ゼブラフィッシュ胚からの内因性受容体の親和性ラベリング検出

この手順の全体的な目標は、選択した受容体のアフィニティー標識の選択性と感度をその放射性リガンドと組み合わせることで、ゼブラフィッシュの胚における低存在量の成長因子受容体を検出することです。この方法は、受容体の発現レベルやその生化学的特性など、発生生物学分野の質問に答えるのに役立ちます。AFLIPと名付けられたこの方法は、ゼブラフィッシュの発生研究に確立された細胞生物学技術であるアフィニティーラベリングの強力な記述的性質を拡張します。

この手順を開始するには、各状態に対して100〜200個の胚を収集し、魚の水が入ったシャーレに入れます。次に、先端の細い鉗子を使用して胚を手動でデコリオネートし、標的受容体を消化する可能性があるため、プロナーゼまたは他のプロテアーゼの使用をプロトコル全体で避けます。次に、胚を1.5ミリリットルのマイクロチューブに入れ、1X PBSで2回洗浄します。

次に、500マイクロリットルのデヨールキングバッファーを追加します。溶液中の胚を約30〜40回上下に穏やかにピペッティングすることにより、卵黄の大部分を放出します。72 HPFおよび48 HPF胚の場合、それぞれ青色および黄色のピペットチップを使用します。

胚の破壊を避けるために、黄色の先端をわずかにカットする必要がある場合があります。卵黄の放出が成功したかどうかは、顕微鏡で胚を観察することで確認できます。卵黄の除去は、卵黄、脂質、タンパク質がその後のリガンドまたは抗体の結合ステップを妨げる可能性があるため、可能な限り完全でなければなりません。

その後、600 x gで15秒間遠心分離することにより胚を回収します。ピペットを使用して上清を慎重に捨てます。次に、胚を500マイクロリットルの洗浄バッファーで、最低速度で穏やかにボルテックスすることにより、胚を2回洗浄します。

次に、600 x gで15秒間遠心分離することにより、胚を回収します。ここからは、摂氏4度で手続きを続けます。上清はピペットで慎重に捨てます。

その後、胚を350マイクロリットルの溶解緩衝液に懸濁させ、プラスチック乳棒を用いて胚を均質化します。次に、溶解した胚を試験管ロッカーで摂氏4度の攪拌を行いながら30分間インキュベートします。次に、溶解した胚を11, 000 x gで15分間遠心分離し、不溶性の破片を除去します。

その後、透明にした上清を新しいチューブに移します。Bradford タンパク質アッセイとプロテッティー検量線により、総タンパク質を測定します。このステップでは、1.5ミリリットルのマイクロフュージチューブに400〜500マイクログラムの全胚タンパク質を入れ、バッファー1で1マイクロリットルあたり1マイクログラムに希釈します。

次に、ヨウ素-125標識TGF-β IIストックを添加して最終濃度150ピコモルにし、試験管ロッカーで4°Cで2時間攪拌しながらインキュベートします。その後、目的の受容体に対する未希釈の抗体を添加して、1:100の希釈にします。その後、摂氏4度でさらに2時間または一晩インキュベーションを続けます。

インキュベーション後、50マイクロリットルの適切な免疫グロブリン結合ビーズを加え、試験管ロッカーで摂氏4度の攪拌を行いながら50分間インキュベートします。次に、11, 000 x gで20秒間の微量遠心分離によってビーズを回収し、上清を適切な放射性ゴミ箱に捨てます。続いて、11, 000 x gの微量遠心分離でボルテックスすることにより、1ミリリットルのIP洗浄バッファーでIPビーズを3回洗浄します。

次に、IPビーズを250マイクロリットルのIP洗浄バッファーに再懸濁します。新鮮なDSS溶液を準備し、サンプルに1.5マイクロリットルを加えます。その後、攪拌しながら試料を摂氏4度で15分間インキュベートします。

架橋反応をクエンチするために、pH 7.4で十分な塩化トリストストックを補充した500マイクロリットルのIPウォッシュバッファーを添加して、25ミリモルの塩化トリストに到達させます。次に、11,00 x gで20秒間遠心分離し、IPビーズを回収します。その後、上清を捨て、IPビーズを30マイクロリットルの還元性レムリバッファーに再懸濁します。

次に、SDS-PAGEゲル電気泳動の前にサンプルを摂氏94度で5分間煮沸し、乾燥したゲルをリン光計または従来のオートラジオグラフィーで分析します。この図は、AFLIPで得られた代表的な結果を示しています。72 hpfおよび48 hpfの胚から抽出した全タンパク質を、ヨウ素-125 TGF-β II親和性標識にかけた後、ウサギ抗ゼブラフィッシュBGまたはウサギ抗ラットBGを対照としてIP化しました。

オートラジオグラフィーでは、BGはGAGなしで、またはグリコサミノグリカン修飾BGとして検出できます。この図は、実験的操作(この場合はモルフォリノ注射に対するベタグリカンの減少)を受けた胚における特定の受容体の発現レベルを測定するためにAFLIPをどのように使用できるかを示しています。レーン1は、72 hpfの野生型胚におけるTGFベータ受容体IIIのレベルを示し、レーン2は、ZFPG一次転写産物のエクソン2-イントロン2境界に向けられた7ナノグラムのモルフォリノを投与する効果を示しています。このモルフォリノで得られるBGダウンレギュレーションは、そのミスマッチコントロールによって再現されないことに注意してください。

これらの結果から、このモルフォリノで得られた表現型は、前述のようにTGFベータ受容体IIIのノックダウンに特異的であることが確認されました。AFLIPが成長因子またはサイトカイン受容体を検出することが成功するかどうかは、その受容体に結合して架橋できる放射性標識リガンドの利用可能性にかかっています。また、免疫沈降に適した抗体も必要です。

このテクニックを習得すると、適切に実行すれば2日で完了します。AFLIPはウェスタンブロットの転写ステップを回避するため、高グリコシル化受容体の検出を強化することができます。そして、ここでは、ウェスタンブロットで非常に非効率的に移動するプロテオグリカンβグリカンについて見てきました この手順に続いて、電気泳動技術によって明らかにされる限り、追加の翻訳後修飾を記述するために酵素消化などの他の方法を実行できます。

このビデオを見れば、AFLIPが免疫沈降に関連するアフィニティー標識により、いくつかの魚の胚における存在量の少ない受容体の検出にどのように役立つかを十分に理解できるはずです。最後に、ヨウ素125の取り扱いは、注意と適切な保護をもって行う必要があることを忘れないでください。あなたの実験に頑張ってください。