哺乳動物宿主細胞に分泌された細菌毒素の影響を研究するために、透過膜を挿入ベースの感染システムの実現

この透過性メンブレンインサートベースの感染システムの全体的な目標は、感染中に分泌された細菌毒素が宿主細胞に及ぼす影響を研究することです。この方法は、特定の分泌された細菌成分が細菌感染中の宿主細胞の応答にどのように寄与するかなど、宿主と病原体の相互作用の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、分泌された細菌成分の研究を可能にし、ヒト感染の文脈で生理学的に関連する宿主病原体環境をより厳密にモデル化できることです。

その手順を実演するのは、私の研究室の上級大学院生であるRebecca Flahertyです。同遺伝子の野生型A群連鎖球菌(GAS)およびGAS M1T1 5448変異株を調製するには、5〜10ミリリットルのTodd Hewittブロスを接種し、摂氏37度で16時間インキュベートすることにより、一晩液体培養を開始します。一晩の細菌培養物を遠心分離し、元の量の新鮮な細菌培地を使用してペレットを再懸濁します。

次に、再懸濁した培養物を追加の培地で希釈することにより、細菌培養物を開始濃度に等しく標準化し、同じOD600に到達します。シグナル伝達分析およびATP測定アッセイを実施するためのライセートを採取するには、HaCaT細胞を1ウェルあたり10〜5番目の細胞の約3倍の座席密度で6ウェル皿にプレートし、90%のコンフルエンスまで培養します。エチジウムホモダイマー膜透過化および乳酸デヒドロゲナーゼ放出アッセイを行うには、HaCaT細胞を24ウェル皿に1ウェルあたり10の約5倍の着座密度で1ウェルあたり4番目の細胞に播種し、90%のコンフルエンスまで増殖します。

治療の直前に、1x PBSを使用して細胞を洗浄します。次に、薬理学的処理の有無にかかわらず、2ミリリットルの新鮮な増殖培地を6ウェルプレートに適用し、0.5ミリリットルの培地を24ウェルプレートのウェルに適用します。次に、層流フードの下に滅菌鉗子を使用して、滅菌された0.4ミクロンの透過性メンブレンインサートを各ウェルに慎重に配置します。

感染準備中に透過性インサートを穏やかに無菌的に取り扱うことは、このプロセス中にメンブレンが損なわれたり汚染されたりするのを防ぐために重要です。メーカーの指示に従って、新鮮な細胞培養液を各ウェルの上部チャンバーに塗布します。次に、標準化した細菌培養物を適量を透過性メンブレンインサートシステムの上部チャンバーに適用し、細菌培地をコントロールウェルに適用します。

実験のセットアップ中に細菌が下部チャンバーを汚染しないことが不可欠であるため、上部チャンバーへの細菌の慎重な添加と、感染細胞のインキュベーターへの穏やかな輸送が重要です。分泌された宿主タンパク質を評価するには、滅菌鉗子を使用して透過性メンブレンインサートを慎重に除去します。次に、細胞の単層を乱さずに、下部チャンバーから培地を1.5ミリリットルのチューブに集めます。

サンプルを14, 000 RCFおよび摂氏4度で10分間遠心分離し、細胞の破片をペレット化します。その後、50マイクロリットルを除く上清をすべて取り除き、新しい1.5ミリリットルのチューブに移し、マイナス20°Cで保存するか、すぐに使用します。宿主細胞のライセートを評価するには、宿主細胞を乱さずに、単層より上の培地を穏やかに吸引します。

次に、PBSを使用して細胞を一度すすぎます。PBSを穏やかに吸引し、すぐに氷冷溶解バッファーの量を塗布して、たとえば、1ミリリットルあたり0.5〜1.5ミリグラムのタンパク質濃度を達成します。次に、サンプルを氷上で15分間インキュベートします。

次に、セルスクレーパーを使用して各ウェルのプレート表面からセルを分離し、各ウェルの内容物全体を1.5ミリリットルのチューブに移します。次に、サンプルを14, 000 RCFと摂氏4度で20分間遠心分離します。可溶性ライステート成分を評価するには、上清を新しいチューブに移し、摂氏マイナス20度で保存するか、すぐに使用してください。.

核または他の不溶性溶解物成分を評価するには、ペレットを予約し、摂氏マイナス20度で保存するか、すぐに使用してください。免疫蛍光イメージングによる評価では、培地を吸引し、1x Cold PBSを使用して細胞を洗浄します。次に、4%PFAとPBSを使用して、細胞を一晩固定します。

テキストプロトコルに従ってさらなる分析を実施します。ここに示すウェスタンブロットデータは、ストレプトリジンSまたはSLS産生ガス株の存在下で、p38 MAPキナーゼの活性化とケラチノサイトの有意に増強されたことを示しており、このシステムを使用して接触に依存しない宿主シグナル伝達タンパク質の活性化の変化を評価することができることを示しています。この図では、活性化時に細胞質から核に移行する主要な炎症メディエーターである核因子-κBのSLS依存的な活性化が示されており、このシステムを使用して、免疫蛍光顕微鏡法を用いて分泌された細菌因子が宿主タンパク質応答に及ぼす影響を可視化できることを示しています。

ここでは、SLS産生ガス株への曝露後、非感染細胞またはSLS欠損株に曝露された細胞と比較して、膜透過化および宿主細胞からのLDHの放出の両方が有意に増加することが実証されている。これらの結果は、このシステムが宿主の細胞毒性における毒素依存性の変化を評価できることを示しています。この実験では、ケラチノサイト中のATPのレベルとガス感染に対する応答を決定しました。

感染後16時間で、ATPの有意な減少が観察され、ATPの喪失はSLSの存在下でより顕著であり、宿主ストレス応答シグナル伝達と毒性の毒素依存性の増加と一致しました。確立されると、この手法は、さまざまな宿主細胞タイプに対する任意の分泌微生物因子の特異的応答を研究するために利用することができます。この手順を実行する際には、実験セットアップステップ全体を通じて無菌技術を実践し、初期設定中とサンプル収集中の両方で透過性メンブレンインサートの慎重な取り扱いを維持することが重要です。

この手順に続いて、ウェスタンブロッティング、免疫蛍光イメージング、膜透過化アッセイなどの方法を実施して、目的の細菌因子がシグナル伝達カスケードの変化にどのように寄与し、感染中の全体的な細胞毒性に影響を与えるかを決定することができます。このビデオを見れば、特定の分泌細菌因子に曝露した後のさまざまな宿主細胞応答を評価するための宿主細胞サンプルの調製方法について十分に理解できるはずです。細菌性病原体などのバイオハザード物質の取り扱いには、一定の安全上の配慮が必要であることを忘れないでください。

これらの実験を安全に行うためには、安全メガネ、手袋、白衣の適切な使用、およびバイオセーフティフードの適切な使用が必要です。