古典的なホジキンリンパ腫のリードステルベルグ細胞のフローソーティングとExome配列決定

この手順の全体的な目標は、炎症性リンパ球性古典的ホジキンリンパ腫またはCHL腫瘍から生存可能なホジキンリードスターンバーグまたはHRS細胞を分離して濃縮し、高品質の全エクソーム次世代シーケンシングデータの生成と分析を行うことです。この方法は、主要なドライバー変異の同定、免疫回避変異の同定、分類内の遺伝的多様性の観察など、CHR生物学における重要な質問に答えることができます。この技術により、品質と純度が非常に高い腫瘍由来のDNAが得られます。

プレアンプステップを必要とせずに次世代シーケンシングライブラリの生成を促進します。この手法は、サブ分類と予後に役立つ可能性があるため、ホジキンリンパ腫の診断に重要な影響を与える可能性があります。また、一部の変化が特定の薬物に対する感受性または耐性を示す可能性があるため、治療法の選択にも影響を与える可能性があります。

ジョナサン・フロムは、フローサイトメトリーによってHRS細胞を可視化する方法を発見し、これらの細胞で最初のソーティング実験を行ったときに、このアイデアを最初に思いつきました。細胞を調製する前に、あらかじめ滴定した抗体を暗いガラスバイアルで混合します。次に、PBSとBSAを加えて、抗体カクテルを100マイクロリットルの容量にします。

そして、バイアルを液体窒素から氷のバケツまたはドライアイスに移します。次に、目的の細胞を摂氏37度の水浴で急速に解凍します。小さな凍結部分だけが残ったら、摂氏37度の融解培地を45ミリリットル入れた50ミリリットルの円錐管に細胞を注ぎ、1ミリリットルの新鮮な解凍培地で極低温バイアルを2回すすぎます。

両方のすすぎ液をプールした後、細胞を室温で15分間消化させます。細胞が再平衡化したら、遠心分離により細胞を回収します。上清の最後の200マイクロリットルを除くすべてを吸引します。.

残りの解凍培地に細胞を懸濁し、細胞をさらに2〜3分間休ませます。次に、100マイクロリットルの抗体カクテルで細胞を室温で15分間インキュベートし、光から保護します。インキュベーションの終わりに、細胞を3ミリリットルの選別培地で洗浄し、ペレットを1ミリリットルの新鮮な選別培地に再懸濁します。

次に、5ミリリットルのフローチューブトップストレーナーで細胞をろ過します。チューブとストレーナーを追加の1ミリリットルの選別培地ですすぎ、細胞を氷上に保持します。細胞のソーティングを開始する前に、フローサイトメーターソフトウェアの実験メニューで「new experiment」を選択し、装置のステータスウィンドウを開きます。

[パラメーター] タブで、未使用のパラメーターをすべて削除します。次に、実験タブを再度開き、報酬設定を選択して報酬コントロールを作成します。ブラウザウィンドウで、プラス記号をクリックして補正制御試料を展開し、データを記録せずに補正制御管を実行します。

必要に応じて検出器の電圧を調整し、各植物相クロムの正に染色されたビーズの個体群が10, 000から100, 000チャネルの間になるようにします。そして、プライマリ検出チャネルで最も明るいもの。各チューブの各パラメータに必要な電圧を記録します。

次に、コンペンセーションコントロールサンプルの下で、左クリック1回で未染色のコントロールチューブをハイライトし、未染色のコントロールチューブをサンプルステージにロードします。アクイジション制御ウィンドウで[負荷]をクリックし、すべてのパラメータのディテクタ電圧フィールドに個々の補償制御を実行して、決定された電圧を手動で入力します。[レコード]をクリックすると、未染色のコントロールデータを取得できます。

次に、残りのすべての補正制御を実行し、検出器の設定を一切変更せずにデータを記録します。すべてのコントロールを分析したら、滅菌脱イオン水のチューブを5分間実行して、機器から残留物質を取り除きます。HRSソーティングのために細胞をゲートするには、実験チューブをロードし、毎秒3、000〜4、000イベントを取得するために流量を調整しながら、少なくとも100、000イベントを記録します。

1, 000個の細胞に1個程度の母集団を視覚化するのに十分なイベントを記録するようにしてください。体細胞B細胞およびT細胞コントロールを同定するために、CD20陽性細胞およびCD5陽性細胞をそれぞれゲートします。すべてのゲートを設定したら、セルを7〜8ミリリットルの収集培地を含む予め冷却した15ミリリットルの円錐管に選別します。

ソートの最後に、単離された細胞集団を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。そして、遠心分離によって細胞をペレット化します。次に、1ミリリットルの新鮮なPBSで細胞を洗浄し、小さなペレットを乱さないように注意しながら、各チューブから上清を取り除きます。

ライブラリ増幅とポイント8Xビーズクリーンアップの後、所望の範囲のフラグメントサイズの正常な光分布が観察されるはずです。この形状からの逸脱を示すライブラリは、高分子量または低分子量のアーティファクトが存在することを示しており、理想的にはシーケンシングすべきではありません。たとえば、アダプターダイマーは、最初の尖ったXビーズのクリーンアップを通じて引き継がれ、125〜130塩基対を中心とした鋭いピークとして現れることがあります。

この場合、追加の尖ったXビードのクリーンアップを実行し、その後、サイズ分布の視覚化を繰り返して、ダイマーの除去が成功するようにする必要があります。レーンあたり4つのサンプルのマルチプレックスシーケンシングの後、ターゲット全体で50〜100倍のカバレッジの中央深度が達成できます。ただし、1ナノグラムのライブラリから生成されたコピー数プロットは、偽のコピー数の増減を引き起こす可能性があります。

古典的ホジキンリンパ腫の症例の約70%は、B2Mおよび820の変異、および/またはクローン性と思われる欠失を有しており、これは相対的な腫瘍含有量を推定するために使用できる。T細胞を体細胞コントロールとして使用すると、HRSシーケンシングは、T細胞受容体のアルファ、デルタ、およびベータの位置に対応する位置で有意なコピー数の増加を示します。また、B細胞受容体の重鎖およびκ軽鎖位置の有意な損失と同様に、エクソーム症例ごとに100〜400の体細胞変異の全体的な突然変異負荷があります。

一度習得すると、細胞の選別やシーケンシングライブラリの構築を含むこの技術は、適切に実行されれば3〜4日で完了することができます。この手順に続いて、エピジェネティクス、プロテオミクス、メタバロミクスなどの他の方法や、より大きな前向き研究を実施して、ホジキンリンパ腫に関するより多くの知識を得て、より具体的な個別化治療に向けて前進することができます。開発後、この方法により、比較的多くの高純度のHRS細胞を研究できるようになりました。

このビデオを見れば、HRS細胞を単離し、そのゲノム解析を開始する方法について十分に理解できるはずです。