Name: で捕食摂食行動を分析します Pristionchusおよびその他の線虫 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: 学ぶ捕食摂食行動の解析法をPristionchus pacificusなどの線虫で。口器形態の可視化、咬傷アッセイ、高速カメラによる行動記録を含む手法で、行動神経生物学の研究に応用できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

捕食行動の写真を提供してくださったダニエル・バンバーガー博士に感謝します。この研究は、マックスプランク協会によって資金提供されました。

1.口の形の表現型<ol><li> アガロースパッド上の口フォーム識別 注：、線虫の口のモーフを視覚化アガロースパッド上に軽度の麻酔薬治療とワームを固定化し、次のように観察するために。 <ol><li>成長し、このようなP.などの線虫の文化を維持E.の細菌の芝生の上に6センチメートル上pacificus標準線虫の増殖培地（NGM）プレートとフィード大腸菌 OP50 19。 </li><li>最初の3ミリリットルの2％アガロース溶液を作るために15ミリリットルチューブに3ミリリットルのH 2 Oに0.06グラムアガロースを追加することにより、アガロースのパッドを作ります。これは、4℃で一年まで保存することができます</li><li>混合し、電子レンジで徹底的にアガロースを溶融または代わりに&gt; 88℃に設定したヒートブロックを使用</li><li>完全に溶けたら、アガロースに10％のアジ化ナトリウム溶液10μlを加え、よく混ぜます。注意：ドライアジ化ナトリウムは、反応性であり、すべてのフォームは有毒です。 </li><li> 1ミリリットルを使用しましたマイクロピペットは、標準的な顕微鏡用スライドガラスの中央に液体アガロースアジドミックスの無未満300μlと低下を置きます。 </li><li>寒天が冷える前に、素早く冷却時にパッドを形成し、アガロースを平坦化するためのドロップの上に第二の顕微鏡スライドを配置します。必要とされるなど、多くのパッドに対して繰り返します。 </li><li>互いにそれらをスライドさせることにより、ピール離れてガラス顕微鏡スライドを使用する直前。注：アガロースパッドが事前にすぎ用意されている場合、それらは過度に乾燥することができ、線虫を破損する恐れがあります。 </li><li>パッドの中心に - （3μL2）麻酔アガロースパッドにワームを転送するには、M9バッファのドロップを置きます。ピック2から3若いP.パッド上で慎重にカバースリップを配置する前にM9の低下に大人をpacificus。 P. pacificus線虫は、アガロースに固定化し、可視化できるようになります。 </li><li>適切な顕微鏡aに麻酔をかけたワームを含む顕微鏡スライドを転送ND 63Xノマルスキー光学系の下で観察します。以下のような特徴に基づいて、モーフのアイデンティティを分類：単一の背側の歯と狭い口の開口部の存在はstenostomatousを示しながら、追加のサブ腹歯の存在は、拡大された背​​側の歯と広口開口部は、eurystomatous口モーフ動物の指標であります動物（ 図1）。 注：動物の健康を維持するために、ワームはわずか5分間寒天パッドの上に維持されるべきです。 </li><li>口のモーフ識別した後、静かにアガロースパッドを、それをオフにスライドさせることにより、カバースリップを除去することにより、必要に応じてeurystomatousまたはstenostomatousいずれかの線虫を回復。慎重アガロースパッドから選択した動物を選ぶ新鮮なNGMプレート上に（ 大腸菌 OP50は、それが粘着性作るためにピックで使用することができます）。通常の運動性の行動は動物がさらなる略奪的アッセイのために準備ができているその上に再開されるまで、麻酔からの回復を可能にします。 </li></ol></li> &lt;LI&gt; ラピッド口表現型 注：別の方法として、より多くの経験と、口のフォームタイプは、高倍率（150X）と実体顕微鏡を介して任意の麻酔薬治療を必要とせずにアッセイすることができます。 <ol><li> E.の細菌叢と標準NGMプレート上で線虫を置き顕微鏡の視野領域上に大腸菌 OP50。 </li><li>口の大きさと幅の差を検出します。注：構造体のような全く歯がしたがって、口のモーフ識別は単に狭い口対広い口に基づいて観察することがない。この倍率では。 </li></ol></li></ol> 2.咬合アッセイ注：噛みアッセイは、詳細な捕食行動分析を可能にします。 <ol><li>成長し、標準的なNGMプレート（6 cm）の上の線虫の文化を維持し、 大腸菌の細菌叢を餌大腸菌 OP50 19。 </li><li> Cなどの選択獲物線虫の幼虫を大量に増殖させることによって、アッセイプレートを作りますエレガンスまたはアルternatively適切な生態学的関連獲物。注：アダルトC.エレガンスは 、幼虫期を使用することが重要ですので、適切な獲物であるには余りにも大きいです。 <ol><li> C.を維持エレガンスまたはEの細菌の芝生の上の標準的なNGMプレートとフィード上の他の潜在的な餌生物人口まで大腸菌 OP50を新たに若いL1幼虫の豊富さで、その結果、飢餓状態にされています。 注：飢餓のための時間は、培養を開始するために使用される線虫の数、 大腸菌の量を含む多数の環境と実験の要因に依存します大腸菌 OP50を加え、周囲温度。 </li></ol></li><li> M9で4以上の新たに飢えた獲物プレートを洗浄し、15mlチューブに収集する前に、すべての大型動物と残りの卵を除去するために、2つの20ミクロンフィルターを通してワームソリューションを渡します。唯一の小さな幼虫は、溶液中に残っている必要があります。 </li><li>幼虫のペレットを形成するためには、1分間377×gでフィルタリング獲物を遠心分離します。 </li><li&gt;無E. 6センチNGMプレート上に純粋なワームペレットのピペット3μlの大腸菌 OP50存在し、幼虫はアッセイプレートを生成するために十分に広がっするために少なくとも30分待ちます。 注：標準のアッセイプレート上の純粋なワームペレットの3μlのは&gt; 3000獲物の幼虫が含まれています。これは、捕食者と獲物の間の頻繁な接触を生成するのに十分です。 </li><li>必要な口のモーフ（プロトコル1）用の画面捕食線虫。 </li><li>アッセイプレート上に正しく分類された捕食者を転送し、標準的なワームピッキング技術と光実体顕微鏡19を使用しました 。細菌汚染を最小限にするために、捕食者を転送するときにアッ​​セイプレートにできるだけOP50細菌を転送するように注意してください。ワームはワームは、転送から損傷していないかを確認するために転送されるのストレスから回復し、野生型の運動性挙動を確認できるようにするために15分を待ちます。 注：Pを餓死する必要はありませんPAC彼らはよく細菌時に供給しながらも、他の線虫の幼虫の非常に効率的な捕食者であるとして、ificus。 </li><li>回復後、10分間の光実体顕微鏡を用いて、捕食者を観察します。この装置では、観察し、そのような獲物の動きを制限する捕食することを特徴と、 噛むなどの個別の給電イベント特徴付ける;ここで、検出された獲物のキューティクルの開放によって、 殺害を 。 給電 、獲物の内臓（ 図2A、B ムービー1）の観察可能な消費によって分類。 </li><li>スクリーニングおよび正確さを保証するために、10個々の捕食線虫の最小値を観察することによって、アッセイを繰り返します。 </li></ol> 3.死体アッセイ注：死体アッセイは略奪行為のより迅速な定量化を促進します。 <ol><li>成長し、標準的なNGMプレート上の線虫の文化を維持し、細菌リットルを餌E.のAWN 大腸菌 OP50 19。前述のアッセイプレートの三連（ - 2.5プロトコル2.1）を生成します。 </li><li>技術をピッキング標準ワームや光実体顕微鏡転送各アッセイプレートに必要な口のモーフと5捕食線虫を用いたプロトコル1で説明したように、必要な口のモーフ用の画面捕食線虫。 2時間獲物と一緒に捕食者を残します。 </li><li> 2時間の画面の後に空になった死体（ 図2BおよびC）の存在についてアッセイプレート。内臓漏れやワームフラグメントを欠落しているなど、明らかな形態学的欠陥と一緒に運動性の欠如によって死体を識別します。 </li></ol>咽頭と歯の移動の4分析<ol><li>成長し、標準的なNGMプレート上の線虫の文化を維持し、 大腸菌の細菌叢を餌大腸菌 OP50 19。前述したようにアッセイプレートを生成します（プロトコル2.1から2.5）。もし標準の6センチメートルNGMプレートは、適切な代替として2ミリリットルNGMを含む小さな35ミリメートルペトリ皿の蓋を使用して、客観的かつ顕微鏡ステージの間に収まりません。 </li><li>必要な口のモーフ用の画面捕食線虫技術を選んで、標準的なワームや光実体顕微鏡を使用したプロトコル1に記載したように、アッセイプレートへのシングル正しく分類さ捕食者を転送します。ワームが転送されるのストレスから回復できるようにするために15分を待ちます。 </li><li>高速度カメラ（ 作品2および3）で、63X Normaski - 40の顕微鏡に捕食動物を観察します。正確な定量を確保するために、少なくとも20匹中50 Hzで15秒以上のレコード咽頭ポンピングと歯の移動、。リプレイは、個々のポンプや歯のイベントをカウントするために、所望の速度で動画を記録しました。 注：歯の移動は、口の開口部において検出可能であり、唯一のOBである一方でポンピングが、咽頭の中央に位置コーパス、で観察されます背側歯から提供。 </li></ol>

<ol><li>Wilecki, M., Lightfoot, J. W., Susoy, V., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predatory+feeding+behaviour+in+Pristionchus+nematodes+is+dependent+on+phenotypic+plasticity+and+induced+by+serotonin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Predatory feeding behaviour in Pristionchus nematodes is dependent on phenotypic plasticity and induced by serotonin.</a> J Exp Biol. 218 (Pt 9), 1306-1313 (2015).</li>
<li>Ragsdale, E. J., Muller, M. R., Rodelsperger, C., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Developmental+Switch+Coupled+to+the+Evolution+of+Plasticity+Acts+through+a+Sulfatase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Developmental Switch Coupled to the Evolution of Plasticity Acts through a Sulfatase.</a> Cell. 155 (4), 922-933 (2013).</li>
<li>Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensation%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Mechanosensation.</a> WormBook. , 1-14 (2006).</li>
<li>Rankin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nematode+behavior%3A+the+taste+of+success%2C+the+smell+of+danger%21%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Nematode behavior: the taste of success, the smell of danger!</a> Curr Biol. 16 (3), R89-R91 (2006).</li>
<li>Beverly, M., Anbil, S., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degeneracy+and+neuromodulation+among+thermosensory+neurons+contribute+to+robust+thermosensory+behaviors+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Degeneracy and neuromodulation among thermosensory neurons contribute to robust thermosensory behaviors in Caenorhabditis elegans.</a> J Neurosci. 31 (32), 11718-11727 (2011).</li>
<li>Kimata, T., Sasakura, H., Ohnishi, N., Nishio, N., Mori, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermotaxis+of+C.+elegans+as+a+model+for+temperature+perception%2C+neural+information+processing+and+neural+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Worm%22%5BJournal%5D)">Thermotaxis of C. elegans as a model for temperature perception, neural information processing and neural plasticity.</a> Worm. 1 (1), 31-41 (2012).</li>
<li>Vidal-Gadea, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetosensitive+neurons+mediate+geomagnetic+orientation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Magnetosensitive neurons mediate geomagnetic orientation in Caenorhabditis elegans.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Chute, C. D., Srinivasan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+mating+cues+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical mating cues in C. elegans.</a> Semin Cell Dev Biol. 33, 18-24 (2014).</li>
<li>Sherlekar, A. L., Lints, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nematode+Tango+Milonguero+-+the+C.+elegans+male%27s+search+for+the+hermaphrodite+vulva%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Nematode Tango Milonguero - the C. elegans male's search for the hermaphrodite vulva.</a> Semin Cell Dev Biol. 33, 34-41 (2014).</li>
<li>Sasakura, H., Mori, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+plasticity%2C+learning%2C+and+memory+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Behavioral plasticity, learning, and memory in C. elegans.</a> Curr Opin Neurobiol. 23 (1), 92-99 (2013).</li>
<li>Avery, L., You, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">C. elegans feeding.</a> WormBook. , 1-23 (2012).</li>
<li>Bumbarger, D. J., Riebesell, M., Rodelsperger, C., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System-wide+Rewiring+Underlies+Behavioral+Differences+in+Predatory+and+Bacterial-Feeding+Nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">System-wide Rewiring Underlies Behavioral Differences in Predatory and Bacterial-Feeding Nematodes.</a> Cell. 152 (1-2), 109-119 (2013).</li>
<li>Dieterich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pristionchus+pacificus+genome+provides+a+unique+perspective+on+nematode+lifestyle+and+parasitism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The Pristionchus pacificus genome provides a unique perspective on nematode lifestyle and parasitism.</a> Nature Genetics. 40 (10), 1193-1198 (2008).</li>
<li>Schlager, B., Wang, X. Y., Braach, G., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Cloning+of+a+Dominant+Roller+Mutant+and+Establishment+of+DNA-Mediated+Transformation+in+the+Nematode+Pristionchus+pacificus%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Molecular Cloning of a Dominant Roller Mutant and Establishment of DNA-Mediated Transformation in the Nematode Pristionchus pacificus.</a> Genesis. 47 (5), 300-304 (2009).</li>
<li>Witte, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+inactivation+using+the+CRISPR%2FCas9+system+in+the+nematode+Pristionchus+pacificus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Gene inactivation using the CRISPR/Cas9 system in the nematode Pristionchus pacificus.</a> Dev Genes Evol. 225 (1), 55-62 (2015).</li>
<li>Lo, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+and+Heritable+Genome+Editing+in+Evolutionarily+Diverse+Nematodes+Using+TALENs+and+CRISPR%2FCas9+to+Engineer+Insertions+and+Deletions%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Precise and Heritable Genome Editing in Evolutionarily Diverse Nematodes Using TALENs and CRISPR/Cas9 to Engineer Insertions and Deletions.</a> Genetics. 195 (2), 331-348 (2013).</li>
<li>Sommer, R. J., McGaughran, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nematode+Pristionchus+pacificus+as+a+model+system+for+integrative+studies+in+evolutionary+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology%22%5BJournal%5D)">The nematode Pristionchus pacificus as a model system for integrative studies in evolutionary biology.</a> Molecular Ecology. 22 (9), 2380-2393 (2013).</li>
<li>Herrmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nematode+Pristionchus+pacificus+%28Nematoda+%3A+Diplogastridae%29+is+associated+with+the+oriental+beetle+Exomala+orientalis+%28Coleoptera%3AScarabaeidae%29+in+Japan%5BTitle%5D)+AND+%22Zoological+Science%22%5BJournal%5D)">The nematode Pristionchus pacificus (Nematoda : Diplogastridae) is associated with the oriental beetle Exomala orientalis (Coleoptera:Scarabaeidae) in Japan.</a> Zoological Science. 24 (9), 883-889 (2007).</li>
<li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Introduction+to+Worm+Lab%3A+from+Culturing+Worms+to+Mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis.</a> J Vis Exp. (47), e2293(2011).</li>
<li>Serobyan, V., Ragsdale, E. J., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+value+of+a+predatory+mouth-form+in+a+dimorphic+nematode%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+R.+Soc.+B+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Adaptive value of a predatory mouth-form in a dimorphic nematode.</a> Proc. R. Soc. B Biol. Sci. 281, 20141334(2014).</li>
<li>Albrecht, D. R., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+behavioral+analysis+of+Caenorhabditis+elegans+in+precise+spatiotemporal+chemical+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-content behavioral analysis of Caenorhabditis elegans in precise spatiotemporal chemical environments.</a> Nat Methods. 8 (7), 599-605 (2011).</li>
<li>Yeminin, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+database+of+Caenorhabditis+elegans+behavioral+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes.</a> Nat Methods. 9 (10), 877-879 (2013).</li>
<li>Raizen, D. M., Lee, R. Y. N., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interacting+Genes+Required+for+Pharyngeal+Excitation+by+Motor+Neuron+MC+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Interacting Genes Required for Pharyngeal Excitation by Motor Neuron MC in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 141 (4), 1365-1382 (1995).</li>
</ol>

著者は、金銭的または競合する利益を宣言していません。

線虫は、Cで神経生物学や行動を理解するための強力なシステムを提供しますエレガンスは、これまでの主要なツールです。 P.含めしかし、多数の線虫種存在しないか、モデル生物C.から複雑で変化pacificus表示行動、 エレガンス 、したがって、これらの行動の進化と規制に関する魅力的な疑問を提起。 P.を含む他の多くの線虫種に見られるそのような追加的行動pacificusは捕食送り1、20に係合することによって、それらの細菌の食事を補うための能力である。そこで我々は線虫で、これらの以前に未分析の捕食行動の簡単かつ迅速な特性評価のための詳細なプロトコルを開発し、説明してきました。 まず、我々は線虫の口の中に装置を供給するのばらつきをスクリーニングするための方法を提供してきました。正しい口のタイプの識別は必須の最初のです成功捕食アッセイのためのTEP少なくともPristionchus属内のみeurystomatous動物が捕食給餌することが可能である、として。それは、この方法のようなプロトコル1.2に記載された「迅速な口の表現型」プロトコルでモーフはるかに低侵襲性であり、したがって、捕食行動が摂動することができることにくい、口を識別するのが最善です。しかし、最初に寒天パッド（プロトコル1.1）で麻酔した動物との識別によって異なる口の構造に慣れることをお勧めします。 希望の口のモーフを同定した後、我々は捕食送を定量化するための2つのアッセイを記載しています。これらは、迅速な高スループット「死体アッセイ」（プロトコル3）であり、より多くの時間は「一口アッセイ」（プロトコル2）を介して、詳細な行動分析を消費するが、より。これらのプロトコルは両方ともexperimenによってアッセイを最適化するためにいくつかの変更を可能にする非常に柔軟ですタル要件。 P.を用いて咬合アッセイのためC.上のpacificusの捕食者エレガンスの餌は、10分の時間ウィンドウの捕食行動の相互作用の観察は、他の摂食イベントと共に咬傷のかなりの量を定量化するのに十分でした。もう一度Pを利用した「死体アッセイ」とは、 C.上のpacificusの捕食者エレガンスの獲物は、2時間5捕食者は、迅速な行動解析を可能にし、容易に定量化し、一貫性のある死体の数を生産しました。しかし、それは異なる速度で捕食線虫の動きの異なる種を注意すべきである、異なる速度で食べて、一般的に他の行動1に大きな多様性を実証します。さらに、異なる餌の種も同様の理由のために異なる速度で食べてもよいです。したがって、捕食者と獲物として、また、環境条件の違いのために、両方の試験された線虫種に基づいたアッセイを最適化することをお勧めします。 「かま」と「軍団の両方の間ストレスやけがの捕食者が効率的に殺すことはありませんように獲物と捕食者の両方が、健康であることが重要である。また、新鮮なアッセイプレートは古いプレートとして必要不可欠であるe」のアッセイは悪影響誤っにつながる線虫の健康に影響を及ぼしているかを乾燥させてしまうことができますアッセイ。Cで観察された多くの行動を調査するためになされたものであり、これらの捕食アッセイの将来の反復は、分析の多くを自動化するために、技術の最近の進歩を活用できるようになることも期待されている21、22 エレガンス 。現在、問題は、彼らが捕食摂食を阻害する可能性が高いマイクロ流体室に分離し、固定化を行うこと、連絡することをはるかに敏感現れるなどのP. pacificusとして線虫において発生する可能性がある。これを克服困難な証明するかもしれないが、微妙な捕食のためにスクリーニングするために、個々の線虫を容易にするであろう行動。 最後に、我々はまた、foの方法を提供してきましたR高速カメラ（プロトコル4）を使用して歯と咽頭ポンピング速度を定量することによって捕食および細菌給電モードとの間の比較を容易にする線虫供給装置自体を調べます。 C.中咽頭ポンピング速度の定量化エレガンスは、C、しかし、長年23給監視するために利用されていますエレガンスは、口の歯状突起の任意のフォームを欠いており、また、捕食行動を欠いています。歯活性のものと咽頭ポンピングの定量を組み合わせることを通じて、捕食に特定の歯の任意の神経支配も観察することができます。動物はしばしば、焦点面の外に移動し歯の移動を観察するために必要な倍率に、したがって、短い時間窓のための歯を観察する通常のみ可能です。また、C.とは異なり、 エレガンス 、Pの咽頭pacificusは、継続的にむしろそれがポンピング及び給餌の呪文に従事し、ポンプはありません。そのため、正確な咽頭PUM用ピング速度決定する供給しながら、連続供給の15秒を記録することが重要です。 したがって、ここで紹介するこれらの方法は、線虫のシステムで捕食行動を調査するための第1のフレームワークを提供します。また、彼らはまた、微生物、真菌およびダニなどの捕食に加えて、生態学的に関連する生物の影響を含む、線虫の生態系内の他の相互作用を調査する際に使用するために適応することができます。したがって、彼らはまた、彼らの生態学的意義を、これらの捕食行動は、規制されているそれらがどのように進化してきたことがどのように分析する手段を提供します。

その小さいながらも複雑な神経系との線虫は行動を含む神経生物学の多くの側面を理解するための強力なツールを証明しています。この研究の多くは、異なる挙動の富が正常解剖と分析されたモデル生物線虫（Caenorhabditis elegans）に焦点を当てています。これらは3、走化性4、thermotactic 5,6と走磁性7は 10と給電行動11の学習、8,9を交配影響を与える機械刺激が含まれます。しかしながら、他のより遠縁の線虫種はrhabditid C.において観察されていない行動を表示しますエレガンスまたは代替的には、彼らの進化と規制に関する適切な質問を提起複雑さの追加レベルを示しています。このような1つのインスタンスは、はるかに複雑給電することが表示され遠縁diplogastrid線虫Pristionchus pacificus、で観察することができますC.で観察されるよりもhaviorsとリズム両種は、相同な咽頭ニューロン12を共有するにもかかわらず、 エレガンス1。です。これらの追加の摂食行動、P.と一致彼らはまた、他の線虫の幼虫に供給することにより、それらの細菌の食事を補うことのできる熱心な捕食者であるとしてpacificusはまた、拡大食事の範囲を表示します。幸いなことに、P。 pacificusは、比較と統合進化生物学のモデルとして開発されているので、多くの分子および遺伝学的ツールが利用可能になりました。これらは、その新たに発見された姉妹種を含む25以上の近縁種と導入遺伝子14およびCRISPR / Cas9 15,16だけでなく、詳細かつ十分に注釈を付け系統発生17を含む分子や遺伝子ツールを完全に配列決定し、注釈付きのゲノム13が含まれます。また、多数のPristionchus種の生態は、Pを含みますpacificusは、私たちです多くの種で定義されたllが今スカラベカブトムシとnecromenic協会、彼らは頻繁に他の線虫種18と共有するホストを共有して説明した。P. pacificusは、したがって、小説行動の進化とその生態学的意義を分析する優れたモデル系を提供します。 このようなP.などの線虫種における捕食摂食行動を分析するために、 pacificusは、我々は簡単に観察し、捕食行動の定量化のためのいくつかの新規な行動アッセイを開発しました。 P.としてpacificusは強く正しい形態型の識別が不可欠1,2である、捕食行動に影響を与える二形口の構造が表示されます。狭い口のstenostomatousモーフは、単一の鈍背側の歯が含まれており、任意の捕食送りに従事していません。また、広口eurystomatousモーフは、はるかに大きな爪状の背側の歯と反対側の追加を含み一緒に効率的に獲物のキューティクルを開くように動作するサブ腹歯、。非捕食stenostomatous形に捕食eurystomatousの比率は、P内でもPristionchus種間で異なり、 pacificus、しかし、eurystomatous口の割合はP.にモーフィング90％2 - pacificus野生型株（PS312）は、通常70です。また、口の形比は（飢餓といくつかの小さな分子のシグナル伝達だけでなく、未知の要因を含む両方が知られている、）環境の影響の違いに応じて変動することができ、このように捕食eurystomatous口の形の正確な同定および単離は、成功した捕食性アッセイのために不可欠です。 捕食口の形の記述と並んで、私たちは、直接観察や、かむ殺害し、イベントを供給するなどの捕食行動の定量化のための「一口アッセイ」を開発しました。ここで獲物の線虫は、フィルタを介して分離されています新たに飢えた文化のると捕食成人Pにさらさ短い時間スパンで一緒に観察されるpacificus、。また、我々はまた、捕食イベントの間接的な観察によって捕食行動の迅速なスクリーニングを容易にするためのハイスループット「死体アッセイ」を開発しました。これは、捕食のためにスクリーニングするためのツールと​​して、幼虫の死体の存在を利用しています。両アッセイは、P.などの線虫種で略奪行為を観察し、測定するための簡単かつ再現性の高い方法を提供しますpacificus。

<table><tbody><tr><td>ナイロンネットフィルター(20 &#181;m)</td><td>Merck Millipore Ltd</td><td>NY2004700</td><td>獲物として使用するために幼虫を残すだけのワームをろ過するために使用されます。</td></tr><tr><td>フィルター用PP漏斗(54mm)</td><td>デュラン292215003</td><td></td>獲<td>物として使用するために幼虫を残すだけでワームをろ過するために使用されます。</td></tr><tr><td>小型シャーレ(35/10mm)</td><td>Greiner Bio-One&nbsp;</td><td>627102</td><td>高速カメラでのイメージング</td></tr><tr><td>用 Zeiss SteREO Discovery V12</td><td></td><td></td><td>口形状識別用</td></tr><tr><td>Axio-Imager A1</td><td></td><td></td><td>口形状識別用</td></tr><tr><td>ガラススライド</td><td>Roth</td><td>H869</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>Roth</td><td>657</td><td></td></tr><tr><td>モーションスコープ M3 ハイスピードカメラ</td><td>IDT</td><td></td><td>ハイスピードカメラ</td></tr><tr><td>ビデオズーム 44 ENG 1/2" 0.5X から 2.4X</td><td>Zeis</td><td>452984-0000-000</td><td>高速カメラズーム</td></tr><tr><td>線虫成長培地 (NGM) 成分:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>寒天</td><td></td><td>Roth 5210.2</td><td>CAS-Nr. 9002-18-0</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム (NaCl)</td> <td>Roth</td><td>3957</td><td>CAS-Nr. 7647-14-5</td></tr><tr><td>バクトトリプトン</td><td>BD</td><td>211699</td><td>ロット 4316614</td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物 (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td>CAS-Nr. 10035-04-8</td></tr><tr><td>ラノリン由来コレステロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F 26732 00050</td><td>CAS-Nr. 57-88-5</td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム七水和物 (MgSO4)</td><td>Merck</td><td>1,058,861,000</td><td>CAS-Nr. 10034-99-8</td></tr><tr><td>リン酸二水素カリウム (KH2PO4)</td><td>ACROS organics</td><td>271080025</td><td>CAS-Nr. 7778-77-0</td></tr><tr><td>6 cm ペトリ皿</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628102</td><td></td></tr><tr><td>3.5 cm シャーレ</td><td>Greiner Bio-One</td><td>627102</td><td></td></tr><tr><td>M9 成分:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸二水素カリウム (KH2PO4)</td><td>ACROS organics</td><td>271080025</td><td>CAS-Nr.7778-77-0</td></tr><tr><td>リン酸水素ナトリウム七水和物 (NaHPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9390-500G-D</td><td>CAS-Nr. 7782-85-6</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム (NaCl)</td><td>Roth</td><td>3957</td><td>CAS-Nr. 7647-14-5</td></tr></tbody></table>

で捕食摂食行動を分析します<em&gt; pristionchus</em&gt;およびその他の線虫

Assaying Predatory Feeding Behaviors in Pristionchus and Other Nematodes

このプロトコルは、線虫の捕食行動の分析と定量化のための複数の方法を提供します。Pristionchus pacificusを含む多くの線虫種は複雑な行動を示し、その中で最も顕著なのは他の線虫の幼虫の捕食です。しかし、これらの行動はモデル生物Caenorhabditis elegansには存在しないため、信頼性の高い行動アッセイの開発とともに、これまで詳細に説明されたのはごく最近のことです1。これらの捕食行動は、表現型的には可塑的だが固定された口の形態に依存しているため、これらの動物の正しい識別と分類が不可欠です。P. pacificusには、狭窄孔器と尿口腫の2つの口のタイプがあり、口の広い尿道腫のみが余分な歯を含み、他の線虫の幼虫を殺すことができます。サイズが一致した獲物の幼虫を豊富に分離し、その後捕食性線虫に曝露することにより、正しく同定された口型線虫に対する「死体アッセイ」および「噛み合わせアッセイ」の両方を含むアッセイが可能である。これらのアッセイは、捕食成功率を迅速に定量化し、捕食活動に従事する個々の線虫の詳細な行動分析を提供する手段を提供します。また、ハイスピードカメラを使用することで、歯やポンピングのダイナミクスを含む咽頭活動の変化を可視化することも可能です。

<html> P.で適切な口のモーフの成功同定後行動を殺すに従事するのみeurystomatous動物とpacificus、eurystomatousとstenostomatous動物との間に明確な違いを検出することができる（ 図3）。 stenostomatous動物ではこの動作は完全に抑制されているようです。さらに、細菌や獲物にeurystomatous動物の歯の活動や咽頭ポンピングの違い（ 図4と作品2および3）にも明らかです。捕食送りながら、ポンピング速度は、細菌供給および歯の移動は、咽頭ポンピングと1の比率に1で検出された時に観察されるものより小さくなります。これは、異なる食事に対する行動応答を調節する重要な調節メカニズムの潜在的指標です。 S / ftp_upload / 54404 / 54404fig1.jpg &quot;/&gt; 図1. P. pacificusは 摂食行動の影響口二形を持っています。 （A）eurystomatous口の形を捕食することが可能であり、大きな爪状の背側の歯（偽色の赤）と（B）大反対側のフック状のサブ腹歯（偽色の青）との広口開口部を有しています。 （C）stenostomatous口の形は、細菌のみを餌にすることができ、フリント状の背側の歯（偽色の赤）と（D）なしサブ腹歯（*）の付いた狭い口の開口部を有しています。 Normaski画像は63Xであり、スケールバーは10μmで表す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54404/54404fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54404/54404fig2.jpg" /> <strオング&gt;図2. 捕食アッセイ。（A）P. pacificus刺さと、Cなどの他の線虫の幼虫を殺しますエレガンス（B）アッセイをかむために、bitesby捕食者（*）の数は、光実体成功殺害を使用し、また記録されたイベントを供給観察することができます。死体もはっきりと見える（丸）である。死体アッセイ、幼虫の死骸（矢印）については（C）は、容易に生きた幼虫に比べて同定することができます。スケールバーは、Bで1ミリメートルとCの150μmで表し<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54404/54404fig2large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54404/54404fig3.jpg" /> 図 Cにかまと死体アッセイの 3. 結果エレガンス獲物。 （A）噛み現象が明らかです<html>この動作とeurystomatous口の形でstenostomatous動物では表示されません。エラーバーは10回の標準偏差を表している。（B）stenostomatous動物から明らかなし痛烈な行動と一致、死体のアッセイはまた、唯一のeurystomatous動物のアッセイプレート上の死骸が明らかにしました。エラーバーは、5反復の標準偏差を表している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54404/54404fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54404/54404fig4.jpg" /> eurystomatous動物を捕食送りに従事している間に、図4 捕食摂食時のレートと歯の移動をポンピングEurystomatous。歯の移動のみが観察されます。これはまた、咽頭ポンピングの減少と一致します。エラーバーは、10反復の標準偏差を表します。<html> href = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/54404/54404fig4large.jpg&quot;ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="映画1" src="/files/ftp_upload/54404/54404movie1.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54404/Movie_1_Killing_behaviour.mp4">ムービー ライト実体顕微鏡を使用してかまアッセイのための行動を殺すの 1 観測。（右クリックしてダウンロード）。</a> <img alt="ムービー2" src="/files/ftp_upload/54404/54404movie2.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54404/Movie_2_HS_Camera_Killing.mp4">P.の映画2.高速カメラムービーC.を殺すpacificus エレガンス幼虫。（右クリックしてダウンロード）。</a> 広告/ 54404 / 54404movie3.jpg &quot;/&gt; <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54404/Movie_3_HS_pumping_and_tooth.mp4">映画3.捕食中に歯の移動の高速カメラのズームイン。（右クリックしてダウンロード）。</a>

行動アッセイは、ニューロンの機能を理解するための強力なツールを提供します。ここでは、モデル線虫Pristionchus pacificusとその近縁種に見られる捕食性摂食行動を定量化するためのいくつかのプロトコルを紹介します。さらに、口の構造や歯を含む捕食性の摂食適応を分析する方法を提供します。

で捕食摂食行動を分析します<em&gt; Pristionchus</em&gt;およびその他の線虫

This protocol provides multiple methods for the analysis and quantification of predatory feeding behaviors in nematodes. Many nematode species including ...

これらの手順の全体的な目的は、いくつかの新しいアッセイを用いることで、捕食性線虫の複雑な摂食行動を確実に分析することです。これらの手法は、新規の複雑な行動の調節や、その進化など、行動神経生物学分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。これらの技術の主な利点は、サテライトモデル生物であるPristionchus pacificusを含む線虫の捕食摂食行動を観察し、定量化するための、迅速で容易に再現可能な方法を提供することにあります。線虫の口器の形態を可視化するために、まず、作りたての2%アガロースパッド上で、軽度の麻酔処理により線虫を固定します。パッドを作成するには、3 mLの融解アガロースに10%アジ化ナトリウム溶液を10 µL慎重に添加し、十分に混合します。アジ化ナトリウムは反応性が高く毒性があるため、適切な予防措置を講じてください。次に、混合液を300 µL以上、標準的なガラス製顕微鏡スライドの中央に滴下し、別のスライドを用いてアガロースを平らにします。パッドを使用する直前まで、上のスライドをそのままにしておきます。パッドを使用する準備をするには、上のスライドを取り除き、M9を1滴加えます。その後、線虫を2〜3匹選び、滴下した液中に置き、慎重にカバーガラスを被せます。63倍のノマルスキー光学系を用いて虫体を観察し、形態的アイデンティティを分類します。背側歯の肥大、追加の亜腹側歯、または幅広に拡大した口開口部は、すべて広口型（eurystomatous）動物の特徴です。一方、単一の背側歯とより狭い口開口部は、狭口型（stenostomatous）動物であることを示します。5分以内に、線虫を麻酔パッドから取り出します。カバーガラスをゆっくりと滑らせるように外し、新鮮なMGMプレートに移します。さらなる解析を行う前に、線虫が運動性を示すまで待ちます。習熟すれば、麻酔処理なしで形態の解析が可能です。標準的な培養プレートから10〜20匹の線虫を、OP50細菌を塗布した新しいプレートに転移させ、高倍率の実体顕微鏡を用いて口部の形態を迅速に表現型解析します。その後、口のサイズと幅の違いを検出します。この倍率では歯のような構造は観察できないため、口の形態は幅に基づいて識別します。これにより、広い口と狭い口を区別します。C.elegansの幼虫段階や、生態学的に適切な獲物となる線虫の幼虫など、選択した獲物線虫の幼虫を大量に培養してアッセイプレートを作成します。獲物種のプレートを4枚以上、飢餓状態にしてL1幼虫を回収します。その後、プレートをM9で洗浄し、回収物を20 micronのフィルターで2回ろ過します。これにより、溶液中には小型の幼虫のみが残ります。幼虫を377 gで1分間遠心分離してペレットにします。M9上清を廃棄ビーカーに除去し、純粋な線虫ペレットを3 µL分取します。E.coliを含まない6 cmのMGMプレートの中心に線虫を配置し、約30分間分散させます。その後、これらの幼虫を摂食試験に使用します。捕食者を、OP50細菌をできるだけ少なく含ませた状態でアッセイプレートに転移させます。P.pacificusの場合、プレートに5匹の捕食者を加えます。移動させた動物がストレスから回復するまで、15分間待ちます。15分後、線虫が通常通りに動き回っているか、あるいは損傷しているかを確認します。その後、捕食者1匹による個別のイベントを10分間観察し、記録します。咬合は、捕食者が獲物の動きを制限することによって特徴付けられます。獲物のクチクラが開放されたときに致死となります。摂食は、獲物の内臓が消費されるのが観察されることによって特徴付けられます。正確性を確保するため、少なくとも10個体の捕食性線虫を観察します。咽頭のポンプ動作および歯の動きは、Nomarski光学系を用いて40〜63倍の倍率で観察し、50 Hzの高速度カメラで記録できます。少なくとも20個体の動物について15秒間のクリップを記録した後、ビデオを信頼性高く分析することが可能です。咽頭の中央に位置する体部において、ポンピング（拍動）が観察されます。歯の動きは口の開きで検知でき、背面側の歯でのみ観察されます。捕食から2時間後、プレート内に空の死骸がないかを確認してください。運動性の欠如、および内臓の流出や虫体断片の欠損などの明らかな形態的欠陥に基づいて、死骸を特定します。P.pacificusにおいて適切な口形態の特定が完了した後、広口型（eurystomatous）と狭口型（stenostomatous）の個体間に明確な差が観察されました。殺傷行動を示したのは広口型の個体のみでした。さらに、細菌を摂食する場合と獲物を摂食する場合とでの、広口状（eurystamatous）動物の歯の活動および咽頭ポンプの動作の違いも明確に現れます。捕食的な摂食時には、ポンプ速度は細菌摂食時に観察される値よりも低下し、歯の動きは咽頭ポンプと同期します。このビデオを視聴することで、サテライトモデル生物であるPristionchus pacificusを含む線虫において、複雑な捕食摂食行動を特性づけるために、これらの異なるアッセイをどのように組み合わせるかを十分に理解できるはずです。

assaying-predatory-feeding-behaviors-pristionchus-other

Research

JoVE Journal

Environment

環境

このビデオでは、線虫C.エレガンスの走化性を紹介し、硫酸銅に対する走化性回避をテストするサンプルプロトコルを示しています。...

C.エレガンス走化性アッセイ:線虫の化学感覚を試験する方法

このビデオでは、トランスジェニック線虫モデルにおける化学回避行動を調べるための浸透圧回避アッセイについて説明しています。回避行動は、高浸透圧バリアと化学誘引剤の存在下でプレートでテストされます。ニューロンの機能的喪失を患った線虫は、走化性物質に引きつけられ、高浸透圧障壁を通過し、麻酔薬の溶液のためにトラップゾーンで麻痺します。...

浸透圧回避アッセイを用いたトランスジェニック線虫の化学回避挙動の検討

昆虫病原性線虫、昆虫の広い範囲に寄生する土壌に生息する回虫です。それぞれ、土壌サンプル、感染昆虫死体から線虫の回復のために、昆虫苦しませると変更されたホワイトトラップ：我々は2つ​​の技術を使用した土壌からこれらの線虫を分離するために使用されるサンプリング方法を示しています。...

土壌のサンプリングと昆虫病原線虫の分離（Steine​​rnematidae、Heterorhabditidae）

マツノザイセンチュウ、Bursaphelenchus xylophilusの交配行動を調査するためのプロトコルが提示されます。B.

パインウッドセンチュウの交配挙動の観察と定量化、マツノザイセンチュウ

ここでは、有機体がよく摂食された状態から飢えた栄養状態に進行するにつれて、銅回避行動の変化および共通の食物源を見つける能力を評価するために設計されたCaenorhabditis elegans特異的アッセイを提示する。...

A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt;栄養状態ベースの銅回避アッセイ

本発明者らは、集団ベースアッセイにおいて可溶性化合物に対するCaenorhabditis elegansの選好を自動的に分析することができる行動記録設定およびプロトコルを提示する。この記事では、ビヘイビアチェンバーの構築、ビヘイビアアッセイプロトコル、およびビデオ分析ソフトウェアの使用について説明します。...

線虫集団ベースの化学感覚嗜好アッセイの自動解析

このプロトコルは、現場の天然基質から生きた線虫を効率的に抽出する方法を概説する。...

ベアマン・ファネルによる野生の線虫の迅速な分離

このプロトコルは、自己発症 性Caenorhabditis...

自己 カエノールハブディティス 線虫の生態学的調査を行うための高度にスケーラブルなアプローチ

Caenorhabditis elegans は生物学の主要なモデル種の1つですが、ほとんどすべての研究は、その自然に関連する微生物の不在下で行われています。ここで説明する方法は、将来の機能的 C.エレガンス...

モデル線虫の天然微生物叢の分離と特性評価

ここでは、ドッグフード寒天培地を用いて線虫を一括培養し、線虫の集団行動を研究するシステムについて報告する。このシステムにより、研究者は多数のダウアーワームを繁殖させることができ、 Caenorhabditis elegans やその他の近縁種に適用できます。...

線虫の集団行動研究のための線虫の大規模培養

この研究では、ラジカルベースの方法と in vitro 卵孵化アッセイ (EHA) を使用して Tithonia diversifolia...

in vitroアッセイを用いた消化管線虫卵に対するTithonia diversifolia抽出物の抗酸化および駆虫特性の評価

学ぶ捕食摂食行動の解析法をPristionchus pacificusなどの線虫で。口器形態の可視化、咬傷アッセイ、高速カメラによる行動記録を含む手法で、行動神経生物学の研究に応用できます。

で捕食摂食行動を分析します

さらに動画を探す