液体クロマトグラフィー/質量分析法による有毒フグの改善されたポリメラーゼ連鎖反応 - 制限断片長多型ジェノタイピング

この実験の全体的な目標は、小さなPCRアンプリコンを分析することにより、有毒なフグの迅速かつ正確なジェノタイピングを行うことです。フグ料理の準備に使用されるフグの食用部分は、その種によって異なり、一部の種には全身に毒素が含まれています。この筋肉は、データベースとフグのマスとヒレと出生皮は、すべての人にとって完全な安全食品と調査のための観点からフグの遺伝子型決定を助けることができます。

キットを用いてDNA抽出を行うには、まず0.5ミリリットルまたは1.5ミリリットルの微量遠心チューブに30〜50ミリグラムの魚組織を入れます。小ヘラを使用して、ひれと皮膚なしで組織を押しつぶします。180マイクロリットルの動物組織溶解バッファーと40マイクロリットルのプロテイナーゼkを加え、短時間ボルテックスします。

56°Cでブロックヒーターで2時間または一晩インキュベートします。サンプルを13000xgで5分間遠心分離します。上清を新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移した後、キットから塩酸グアニジンを含むカオトロピック緩衝液を200マイクロリットル加えます。

次に、200マイクロリットルの99.5%エタノールを加え、ボルテックスで混合します。任意の沈殿物を含む混合物を、2ミリリットルの収集チューブに入れたスピンカラムに移します。13000xgで1分間遠心分離した後、フロースルーを廃棄します。

キットから塩酸グアニジンを含む500マイクロリットルの洗浄バッファー1を加え、前と同じように遠心分離します。フロースルーと収集チューブを廃棄します。キットに付属の新しい2ミリリットルの収集チューブにスピンカラムを置きます。

500マイクロリットルの洗浄緩衝液2を加え、20, 000xgで3分間遠心分離します。フロースルーと収集チューブを廃棄した後、スピンカラムを新しい1.5ミリリットルの遠心分離管に移します。溶出バッファーの200マイクロリットルをスピンカラム膜の中心にピペットで移します。

1分後、6000xgで1分間遠心分離します。次に、50マイクロリットルのアルエットを使い捨ての紫外線キュベットにピペットで移します。分光光度計を使用して、220〜300ナノメートルのアルエットの紫外線スペクトルと260ナノメートルの吸光度を測定します。

液体クロマトグラフィーの成功には、試薬が分析カラムに損傷を与える可能性があるため、界面活性剤を含まない試薬の使用が重要です。汚染を避けるためにクリーンベンチで作業し、テキストプロトコルに記載されているように、抽出されたDNAサンプルごとに25マイクロリットルのPCR、ポジティブコントロールとネガティブコントロールを氷上にセットアップします。操作を容易にするために、テンプレートDNAを含まないすべての試薬を含む十分な量のカクテルを作り、分注してください。

プルーフリーディング活性のあるDNAポリメラーゼを使用して、PCR産物に3つの主要なアデニンオーバーハングが追加されないようにします。テキストプロトコルに示されているサイクルプログラムを使用して、サーマルサイクラーでPCR増幅を実行します。酵素消化を行うには、2マイクロリットルの酵素消化バッファーをPCR溶液に加えます。

各制限酵素を1マイクロリットル加え、穏やかに混合します。サーマルサイクラーでサンプルを摂氏37度で30分間インキュベートし、続いて摂氏72度で5分間インキュベートします。0.2〜0.5ミクロンの遠心フィルター装置で反応液をろ過することで、目詰まりを防ぎ、分析カラムの損傷を防ぎます。

濾液を先細りのポリプロピレンバイアルに移し、分析まで摂氏20度で保存します。ヘキサフルオロイソプロパノールとトリエチルアミンの溶液を1リットルのボトルに調製します。ボトルを液体クロマトグラフィー装置のラインAに接続し、気化を防ぐために直接冷却ポータブル冷蔵庫を使用してボトルを冷却します。

メタノールを充填した別のボトルをラインBに接続し、ガードカラムと分析カラムを装置に接続します。最初の移動相の流動を開始し、カラムを平衡化します。C-Trapの圧力を制御するためのソフトウェアがない質量分析計を使用している場合は、バーを手動で制御してC-Trapの圧力を下げる必要があります。

これを行うには、ノブを引いてロックを解除し、ノブを反時計回りに非常にゆっくりと回して、高真空圧を1/3に下げます。示された圧力は、遅延して徐々に変化する必要があります。低圧に関する警告メッセージは無視してください。

ノブを押してロックします。キャリブレーションのセットアップ後、テキストプロトコルで説明されているように、加熱されたエレクトロスプレーイオン化プローブを質量分析計のインターフェースに近づけます。キャリブラントは、内蔵されたシリンジポンプを使用して、毎分10マイクロリットルの流量で常に注入します。

カスタマイズされたキャリブレーションテーブルで6つの低質量イオンのみをチェックします。信号の強度が安定したら、キャリブレーションを進めてください。キャリブレーション後、6つの高質量イオンのみを確認し、キャリブレーションを進めてください。

失敗を避けるために、一度にすべてのイオンを使用してキャリブレーションすることは避けてください。プローブを位置Dに動かして毎分0.4ミリリットルの流量で、不活性金属チューブで装置に接続します。テキストプロトコルで説明されているようにパラメータを設定した後、バイアルの底をタップして気泡をパージします。

サンプルバイアルをサンプルラックにセットし、オートサンプラーを使用して1マイクロリットルのサンプルを注入して分析を開始します。ブラウザソフトウェアで生データファイルを開き、ポジティブコントロールとネガティブコントロールを含むすべての取得が正常に終了したことを確認します。テキストプロトコルで説明されているようにメソッドを設定し、run cueタブのrunボタンをクリックしてデコンボリューションソフトウェアを起動します。

キューが完了したら、行を選択し、上部のキャプションで[結果を開く]をクリックして、デコンボリューションの結果を取得します。以下は、ネガティブコントロールとフグのサンプルから得られた典型的な全イオン電流クロマトグラムです。各ピークは、その長さに基づいて分離されたDNA二本鎖を表しています。

この例では、フグサンプルから 3 つのピークが観察されます。これらのピークは、2つのエンドヌクレアーゼを使用したアンプリコン消化の結果です。ネガティブコントロールサンプルにはピークは観察されません。

各ピークは、多価イオンを含む質量スペクトルを表します。マススペクトルを拡大すると、同位体分解された数十のピークが目立つようになります。この分解能は、モノアイソトピック質量を決定するための必要条件であり、高分解能質量分析計を介してのみ実現可能です。

この例では、3 番目のピークのモノアイソトピック質量は 16296.7656 と 16468.6616 ダルトンです。質量許容誤差を3ppmとすると、測定値はここに示すタキフグルブリペスの理論値と同一です。一度習得すれば、このテクニックは一般的な楽器や器具を使用して1日で行うことができます。

このビデオを見れば、液体クロマトグラフィー、高分解能質量分析によるジェノタイピングのための小型アンプリコンの分析方法について十分に理解できるはずです。この技術は、配列の変動が分析対象の小さなアンプリコンに反映されている場合に限り、他のDNA多型の分析に適用することができます。しかし、この手法では塩基組成のみを識別し、同じメルキュール内の塩基置換を区別することはできません。