Name: ゼブラフィッシュ胚からの内因性受容体の親和性ラベリング検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: 学ぶAFLIP法によるゼブラフィッシュ胚の低発現成長因子受容体検出技術。親和性ラベリングと免疫沈降を組み合わせ、発生生物学における受容体動態研究に有用な方法を解説します。

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著者は、魚の世話とメンテナンスをしてくれたジルベルト・モラレスに感謝し、ウサギの予防接種に協力してくれたクラウディア・リベラ博士とヘクター・マラゴン博士(IFC-UNAM動物施設)に感謝します。この研究は、CONACYT 131226とPAPIIT-DGAPA-UNAM IN204916からの助成金によって支援されました。

FLC40-14：動物で行わ全ての実験はCICUAL-プロトコル番号の下、メキシコ自治大学（UNAM）の実験動物管理使用委員会によって承認されました。 （CICUAL：「ComitéInstitucionalパラエルCuidado yの嘘・デ・ロス・Animales・デ・ラボラトリ・デル・研究所・デ・FisiologìaCELULAR、ナショナル大学自治・デ・メキシコ」）。 胚のタンパク質抽出物の調製<ol><li>各条件は、例えば72時間後に受精（HPF）のために、所望の段階で（モルファント対野生型）を比較するための200の胚 - 100を収集します。 </li><li>先の細いピンセットを使用して場所の魚の水を含むペトリ皿中の胚（ 表1参照）、手動dechorionate胚。それは、標的受容体を消化することができるように、この段階（またはプロトコルを通じて、他のプロテアーゼ）中にプロナーゼを使用しないでください。 </li><li> 1.5mlマイクロチューブに入れ胚と胚TWを洗います1×リン酸緩衝溶液（PBS）と氷（ 表1参照）。 </li><li> （ 表1を参照）deyolk用緩衝液500μlを追加します。 </li><li> （ - 40倍、約30）溶液中で胚を優しく上下にピペッティングにより卵黄のほとんどをリリース。 72 HPFと48 HPFの胚については、それぞれ、青と黄色のピペットチップを使用します。黄色のヒントが少し胚を壊さないようにカットする必要があるかもしれません。成功した卵黄の放出は、顕微鏡下で胚を観察することによって確認することができます。 </li><li> 15秒間600×gで遠心分離することによって胚を収集します。 </li><li>ピペットを使用して、慎重に上清を捨てます。 </li><li>洗浄胚は二回500μlの洗浄バッファーで穏やかに最低速でボルテックスすることによって（ 表1参照します）。 </li><li> 15秒間600×gで遠心分離することによって胚を収集します。 </li><li>ここから出発し、4°Cで手順を続行します。 </li><li>ピペットを使用して、慎重に上清を捨てます。 </li><li>溶解バッファー350μlの再懸濁胚（表1を参照）、プラスチック製乳棒を用いて均質化します。 </li><li> 4°Cで試験管ロッカーに溶解させた胚を攪拌しながら30分間インキュベート。 </li><li>遠心分離機は、不溶性の破片を除去するために15分間、11,000×gで胚を溶解しました。 </li><li>転送が新しいチューブにピペットを用いて上清をクリア。 </li><li> Bradfordタンパク質アッセイ4、または他の適切な手順により総タンパク質を決定します。 Bradfordアッセイを使用している場合、彼らは4標準タンパク質の過小評価を引き起こすように、溶解緩衝液中の界面活性剤の提示の等価な濃度の存在下で較正曲線を実行します。 </li></ol> 2.検出内因性受容体タンパク質の<ol><li> 親和性標識および免疫沈降（すべての手順4 O Cで） <ol><li> 1.5mlマイクロチューブに総胚タンパク質の500μgのバッファ1（ 表1を参照）を1μg/μlに希釈する- 400を置きます。 注：総胚タンパク質500μgのを得るためには、約100から200胚が最初に処理されなければなりません。 72 HPFの胚は、日常的にβグリカンの検出のために十分である総胚タンパク質、の〜5μgのをもたらします。 </li><li>試験管ロッカーに150 PMの最終濃度に達すると攪拌しながらインキュベートし、4℃で2時間標識TGF-β2株式の十分なボリュームを追加します。 AFLIPが開始される前にCheifetz ら 5によって説明したように、TGF-β2は、クロラミンT法によって125 Iで標識されなければなりません。 注意：使用して私は、リガンドを標識した125の処理中に露出を最小限にするためにシールド。 </li><li> 100希釈および（インキュベーションは、O / Nであってもよい）4℃でさらに2時間インキュベーションを継続：1に到達するために、目的の受容体に対する希釈していない抗体の十分なボリュームを追加します。これは、この研究で使用され、他の場所3を説明するが、ANの品質に応じて、抗血清＃31の最適希釈でありますtibody、より大きいまたはより小さい希釈が最適であってもよいです。 </li><li>適切な免疫グロブリン結合ビーズの50μlを添加（例えば、以前にTNTEで平衡化し、1再懸濁させたGタンパク質セファロース、：TNTEで元の体積の5）と4℃で試験管ロッカー上で撹拌しながら50分間インキュベートしますC. </li><li> 20秒間11,000×gで微量遠心によってビーズを回復。 </li><li>適切な放射性ゴミ容器に上清を捨てます。 </li><li> 20秒間11,000×gで毎回ボルテックスし、微量遠心することにより、（ 表1を参照）IP洗浄緩衝液1mlでIP-ビーズを3回洗浄します。 </li><li> IP洗浄緩衝液250μlの中に再懸濁したIP-ビーズ。 </li><li> （10 mg / mlとでDMSOに溶解したDSS、​​）ジスクシンイミジルスベレートの1.5μlを添加します。ちょうどこの段階でその使用前にDSS溶液を調製します。 </li><li>攪拌しながら4℃で15分間インキュベートします。 </li><li>架橋反応をクエンチするために、500μlのOを加えます十分トリス-Cl pH7.4の在庫を補充したF IP洗浄緩衝液は、25mMのトリス-Clに到達します。トリス中の遊離アミノ基が未反応のDSSをキャプチャします。 </li><li> 20秒IP-ビーズを収集し、上清を廃棄するための11,0​​00×gで遠心分離します。 </li><li>再懸濁IP-ビーズLaemmliバッファーを減らす30μlのインチ</li><li>沸騰サンプル94℃で5分間。 </li><li>必要に応じて、製造業者のプロトコルを使用して、ガンマカウンターでサンプルを分析します。 </li></ol></li><li> 試料分析 <ol><li>変性SDS-PAGEの対象サンプル。受容体の質量のための適切な割合でポリアクリルアミドを使用し、標準的な手順の下でゲルを実行します。 </li><li>固定液中でゲルを浸し、室温で30分間（ 表1参照）。 </li><li> 15分間蒸留水でゲルを洗浄してください。 </li><li>以前に水和ろ紙にゲルを置き、サランラップフィルムでカバーしています。 </li><li> 1時間80℃で乾燥ゲル。 </li><li>白ホスホイメージャSCREにゲルを公開RT O / Nでアン。 </li><li>製造業者のプロトコルを使用して、ホスホイメージャを用いて露光画面をスキャンします。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>López-Casillas, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+expression+of+the+membrane+proteoglycan+betaglycan%2C+a+component+of+the+TGF-%CE%B2+receptor+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structure and expression of the membrane proteoglycan betaglycan, a component of the TGF-β receptor system.</a> Cell. 67 (4), 785-795 (1991).</li>
<li>Cheifetz, S., Andres, J. L., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transforming+growth+factor-beta+receptor+type+III+is+a+membrane+proteoglycan.+Domain+structure+of+the+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The transforming growth factor-beta receptor type III is a membrane proteoglycan. Domain structure of the receptor.</a> J. Biol. Chem. 263 (32), 16984-16991 (1988).</li>
<li>Kamaid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Betaglycan+knock-down+causes+embryonic+angiogenesis+defects+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Betaglycan knock-down causes embryonic angiogenesis defects in zebrafish.</a> Genesis. 53, 583-603 (2015).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid+and+Sensitive+Method+for+the+Quantitation+of+Microgram+Quantities+of+Protein+Utilizing+the+Principle+of+Protein-Dye+Binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Cheifetz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+transforming+growth+factor-b+receptor+subsets+as+determinants+of+cellular+responsiveness+to+three+TGF-b+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Distinct transforming growth factor-b receptor subsets as determinants of cellular responsiveness to three TGF-b isoforms.</a> J. Biol. Chem. 265, 20533-20538 (1990).</li>
<li>López-Casillas, F., Wrana, J. L., Massagué, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Betaglycan+presents+ligand+to+the+TGF%CE%B2+signaling+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Betaglycan presents ligand to the TGFβ signaling receptor.</a> Cell. 73 (7), 1435-1444 (1993).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+USA%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> PNAS USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Maccari, F., Volpi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+specific+recognition+of+glycosaminoglycans+by+antibodies+after+their+separation+by+agarose+gel+electrophoresis+and+blotting+on+cetylpyridinium+chloride-treated+nitrocellulose+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Direct and specific recognition of glycosaminoglycans by antibodies after their separation by agarose gel electrophoresis and blotting on cetylpyridinium chloride-treated nitrocellulose membranes.</a> Electrophoresis. 24 (9), 1347-1352 (2003).</li>
<li>Volpi, N., Maccari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosaminoglycan+blotting+and+detection+after+electrophoresis+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Glycosaminoglycan blotting and detection after electrophoresis separation.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 1312, 119-127 (2015).</li>
<li>Guesdon, J. L., Ternynck, T., Avrameas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+avidin-biotin+interaction+in+immunoenzymatic+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques.</a> J Histochem Cytochem. 27 (8), 1131-1139 (1979).</li>
<li>Bratthauer, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+avidin-biotin+complex+%28ABC%29+method+and+other+avidin-biotin+binding+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">The avidin-biotin complex (ABC) method and other avidin-biotin binding methods.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 588, 257-270 (2010).</li>
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<li>Das, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+radiolabeling+of+a+cell+surface+receptor+for+epidermal+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+USA%22%5BJournal%5D)">Specific radiolabeling of a cell surface receptor for epidermal growth factor.</a> PNAS USA. 74 (7), 2790-2794 (1977).</li>
<li>Massague, J., Guillette, B., Czech, M., Morgan, C., Bradshaw, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+nerve+growth+factor+receptor+protein+in+sympathetic+ganglia+membranes+by+affinity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of a nerve growth factor receptor protein in sympathetic ganglia membranes by affinity labeling.</a> J. Biol. Chem. 256 (18), 9419-9424 (1981).</li>
<li>Massague, J., Pilch, P. F., Czech, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+resolution+of+three+major+insulin+receptor+structures+with+unique+subunit+stoichiometries%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+USA%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic resolution of three major insulin receptor structures with unique subunit stoichiometries.</a> PNAS USA. 77 (12), 7137-7141 (1980).</li>
<li>Hoosein, N. M., Gurd, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Glucagon+Receptors+in+Rat+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+USA%22%5BJournal%5D)">Identification of Glucagon Receptors in Rat Brain.</a> PNAS USA. 81, 4368-4372 (1984).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

目的のタンパク質に対する特異的抗体を用いたウェスタンブロットの使用は、胚発生時にその発現7を研究するための貴重なツールです。しかし、高度にグリコシル化されたタンパク質のイムノブロットは、その非効率的な転送およびニトロセルロースまたはPVDF膜8,9に弱い結合に非常に成功していません。 プロテオグリカンは理由負に帯電しているとポリスチレン表面または疎水性のブロッティング膜のいずれにも結合しない彼らの共有結合したグリコサミノグリカン鎖（GAG）の、この欠点の良い例です。また、GAG鎖の大きさの不均一性が効果的にブロットの面積当たりの量を減少させる、ゲルのセクター上でタンパク質を「広がります」。目的のタンパク質が発現の低いレベルを有する場合に加えて、定期的なウェスタンブロットにより、その検出が困難なタスクです。受容体（TGFBR3）またはβグリカンβIII型トランスフォーミング増殖因子（BG）、哺乳類1とゼブラフィッシュ3の1に2つのGAGの結合部位を有する膜受容体は、これらの特...

>jove_content<RT-PCRまたはin situハイブリダイゼーション（ISH）で同族のmRNAを測定することによって得られた発現プロファイルを検証するためには、胚発生中に発現するタンパク質の特異的な検出が必要です。これは通常、胚抽出物のウェスタンブロットとそれに続く特異的抗体による検出によって達成されます。しかし、このアプローチは、存在量が非常に少ないタンパク質や、ブロッティング中の定量的移動を妨げる特性を持つタンパク質に適用するのは困難です。ベタグリカンは、III型トランスフォーミング成長因子β(TGF-β)受容体(TGFBR3)とも呼ばれ、これらの困難の一例です。TGFBR3は、そのコアタンパク質1を介してTGF-βに結合するパートタイム膜プロテオグリカンであり、アイソフォームTGF-β2に対する親和性が著しく高く、これは他のTGF-β結合タンパク質2と区別する特性です。ゼブラフィッシュのTGFBR3は、8 hpf以降で発現し、そのmRNA3のRT-PCRによって検出されるように、最大72 hpfに達します。
しかし、非常に特異的な抗体3が利用可能であったにもかかわらず、その翻訳産物をウェスタンブロットで検出する試みはすべて失敗に終わりました。この失敗の原因は、TGFBR3のプロテオグリカンの性質と推定される存在量の少なさにあると考え、TGFBR3のTGF-β2に対する高い親和性を利用した検出法AFLIPが考案されました。この方法では、プールされた胚からのタンパク質抽出物が125I標識TGF-β2に特異的に結合することを許され、受容体-リガンド複合体は免疫沈降によって精製され、SDS-PAGEによる分離の前に架橋されます。ゲルのオートラジオグラフィーによって観察された移動パターンは、標識された受容体種の存在と性質を明らかにしました。このアプローチは、アフィニティー標識のリガンド特異性と特異的抗体による免疫沈降を組み合わせ、検出範囲を拡大し、TGFBR3の非効率的なトランスファーブロッティングを回避します。AFLIPアッセイは、その固有の特性により、定量的なアッセイではありませんが、分析された受容体の相対的な実験差を自信を持って測定するために使用できます。

<table><tbody><tr><td>ジスクシンイミジルサブエレート(DSS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21555</td><td></td></tr><tr><td>Protein G Sepharose 4 Fast Flow</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0618-01</td><td></td></tr><tr><td>Gel Dryer Model 583&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>1651745</td><td></td></tr><tr><td>台風 9400</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>63-0055-78</td><td></td></tr><tr><td>Cobra II Auto gamma counter</td><td>Packard</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Exposure Cassette</td><td>Molecular Dynamics</td><td>63-0035-44</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>J.T. Baker</td><td>3624</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>J.T. Baker</td><td>3040</td><td></td></tr><tr><td>Na2</サブ>HPO<サブ>4</サブ></td><td>J.T.ベイカー</td><td>3828</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>J.T.ベイカー</td><td>3246</td><td></td></tr><tr><td>CH3OH</td><td>J.T. ベイカー</td><td>9070</td><td></td></tr><tr><td>CH3COOH</td><td>J.T. ベイカー</td><td>9508</td><td></td></tr><tr><td>HCHO</td><td>J.T. ベイカー</td><td>2106</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>クリスタルシーマリンミックス</td><td>マリンエンタープライズインターナショナル</td><td>http://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix</td><td></td></tr></tbody></table>

ゼブラフィッシュ胚からの内因性受容体の親和性ラベリング検出

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

Affinity LabelingとImmunoprecipitation（AFLIP）の力を組み合わせることにより、ゼブラフィッシュの胚における低存在量の受容体を検出する技術が実装されました。この技術は、免疫沈降の特異性を持つリガンドによる特定の受容体のアフィニティー標識によって付与される選択性と感度を利用します。私たちは、ゼブラフィッシュの初期発生過程において、AFLIPを用いて、ベタグリカンとも呼ばれるIII型TGF-β受容体(TGFBR3)を検出しました。AFLIPは、TGFBR3モルファントゼブラフィッシュの表現型の有効性を検証するのに役立ちました。最初のステップでは、胚タンパク質抽出物を調製し、125のI-TGF-β2-TGFBR3複合体を作製し、免疫沈降によって精製します。その後、これらの複合体は共有結合的に架橋され、SDS-PAGE分離とオートラジオグラフィー検出を使用して明らかになります。この手法では、検出される受容体に対する標識リガンドおよび受容体に対する特異的抗体の利用可能性が必要であり、これらの要件を満たす任意の成長因子またはサイトカイン受容体を同定するために容易に適合させる必要があります。

図1は AFLIPで得られた代表的な結果を示しています。 125 I-リガンドから来レーン1の信号は、共有ゼブラフィッシュβグリカンコアタンパク質（BGコア、150 kDaのマーカー以下）またはグリコサミノグリカンのアタッチメント（GAG、スミアによってそのプロテオグリカンの形に加工されたBGコアのいずれかにリンクされています）170キロダルトンからゲルの上部に及びます。移行のこのパターン、シャープなコアタンパク質プラス（GAG鎖の長さが原因で不均質に）塗抹プロテオグリカンは、TGFBR3 2の特徴です。 DSSは共有結合で形成された一つ一つのリガンド-受容体複合体をリンクしていないので、ゲル（125 I-TGF-β2）の移行前面に現れる自由125 I-リガンドがあります。この無料のリガンドは、受容体に結合し、免疫沈降時にバインドされたままであったが、それは共有結合していないため、SDS-PAGEの手順の間に切り離さ。いいえnethelessは、その...

ゼブラフィッシュの胚に存在する低存在量の内因性受容体を検出するための新しい技術が説明されています。免疫沈降に関連するリガンドによる受容体の親和性標識で構成されているため、AFLIPと名付けました。

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

本手順の全体的な目的は、選択した受容体に対する放射性リガンドを用いたアフィニティーラベリングの選択性と感度を組み合わせることで、ゼブラフィッシュ胚における低発現の成長因子受容体を検出することです。この手法は、受容体の発現レベルやその生化学的特性など、発生生物学分野における疑問を解決するのに役立ちます。私たちがAFLIPと名付けたこの手法は、細胞生物学の確立された技術であるアフィニティーラベリングの強力な記述能力を、ゼブラフィッシュの発生研究へと拡張するものです。本手順を開始するために、各条件につき100〜200個の胚を回収し、魚用水を含むペトリ皿に入れます。次に、微細先端ピンセットを用いて胚を手動で脱膜させます。プロナーゼやその他のプロテアーゼは、標的受容体を分解する可能性があるため、プロトコルの全工程を通して使用しないでください。その後、胚を1.5 mLマイクロ遠心チューブに移し、1X PBSで2回洗浄します。次に、500 µLの脱黄緩衝液を加えます。溶液中の胚をピペッティングで30〜40回ほど緩やかに吸い込みと吐き出しを繰り返し、卵黄の大部分を除去します。72 HPFおよび48 HPFの胚には、それぞれ青色と黄色のピペットチップを使用してください。胚を損傷させないよう、黄色い先端部分をわずかに切り落とす必要がある場合があります。卵黄の除去が成功したかどうかは、顕微鏡下で胚を観察することで確認できます。卵黄の脂質やタンパク質がその後のリガンドまたは抗体結合ステップを妨げる可能性があるため、卵黄はできる限り完全に除去しなければなりません。その後、600 x gで15秒間遠心分離し、胚を回収します。ピペットを用いて上清を慎重に除きます。次に、胚を500 µLの洗浄バッファーで2回洗浄します。この際、最低速度で穏やかにボルテックスしてください。次に、600 x gで15秒間遠心分離し、胚を回収します。ここから先の操作は、4 °Cで継続してください。ピペットを用いて、上清を注意深く除きます。その後、胚を350 µLの溶解バッファーに懸濁し、プラスチックペッスルを用いてホモジナイズします。次に、溶解した胚をテストチューブロッカーを用い、4 °Cで30分間振盪しながらインキュベートします。続いて、不溶性デブリを除去するため、溶解した胚を11,000 x gで15分間遠心分離します。その後、清澄化した上清を新しいチューブに移します。Bradfordタンパク質定量法を用いて全タンパク質量を測定し、検量線を作成します。このステップでは、400～500 µgの胚全タンパク質を1.5 mLマイクロ遠心チューブに入れ、バッファー1で1 µg/µLになるように希釈します。次に、最終濃度が150 picomolarになるようにIodine-125標識TGF-beta IIストックを加え、テストチューブロッカーを用いて4°Cで2時間攪拌しながらインキュベートします。その後、目的の受容体に対する未希釈の抗体を加え、1:100の希釈倍率にします。続いて、4°Cでさらに2時間または一晩インキュベーションを継続します。インキュベーション後、適切な免疫グロブリン結合ビーズを50 µL加え、テストチューブロッカーを用いて4 °Cで50分間、撹拌しながらインキュベートします。次に、11,000 x gで20秒間マイクロ遠心分離してビーズを回収し、上清を適切な放射性廃棄物容器に廃棄します。その後、IP洗浄バッファー1 mLを用いて、ボルテックス処理後、11,000 x gで20秒間のマイクロ遠心分離を3回繰り返し、IPビーズを洗浄します。次に、IPビーズを250 µLのIP洗浄バッファーで再懸濁します。新鮮なDSS溶液を調製し、その1.5 µLをサンプルに添加します。その後、サンプルを4 °Cで15分間、攪拌しながらインキュベートします。架橋反応を停止させるため、pH 7.4で25 mMのtris-HCl濃度になるようにtris-HClストックを添加したIP洗浄バッファーを500 µL加えます。次に、11,000 ×gで20秒間遠心分離し、IPビーズを回収します。その後、上清を除去し、IPビーズを30 µLの還元剤含有Laemmliバッファーで再懸濁します。次に、SDS-PAGEゲル電気泳動を行う前に、サンプルを94 °Cで5分間加熱し、その後、乾燥させたゲルをフォスフォリメーターまたは従来のオートラジオグラフィーで解析します。この図は、AFLIPを用いて得られた代表的な結果を示しています。受精後72時間（hpf）および48時間の胚から抽出した全タンパク質をIodine-125 TGF-beta IIでアフィニティー標識し、続いてウサギ抗ゼブラフィッシュBG、または対照としてウサギ抗ラットBGを用いて免疫沈降（IP）を行いました。オートラジオグラフィーにおいて、BGはGAGなしの状態、またはグリコサミノグリカン修飾BGとして検出できます。この図は、実験的操作（この場合はモルフォリノ注入によるベタグリカン（BG）の減少）を受けた胚において、特定の受容体の発現レベルを測定するためにAFLIPをどのように使用できるかを示しています。レーン1は72 hpfの野生型胚におけるTGF beta receptor IIIのレベルを示し、レーン2はZFPG一次転写物のエキソン2-イントロン2境界を標的とした7 ngのモルフォリノを投与した際の効果を示しています。このモルフォリノによって得られたBGのダウンレギュレーションは、ミスマッチコントロールでは再現されないことに注意してください。これらの結果により、このモルフォリノを用いて得られた表現型は、前述のTGF beta receptor IIIのノックダウンに特異的なものであることが確認されました。成長因子またはサイトカイン受容体を検出するためのAFLIPの成否は、受容体に結合し架橋させることができる放射標識リガンドが利用可能かどうかに依存します。また、免疫沈降に適した良好な抗体も必要です。この手法を習得すれば、適切に行うことで2日間で完了させることができます。AFLIPはウェスタンブロットの転写工程を回避するため、高度に糖鎖修飾された受容体を高感度に検出することが可能です。ここでは、ウェスタンブロットでは転写効率が非常に低いプロテオグリカンのbetaglycanにおいて、その効果を確認しました。本手順に続き、電気泳動の手法で検出可能な限り、さらなる翻訳後修飾を記述するために酵素消化などの他の手法を実施することができます。このビデオを視聴することで、アフィニティーラベル化と免疫共沈降を組み合わせたAFLIPを用いることで、複数の魚類胚における低発現の受容体をどのように検出できるかについて、十分な理解を深めることができるはずです。最後に、Iodine-125を取り扱う際は、細心の注意を払い、適切な防護措置を講じる必要があることを忘れないでください。皆様の実験の成功をお祈りします。

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学ぶAFLIP法によるゼブラフィッシュ胚の低発現成長因子受容体検出技術。親和性ラベリングと免疫沈降を組み合わせ、発生生物学における受容体動態研究に有用な方法を解説します。

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