定量的なアプリケーションのための均質なMALDI試料の調製

MALDI MSにおけるこの試料調製法の全体的な目的は、MALDI MS中のイオン信号の空間的な不均一性を低減することです。乾燥過程における試料液滴内部の流体力学的フローを制御することにより、従来の乾燥液滴法を最適化した、高度に制御された乾燥環境を構築しました。この手法の主な利点は、最適化された乾燥液滴法で調製した試料のイオン信号の空間的な不均一性を効果的に低減できることです。これにより、THAPメトリックシステムに適した均質な試料を提供することが可能になります。

また、$\alpha$-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸などの他のマトリックスシステムにも適用可能です。一般的に、この手法に不慣れな人は、乾燥条件の制御が容易ではないため苦労することがあります。本手順を開始するには、乾燥チャンバーのドアを開け、あらかじめ洗浄したサンプルプレートを直ちに銅製ブロックの上に配置してください。

次に、ドアを閉めます。ガス流量計を手動で調整し、窒素流量を10 standard cubic feet per hourに設定します。その後、湿度計で測定し、乾燥チャンバー内の相対湿度が常に25%以下になるよう、ガス流量計で微調整します。

K型熱電対を用いて温度をモニタリングしながら、サンプルプレートが実験条件である5 °Cに達するまで、ウォーターバスの温度を手動で調整します。サンプルの滴下前に、規定の温度および相対湿度に達していることを確認してください。マイクロセントリフュージチューブ内で、0.1 MのTHAP溶液0.25 µLと目的のアナライト0.25 µLを混合します。

サンプルを3秒間ボルテックスします。次に、2秒間遠心分離し、溶液をマイクロ遠心チューブの底に集めます。遠心分離後、乾燥チャンバーのドアを開け、ピペットを用いて0.1 µLの溶液をサンプルプレート上に慎重に滴下します。

すぐにドアを閉め、サンプル液滴が乾燥するまで待ちます。サンプルプレートの温度を周囲よりも低く保つことで、液滴内の再循環流の平均速度が大幅に増加し、分子の再分布が促進されます。サンプルの滴下は、データの品質と再現性を決定付ける最も重要な工程です。

サンプルが制御された条件下で結晶化するように、混合済みのサンプル溶液を直ちにサンプルプレートに滴下する必要があります。乾燥後、乾燥室のドアを開けてください。

次に、ウォーターサーキュレーターの温度を25 °Cに設定します。サンプルプレートの温度が25 °Cに戻ったら、乾燥チャンバーからサンプルプレートを取り出します。5倍の倍率の実体顕微鏡でサンプルの形態を観察し、明視野像の写真を撮影します。

この時点で、サンプルプレートをMALDI質量分析計に挿入します。次に、イメージング質量分析を行います。結果ウィンドウに表示された質量リストから特徴的な質量ピークを選択し、「2D」をクリックして二次元イオンイメージをプロットします。

次に、ポップアップウィンドウ内の調整ボタンをクリックして信号強度の上下限を決定し、画像解像度を高めてから、「save a picture」をクリックします。得られたイオン画像と、 previouslyに取得した明視野画像を観察・比較し、サンプルの不可欠な領域を特定します。続いて、結果ウィンドウに表示されたイオン画像の中で、信号のない箇所や亀裂のある領域をクリックし、分析対象領域の微調整を行います。

「find edge」ボタンをクリックして、イオンイメージの最外層を特定します。続いて「deduct」をクリックし、最外層のイオン存在量情報をデータベースに保存すると同時に、この層をイオンイメージから除去します。イオンイメージの中心が定義されるまで上記の手順を繰り返し、その後、出力データリスト内のすべてのチェックボックスを選択して「export」をクリックし、データをエクスポートします。

最後に、エクスポートしたデータを表計算ソフトで開き、各レイヤーの平均イオン強度を計算して、イオンの空間分布情報を取得します。マルトトリオースの明視野像およびMALDI像において、サンプルプレートの温度を25 °Cに設定して調製した場合、ナトリウム付加体のイオンシグナルは主にサンプル領域の周辺部に分布します。温度を5 °Cに下げると、シグナルはサンプル領域全体に均一に分布することになり、サンプルプレートの温度を低くしてサンプルを調製することで、分子の再分布を大幅に促進し、不均一性を低減できることが示唆されます。

プロトン化ブラジキニンフラグメントイオンの画像は、ナトリウム付加マルトトリオースと同様の傾向を示しています。統計解析の結果、サンプルプレートの温度を5 °Cに設定した場合、25 °Cの場合と比較して、得られたイオン信号の不均一性が60〜80%減少することが示されました。ナトリウム付加マルトトリオースの場合、サンプルプレートの温度が25 °Cのとき、中心部の信号強度は5 °Cのときよりも大幅に低くなっています。

プロトン化されたブラジキニンフラグメントは、サンプルプレートの温度を25℃から5℃に下げた際に、変動が少ないことを示しています。この乾燥方法を試みる際は、乾燥チャンバー内の温度と相対湿度を慎重に制御し、モニタリングする必要があります。この技術を習得し、適切に実施すれば、サンプルの調製は30分で完了します。

本技術の開発により、MALDI MS分野の研究者が乾燥液滴サンプルの定量分析を探索するための道が開かれました。このビデオを視聴することで、MALDI MS分析に向けた均質な乾燥液滴サンプルの調製方法について十分に理解できるはずです。