択します。 HRS細胞のある種の配列決定は、健常な腫瘍内のT細胞またはB細胞と比較した場合、突然変異、挿入および欠失、およびコピー数の変化を含む体細胞変化を同定することができる。これらの知見は、HRS細胞の分子生物学を解明し、標的薬物治療の道筋を明らかにする可能性がある。

バイオアナライザープロットは、ライブラリー増幅および0.8xビーズクリーンアップの後に行う必要があります。所望の範囲内のフラグメントサイズの「通常のような」分布を見るはずです（ 図2a ）。曲線の目に見える「肩」のようなこの形状からの逸脱は、高分子量または低分子量の人工物の存在を示す。例えば、 図2b〜2dは、理想的には配列されていない目に見える成果物を含むライブラリーの例を示しています。ライブラリーが著しく損なわれている場合、DNAが利用可能である場合にはライブラリー構築を繰り返すこと、および/または新鮮で始めるための細胞選別を行うことは価値があるかもしれません。 アダプターの二量体は、時には最初の0.8倍のビーズクリーンアップを継承することがあります。これが起こると、それは125〜130b...

ここでは、古典的なホジキンリンパ腫（HL）細胞から高品質、全exomeデータを生成するように設計された、フローサイトメトリーによる細胞ソーティングと低入力、次世代ライブラリー構築プロトコルを説明します。

古典的なホジキンリンパ腫のリードステルベルグ細胞のフローソーティングとExome配列決定

The Hodgkin Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin lymphoma are sparsely distributed within a background of inflammatory lymphocytes and typically ...

この手順の全体的な目標は、炎症性リンパ球性古典的ホジキンリンパ腫またはCHL腫瘍から生存可能なホジキンリードスターンバーグまたはHRS細胞を分離して濃縮し、高品質の全エクソーム次世代シーケンシングデータの生成と分析を行うことです。この方法は、主要なドライバー変異の同定、免疫回避変異の同定、分類内の遺伝的多様性の観察など、CHR生物学における重要な質問に答えることができます。この技術により、品質と純度が非常に高い腫瘍由来のDNAが得られます。プレアンプステップを必要とせずに次世代シーケンシングライブラリの生成を促進します。この手法は、サブ分類と予後に役立つ可能性があるため、ホジキンリンパ腫の診断に重要な影響を与える可能性があります。また、一部の変化が特定の薬物に対する感受性または耐性を示す可能性があるため、治療法の選択にも影響を与える可能性があります。ジョナサン・フロムは、フローサイトメトリーによってHRS細胞を可視化する方法を発見し、これらの細胞で最初のソーティング実験を行ったときに、このアイデアを最初に思いつきました。細胞を調製する前に、あらかじめ滴定した抗体を暗いガラスバイアルで混合します。次に、PBSとBSAを加えて、抗体カクテルを100マイクロリットルの容量にします。そして、バイアルを液体窒素から氷のバケツまたはドライアイスに移します。次に、目的の細胞を摂氏37度の水浴で急速に解凍します。小さな凍結部分だけが残ったら、摂氏37度の融解培地を45ミリリットル入れた50ミリリットルの円錐管に細胞を注ぎ、1ミリリットルの新鮮な解凍培地で極低温バイアルを2回すすぎます。両方のすすぎ液をプールした後、細胞を室温で15分間消化させます。細胞が再平衡化したら、遠心分離により細胞を回収します。上清の最後の200マイクロリットルを除くすべてを吸引します。.残りの解凍培地に細胞を懸濁し、細胞をさらに2〜3分間休ませます。次に、100マイクロリットルの抗体カクテルで細胞を室温で15分間インキュベートし、光から保護します。インキュベーションの終わりに、細胞を3ミリリットルの選別培地で洗浄し、ペレットを1ミリリットルの新鮮な選別培地に再懸濁します。次に、5ミリリットルのフローチューブトップストレーナーで細胞をろ過します。チューブとストレーナーを追加の1ミリリットルの選別培地ですすぎ、細胞を氷上に保持します。細胞のソーティングを開始する前に、フローサイトメーターソフトウェアの実験メニューで「new experiment」を選択し、装置のステータスウィンドウを開きます。[パラメーター] タブで、未使用のパラメーターをすべて削除します。次に、実験タブを再度開き、報酬設定を選択して報酬コントロールを作成します。ブラウザウィンドウで、プラス記号をクリックして補正制御試料を展開し、データを記録せずに補正制御管を実行します。必要に応じて検出器の電圧を調整し、各植物相クロムの正に染色されたビーズの個体群が10, 000から100, 000チャネルの間になるようにします。そして、プライマリ検出チャネルで最も明るいもの。各チューブの各パラメータに必要な電圧を記録します。次に、コンペンセーションコントロールサンプルの下で、左クリック1回で未染色のコントロールチューブをハイライトし、未染色のコントロールチューブをサンプルステージにロードします。アクイジション制御ウィンドウで[負荷]をクリックし、すべてのパラメータのディテクタ電圧フィールドに個々の補償制御を実行して、決定された電圧を手動で入力します。[レコード]をクリックすると、未染色のコントロールデータを取得できます。次に、残りのすべての補正制御を実行し、検出器の設定を一切変更せずにデータを記録します。すべてのコントロールを分析したら、滅菌脱イオン水のチューブを5分間実行して、機器から残留物質を取り除きます。HRSソーティングのために細胞をゲートするには、実験チューブをロードし、毎秒3、000〜4、000イベントを取得するために流量を調整しながら、少なくとも100、000イベントを記録します。1, 000個の細胞に1個程度の母集団を視覚化するのに十分なイベントを記録するようにしてください。体細胞B細胞およびT細胞コントロールを同定するために、CD20陽性細胞およびCD5陽性細胞をそれぞれゲートします。すべてのゲートを設定したら、セルを7〜8ミリリットルの収集培地を含む予め冷却した15ミリリットルの円錐管に選別します。ソートの最後に、単離された細胞集団を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。そして、遠心分離によって細胞をペレット化します。次に、1ミリリットルの新鮮なPBSで細胞を洗浄し、小さなペレットを乱さないように注意しながら、各チューブから上清を取り除きます。ライブラリ増幅とポイント8Xビーズクリーンアップの後、所望の範囲のフラグメントサイズの正常な光分布が観察されるはずです。この形状からの逸脱を示すライブラリは、高分子量または低分子量のアーティファクトが存在することを示しており、理想的にはシーケンシングすべきではありません。たとえば、アダプターダイマーは、最初の尖ったXビーズのクリーンアップを通じて引き継がれ、125〜130塩基対を中心とした鋭いピークとして現れることがあります。この場合、追加の尖ったXビードのクリーンアップを実行し、その後、サイズ分布の視覚化を繰り返して、ダイマーの除去が成功するようにする必要があります。レーンあたり4つのサンプルのマルチプレックスシーケンシングの後、ターゲット全体で50〜100倍のカバレッジの中央深度が達成できます。ただし、1ナノグラムのライブラリから生成されたコピー数プロットは、偽のコピー数の増減を引き起こす可能性があります。古典的ホジキンリンパ腫の症例の約70%は、B2Mおよび820の変異、および/またはクローン性と思われる欠失を有しており、これは相対的な腫瘍含有量を推定するために使用できる。T細胞を体細胞コントロールとして使用すると、HRSシーケンシングは、T細胞受容体のアルファ、デルタ、およびベータの位置に対応する位置で有意なコピー数の増加を示します。また、B細胞受容体の重鎖およびκ軽鎖位置の有意な損失と同様に、エクソーム症例ごとに100〜400の体細胞変異の全体的な突然変異負荷があります。一度習得すると、細胞の選別やシーケンシングライブラリの構築を含むこの技術は、適切に実行されれば3〜4日で完了することができます。この手順に続いて、エピジェネティクス、プロテオミクス、メタバロミクスなどの他の方法や、より大きな前向き研究を実施して、ホジキンリンパ腫に関するより多くの知識を得て、より具体的な個別化治療に向けて前進することができます。開発後、この方法により、比較的多くの高純度のHRS細胞を研究できるようになりました。このビデオを見れば、HRS細胞を単離し、そのゲノム解析を開始する方法について十分に理解できるはずです。

flow-sorting-exome-sequencing-reed-sternberg-cells-classical-hodgkin

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

このビデオでは、ゲル型10個の架橋デキストランG-10カラムを使用して、骨髄間質細胞から急性リンパ芽球性白血病細胞を分離する様子を説明しています。この方法は、接着性骨髄間質細胞の下に移動した腫瘍細胞の集団を回復させ、「位相薄暗い」腫瘍細胞集団を生成するのに役立ちます。...

G-10カラムベースの白血病細胞ソーティング:骨髄間質細胞から急性リンパ芽球性白血病細胞を精製する方法

このビデオでは、ヒト末梢血B細胞からのナイーブB細胞、メモリーB細胞、および形質芽細胞形質細胞亜集団のフローサイトメトリーベースの選別のためのプロトコルについて説明します。B細胞表面に発現するCD19、CD27、およびCD38受容体に結合するフルオロフォアベースの抗体と、それに続く細胞ソーティングに基づいて、異なるB細胞亜集団を区別することができます。...

フローサイトメトリーを用いた、さまざまな循環型B細胞集団の細胞ソーティング

ここでは、臍帯血から前駆体のサブセットB-細胞を単離するためのプロトコルを記述します。核酸の十分な量と質を細胞から抽出したDNAまたはRNAを利用して、その後のアッセイに使用することができる。...

臍帯血から前駆B細胞サブセットの分離

ここでは、カップル2プロテオミクス技術、すなわち2次元電気泳動（2DE）および質量分析（MS）は、一次サンプルの2つ以上のグループ間で差次的に発現/翻訳後修飾タンパク質を同定するためのプロトコールを記載する。このアプローチは、一緒に機能的な実験と、予後マーカー/治療標的の同定および特徴を可能にします。...

タンパク質機能に2DE  - ゲルスポットから：慢性リンパ性白血病で、HS1から学んだレッスン

ドナー由来細胞の定量は、赤血球の溶血患者の幹細胞移植後の生着を監視する必要です。流れフローサイトメトリーを用いた細胞の選別、コロニー形成アッセイと短いタンデム繰り返しは増殖を評価するために使用可能性がありますの後の分析と赤芽球のコンパートメントの前駆細胞の分化の組み合わせ。...

赤血球の溶血症に対する造血幹細胞移植後の残留ドナー赤芽球系前駆細胞の検出

最小限、または測定可能な残存病変 (MRD) の検出は、リスク アセスメントを精製急性骨髄性白血病 (AML) の再発を予測するための重要な予後バイオ マーカーです。これらの包括的なガイドラインと、MRD の一貫性と正確な同定と検出のためのベスト...

サンプルおよび測定可能な残存病変と急性骨髄性白血病の白血病幹細胞を測定するプロセス骨髄に対する包括的なプロトコル

フローサイトメトリーによる主な急性骨髄性白血病細胞白血病幹細胞マーカーの同時発現を検出するためのプロトコルの概要を説明します。3 前駆細胞集団と増加する成熟の程度と推定される LSC...

フローサイトメトリーを診断とフォローで主に急性骨髄性白血病、白血病幹細胞患者由来異種での見積もりに

一括遺伝子発現測定クラウド個々 のセル違い異種細胞集団で。ここでは、プロトコルについて述べる方法単一細胞遺伝子発現解析とインデックスの不均一性の線引きによって蛍光活性化セルの並べ替え (FACS) を並べ替えを結合でき、immunophenotypically...

組合せの単一セルは分子を特徴付ける方法・肺浸潤異質性ひと幹と前駆細胞集団

免疫磁気ビーズと蛍光活性化細胞ソーティングを組み合わせて、末梢血単核球(単球、CD4+ T細胞、CD8+...

感染性単核球症の小児からの末梢血サンプル中の免疫細胞亜集団の分離

ここでは、細胞分裂の数、表面細胞の表現型、および細胞の親族関係を同時に測定できるフローサイトメトリーベースの技術を紹介します。これらのプロパティは、順列ベースのフレームワークを使用して統計的にテストできます。...

フローサイトメトリー による 造血幹細胞と前駆細胞の血縁関係、分裂数、表現型の同時評価

学ぶ 古典的ホジキンリンパ腫のリードステルベルグ細胞をフローソーティングで単離し、エクソーム配列決定を行う方法。高品質な腫瘍由来DNAを前増幅なしで取得し、ドライバー変異と免疫逃避変異を同定して診断・治療戦略の向上に貢献します。

古典的なホジキンリンパ腫のリードステルベルグ細胞のフローソーティングとExome配列決定

さらに動画を探す