Name: グレープベリーメタボロミクスとトランスクリプトを通して解釈テロワールコンセプト (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 2 s
Description: 学ぶ グレープベリーのメタボロミクスとトランスクリプトーム解析を用いて、Corvina品種のテロワール特性を解明する方法。異なるマクロゾーンとヴィンテージ効果による化学的シグネチャの違いを統計的手法で明らかにします。

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この作業は、EUが資金提供したCOST ACTION FA1106 "トマトとブドウの木の果肉質の品質を制御する開発メカニズムを決定するための統合システムアプローチ"内で調整されたネットワーク活動の恩恵を受けました。"この研究は、カリヴェローナ銀行財団が資金提供した「Completamento del Centro di Genomica Funzionale Vegetale」プロジェクトと、イタリア農林政策省が資金提供した「Valorizzazione dei Principali Vitigni Autoctoni Italiani e dei loro Terroir (Vigneto)」プロジェクトの支援を受けました。SDSは、イタリア大学研究省FIRBのRBFR13GHC5プロジェクト「環境相互作用による遺伝子型におけるブドウのエピゲノム可塑性」によって資金提供されました。

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<li>Toffali, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+aspects+of+grape+berry+ripening+and+post-harvest+withering+revealed+by+untargeted+LC-ESI-MS+metabolomics+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Novel aspects of grape berry ripening and post-harvest withering revealed by untargeted LC-ESI-MS metabolomics analysis.</a> Metabolomics. 7 (3), 424-436 (2011).</li>
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<li>Berdeja, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water+limitation+and+rootstock+genotype+interact+to+alter+grape+berry+metabolism+through+transcriptome+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Hort+Res%22%5BJournal%5D)">Water limitation and rootstock genotype interact to alter grape berry metabolism through transcriptome reprogramming.</a> Hort Res. 2, 1-13 (2015).</li>
<li>Carbonell-Bejerano, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solar+ultraviolet+radiation+is+necessary+to+enhance+grapevine+fruit+ripening+transcriptional+and+phenolic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Solar ultraviolet radiation is necessary to enhance grapevine fruit ripening transcriptional and phenolic responses.</a> BMC Plant Biol. 14, 1-16 (2014).</li>
<li>Carbonell-Bejerano, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+sampling+bias+in+molecular+studies+of+grapevine+fruit+ripening%3A+transcriptomic+assessment+of+the+density+sorting+method%5BTitle%5D)+AND+%22Theor+Exp+Plant+Phys%22%5BJournal%5D)">Reducing sampling bias in molecular studies of grapevine fruit ripening: transcriptomic assessment of the density sorting method.</a> Theor Exp Plant Phys. 28 (1), 109-129 (2016).</li>
<li>Carbonell-Bejerano, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+oscillatory+transcriptional+programs+in+grapevine+ripening+fruits%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Circadian oscillatory transcriptional programs in grapevine ripening fruits.</a> BMC Plant Biol. 14, 1-15 (2014).</li>
<li>Cavallini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+diversification+of+grapevine+MYB5a+and+MYB5b+in+the+control+of+flavonoid+biosynthesis+in+a+petunia+anthocyanin+regulatory+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+%26+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional diversification of grapevine MYB5a and MYB5b in the control of flavonoid biosynthesis in a petunia anthocyanin regulatory mutant.</a> Plant & Cell Physiol. 55 (3), 517-534 (2014).</li>
<li>Cramer, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+analysis+of+the+late+stages+of+grapevine+%28Vitis+vinifera+cv.+Cabernet+Sauvignon%29+berry+ripening+reveals+significant+induction+of+ethylene+signaling+and+flavor+pathways+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic analysis of the late stages of grapevine (Vitis vinifera cv. Cabernet Sauvignon) berry ripening reveals significant induction of ethylene signaling and flavor pathways in the skin.</a> BMC Plant Biol. 14, 1-21 (2014).</li>
<li>Dal Santo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasticity+of+the+grapevine+berry+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">The plasticity of the grapevine berry transcriptome.</a> Genome Biol. 14 (6), 1-17 (2013).</li>
<li>Fasoli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Grapevine+Expression+Atlas+Reveals+a+Deep+Transcriptome+Shift+Driving+the+Entire+Plant+into+a+Maturation+Program%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The Grapevine Expression Atlas Reveals a Deep Transcriptome Shift Driving the Entire Plant into a Maturation Program.</a> Plant Cell. 24 (9), 3489-3505 (2012).</li>
<li>Gambino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-evolution+between+Grapevine+rupestris+stem+pitting-associated+virus+and+Vitis+vinifera+L.+leads+to+decreased+defence+responses+and+increased+transcription+of+genes+related+to+photosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Co-evolution between Grapevine rupestris stem pitting-associated virus and Vitis vinifera L. leads to decreased defence responses and increased transcription of genes related to photosynthesis.</a> J Exp Bot. 63 (16), 5919-5933 (2012).</li>
<li>Ghan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five+omic+technologies+are+concordant+in+differentiating+the+biochemical+characteristics+of+the+berries+of+five+grapevine+%28Vitis+vinifera+L.%29+cultivars%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Five omic technologies are concordant in differentiating the biochemical characteristics of the berries of five grapevine (Vitis vinifera L.) cultivars.</a> BMC Genomics. 16 (1), 1-26 (2015).</li>
<li>Pastore, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+defoliation+affects+plant+growth%2C+fruit+transcriptional+ripening+program+and+flavonoid+metabolism+in+grapevine%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Selective defoliation affects plant growth, fruit transcriptional ripening program and flavonoid metabolism in grapevine.</a> BMC Plant Biol. 13, 1-13 (2013).</li>
<li>Pastore, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+the+source%2Fsink+ratio+in+Vitis+vinifera+%28cv+Sangiovese%29+induces+extensive+transcriptome+reprogramming+and+modifies+berry+ripening%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Increasing the source/sink ratio in Vitis vinifera (cv Sangiovese) induces extensive transcriptome reprogramming and modifies berry ripening.</a> BMC Genomics. 12, 1-23 (2011).</li>
<li>Rinaldo, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Grapevine+Anthocyanin+Acyltransferase%2C+Transcriptionally+Regulated+by+VvMYBA%2C+Can+Produce+Most+Acylated+Anthocyanins+Present+in+Grape+Skins%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A Grapevine Anthocyanin Acyltransferase, Transcriptionally Regulated by VvMYBA, Can Produce Most Acylated Anthocyanins Present in Grape Skins.</a> Plant Physiol. 169 (3), 1897-1916 (2015).</li>
<li>Royo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental%2C+transcriptome%2C+and+genetic+alterations+associated+with+parthenocarpy+in+the+grapevine+seedless+somatic+variant+Corinto+bianco%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Developmental, transcriptome, and genetic alterations associated with parthenocarpy in the grapevine seedless somatic variant Corinto bianco.</a> J Exp Bot. , 259-273 (2015).</li>
<li>Venturini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+transcriptome+characterization+of+Vitis+vinifera+cv.+Corvina+unveils+varietal+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">De novo transcriptome characterization of Vitis vinifera cv. Corvina unveils varietal diversity.</a> BMC Genomics. 14, 1-13 (2013).</li>
<li>Commisso, M., Strazzer, P., Toffali, K., Stocchero, M., Guzzo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untargeted+metabolomics%3A+an+emerging+approach+to+determine+the+composition+of+herbal+products%5BTitle%5D)+AND+%22Comput+Struct+Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Untargeted metabolomics: an emerging approach to determine the composition of herbal products.</a> Comput Struct Biotechnol J. 4, 1-7 (2013).</li>
<li>Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MZmine+2%3A+Modular+framework+for+processing%2C+visualizing%2C+and+analyzing+mass+spectrometry-based+molecular+profile+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data.</a> BMC Bioinformatics. 11, 1-11 (2010).</li>
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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

この記事では、メタボロミクス、トランスクリプトミクスとブドウ果実のテロワールの概念を解釈するために使用される統計解析プロトコルについて説明します。 HPLC-ESI-MSによるメタボロミクス解析を同時に代謝産物の多くを検出するのに十分な感度であるが、相対的な定量は、マトリックス効果とイオン抑制/増強に影響されます。しかし、同様のアプローチが既にコルビナ果実の熟成及び収穫後の枯死を記述するために使用されており、マトリクス効果の補正が結果5への影響は限定的でした。さらに、同じ試料を用いて、非標的メタボロミクスのためのNMRおよびLC-MSの比較堅牢性を決定するために、最近の大規模なマルチインストゥルメント研究室間の研究では、さまざまな楽器や技術を6一貫した結果が得られたことを明らかにしました。本明細書中に記載のケーススタディでは、3マクロ-Zで7ブドウ園から3熟成の段階でサンプルの収集と分析を関与しました3生育期を超えるもの。ここで、テロワールの署名がPCAとO2PLS-DAの多変量統計を用いて、（3ブドウ畑で表さガルダ湖とソアーヴェ、2ブドウ畑によって表される各、およびヴァルポリチェッラ、）マク...

植物のゲノム、トランスクリプトーム、プロテオームおよびメタボロームに基づいて、大規模データ解析は、ブドウの植物とその環境との相互作用を反映したワインのテロワールの特性のような複雑なシステムの挙動に前例のない洞察を提供しています。ワインのテロワールが同一のブドウのクローンが異なるブドウ畑で栽培された場合でも明瞭な可能性があるので、クローンのゲノムが同じであるため、ゲノミクス解析はほとんど役に立ちません。その代わりに、遺伝子発現とワインの品質特性を決定ベリーの代謝特性との相関関係を調べることが必要です。マイクロアレイ上に固定化されたプローブに、そのようなハイブリダイゼーションのような普遍的な特性を利用することによって定量分析を容易にする全ての転写物の類似の化学的特性から、トランスクリプトームの利益のレベルでの遺伝子発現の解析。プロテオミクスaの対照的に、ユニバーサル分析方法NDメタボロミクスが原因個々のタンパク質および代謝産物の巨大な物理的および化学的多様性より挑戦です。メタボロミクスの場合、個々の代謝産物がサイズ、極性、豊かさとボラティリティに大幅に異なるため、この多様性はさらに極端なので、単一の抽出方法や分析方法は、全体的なアプローチを提供しています。 不揮発性代謝物のために適切な分析プラットフォームのうち、高速液体クロマトグラフィーに基づくものを質量分析に連結された（HPLC-MS）は、はるかに敏感例えば紫外線またはダイオードアレイ検出器を用いたHPLC（HPLC-UV、HPLC-DADなどの代替よりも）または核磁気共鳴（NMR）分光法が、HPLC-MSによる定量分析は、マトリックス効果とイオン抑制/強化1-3のような現象に影響され得ます。 （HPLC-Eをエレクトロスプレーイオン化源を用いてHPLC-MSによるコルビナブドウ果実の解析中にこのような効果の調査SI-MS）は、最小の保持時間を有する糖および他の分子を強くおそらくこの領域中の分子の多くを反映し、過少報告されたことを示し、他の分子の存在量は、マトリックス効果によって過大評価または影響を受けず、過小評価することができることしかし、マトリックス効果のためのデータの正規化は、全体の結果4,5への影響は限定的を持っているように見えました。本明細書に記載される方法は、熟成中ブドウ果実において高レベルで蓄積媒体極性代謝物の分析のために最適化され、そしてこれはかなりテロワールによって影響を受けます。彼らは一緒にワインの色、味と健康関連の特性を決定する、アントシアニン、フラボノール、フラバン-3-オール、プロシアニジン、他のフラボノイド、レスベラトロール、スチルベン、ヒドロキシ酸およびヒドロキシ安息香酸が含まれます。 HPLC-MSによる定量の信頼性が低いので、そのような糖や脂肪族有機酸などの他の代謝産物は、原因effec行列に無視されますトンとイオン抑制現象5。この方法により、選択された極性の範囲内に、アプローチは、可能な6限り多くの異なった代謝物を検出することを目的とするという点で非標的です。 ブドウの転写産物の数千人が同時に監視できるようにするトランスクリプトーム法は、完全なブドウのゲノム配列7,8の利用可能性によって促進されます。ハイスループットのcDNA塩基配列決定に基づいて、初期のトランスクリプトミクス手法をまとめ、RNAのSeq技術として記載された手順のコレクションに次世代シーケンサーの登場と進化してきました。このアプローチは、急速にトランスクリプトミクス研究のための最適な方法になってきています。しかし、転写産物の数千人は、ハイブリダイゼーションによって並列に定量化することを可能にするマイクロアレイに基づく文学の大きな体は、ブドウのために蓄積してきました。 RNA-seqが主流の技術になる前に実際に、多くの専用の市販のマイクロアレイプラットフォームをしていましたブドウトランスクリプトームは、非常に詳細に検査することを可能にする開発。プラットフォームの多種多様な中で、2つだけは、ゲノムワイドなトランスクリプトーム解析9を可能にしました。最も進化した配列は、このように各実験のコストを削減し、単一のデバイスに最大12の独立したサンプルのハイブリダイゼーションを可能にしました。 12サブアレイはそれぞれ29549ブドウの転写産物を表す135,000 60-merのプローブを含んでいました。この装置は、試験10-24多数のに使用されています。これら2つのプラットフォームは、現在廃止されましたが、新しいカスタムマイクロアレイは、最近設計されていて、それが追加新たに発見されたブドウの遺伝子25を表すプローブのさらに多くが含まれているとして、より多くの最近の発展を表しています。 トランスクリプトミクスとメタボロミクス解析によって生成された大販売データセットは、別のフォームとの間の相関を決定するために、多変量技術を含むデータ分析に適した統計的手法を必要とし、データの秒。最も広く使用されている多変量技術は、投影に基づくものであり、これらは、主成分分析（PCA）、又は、教師なしとすることができるような潜在構造判別分析（O2PLS-DA）26への双方向直交射影として、監督します。この記事で紹介したプロトコルは、サンプルのグループ間の差異を識別するために、探索的データ解析のためのPCAとO2PLS-DAを使用しています。

<table><tbody><tr><td>ミルグラインダー</td><td>IKA</td><td>IKA A11 ベーシック</td><td></td></tr><tr><td>HPLC オートサンプラー</td><td>ベックマン・コールター</td> <td>-</td><td>System Gold 508 オートサンプラー</td></tr><tr><td>HPLC システム</td><td>ベックマン・コールター</td> <td>-</td><td>System Gold 127 ソルベントモジュール HPLC</td></tr><tr><td>C18 ガードカラム</td><td>グレース</td><td>&nbsp;-</td><td>Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 &mu;m) ガードコラム</td></tr><tr><td>C18 コラム</td><td>グレース</td><td>&nbsp;-</td><td>アルティマ HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 &mu;m) カラム</td></tr><tr><td>質量分析計</td><td>Bruker Daltonics</td><td>&nbsp;-</td><td>Bruker Esquire 6000;質量分析計にはESIソースが装備されており、分析装置はイオントラップでした。</td></tr><tr><td>抽出溶媒およびHPLCバッファー</td><td>Sigma</td><td>34966</td><td>メタノールLC-MSグレード</td></tr><tr><td>Sigma</td><td>94318</td><td>ギ酸LC-MSグレード</td><td></td></tr><tr><td>Sigma</td><td>34967</td><td>アセトニトリルLC-MSグレード</td><td></td></tr><tr><td>Sigma</td><td>39253</td><td>水&nbsp;LC-MS グレード</td><td></td></tr><tr><td>Minisart RC 4 シリンジフィルター (0.2 &mu;m)</td><td>Sartorius</td><td>17764</td><td></td></tr><tr><td>データ収集(a)および処理のためのソフトウェア(b)</td><td>Bruker Daltonics-Bruker</td><td></td> <td>Daltonics Esquire 5.2 Control(a);Esquire 3.2 Data Analysis and MzMine 2.2 software (b)</td></tr><tr><td>Spectrum Plant Total RNA kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>STRN250-1KT</td><td>For total RNA extractino from grape pericarps</td></tr><tr><td>Nanodrop 1000</td><td>Thermo Scientific</td><td>1000</td><td></td></tr><tr><td>BioAnalyzer 2100</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939A</td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Nano Reagents</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>RNAチップ</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Gene Expression Wash Buffer 1</td><td>Agilent Technologies</td><td>5188-5325</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Gene Expression Wash Buffer 2</td><td>Agilent Technologies</td><td>5188-5326</td><td></td></tr><tr><td>LowInput QuickAmp Labeling kit One-Color</td><td>Agilent Technologies</td><td>5190-2305</td><td></td></tr><tr><td>Kit RNA Spike In - One-Color</td><td>AgilentTechnologies</td><td>5188-5282</td><td></td></tr><tr><td>遺伝子発現ハイブリダイゼーションキット</td><td>Agilent Technologies</td><td>5188-5242</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>for cRNA purification</td></tr><tr><td>Agilent SurePrint HD 4X44K 60-mer Microarray</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2514F-048771&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>eArray</td><td>Agilent Technologies</td><td>-</td><td><a href="https://earray.chem.agilent.com/earray/">https://earray.chem.agilent.com/earray/</a</td></tr><tr><td>>Gasket スライド</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2534-60012</td><td>Agilent SurePrint Microarray 4-array Hybridization</td></tr><tr><td>Thermostatic bath</td><td>Julabo-Hybridization</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Chamber</td><td>Agilent技術</td><td>G2534-60001</td><td></td></tr><tr><td>マイクロアレイハイブリダイゼーションオーブン</td><td>アジレントテクノロジー</td>ズ <td>G2545A</td><td></td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーションオーブン ローテーターラック</td><td>アジレントテクノロジー</td><td>ズ G2530-60029</td><td></td></tr><tr><td>ローテーターラックコンバージョンロッド</td><td>アジレントテクノロジー</td><td>ズ G2530-60030</td><td></td></tr><tr><td>染色キット</td><td>バイオオプティカ</td><td>10-2000</td><td>スライド染色皿とスライドラック</td></tr><tr><td>マグネチックスターラー装置</td><td>アレックス ヒーティングマグネティックスターラー</td><td>F20540163&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>サーモスタットオーブン</td><td>Thermo Scientific</td><td>Heraeus - 6030</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Microarray Scanner</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2565CA</td><td></td></tr><tr><td>スキャナーカルーセル、48ポジション</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2505-60502</td><td></td></tr><tr><td>スライドホルダー</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2505-60525</td><td></td></tr><tr><td>機能抽出ソフトウェア v11.5</td><td>AgilentTechnologies-Inside</td><td></td> <td>the Agilent Microarray Scanner G2565CA</td></tr><tr><td>SIMCA + V13 Software</td><td>Umetrics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

グレープベリーメタボロミクスとトランスクリプトを通して解釈テロワールコンセプト

The Terroir Concept Interpreted through Grape Berry Metabolomics and Transcriptomics

テロワールは、特定の生息地や経営慣行に従って、このようなブドウ（ ブドウ ）などの作物の特性に影響を与える環境要因の組み合わせを指します。この記事では、特定のテロワールの署名が多変量統計解析を用いて、ブドウ品種のコルビナのベリーメタボロームとトランスクリプトームで検出することができる方法を示しています。この方法は、まず、適切なサンプリング計画が必要です。このケーススタディでは、コルビナ品種の特定のクローンは遺伝的差異を最小限に抑えるように選択し、試料は、3つの異なる栽培期間中に三つの異なるマクロゾーンを表す7ブドウ畑から収集しました。非標的LC-MSメタボロミクスのアプローチはMZmineソフトウェアおよびフラグメンテーションツリー分析に基づいて、代謝物同定の戦略を使用して効率的なデータ処理を伴う、その高感度のために推奨されます。包括的トランスクリプトーム解析は、マイクロアレイを用いて達成することができますすべての〜99％をカバー含むプローブは異なるテロワールのコンテキスト内のすべての示差的に発現する遺伝子の同時分析を可能にする、ブドウの遺伝子を予測しました。最後に、投影法に基づいて、多変量データ解析は、メタボロミクスとトランスクリプトミクスデータを統合し、有益な相関を同定するために詳細に分析することを可能にする、強力なヴィンテージ特有の効果を克服するために使用することができます。

この資料に記載されているケーススタディでは、比較的189サンプル間の定量化分子イオンプラスその同位体、付加物およびいくつかの断片を含む552の信号（ のm / zの機能）、（7ブドウ畑×3熟成段階×3栽培期間xを含む最終データ行列が得られました3生物学的複製）。データポイントの合計数は、したがって、104328でした。断片化ツリー分析は、代謝産物に加えて付加体、同位体およびその断片に対応する282 のm / zの機能注釈をもたらしました。 PCAにより全データ行列の探索的分析は、熟成の段階に応じてサンプルがクラスタ化されたことが示された（veraison、半ば熟成と熟した）は、第1および第2主成分（T1-T2、 図2A）に沿って、かつ沿って成長する季節に応じて第3主成分（T1〜T3、 図2B）。 <img alt="図2"<html> SRC = &...

この記事では、 すなわち 、テロワールの概念を洞察するために、ベリー品質形質に対する環境の影響をブドウ果実の転写産物および代謝物への非標的メタボロミクス、トランスクリプトミクスと多変量統計解析のアプリケーションについて説明します。

Terroir refers to the combination of environmental factors that affect the characteristics of crops such as grapevine (Vitis vinifera) according to ...

これらの実験手順の全体的な目的は、ブドウ栽培品種Corvinaの果実のメタボロームおよびトランスクリプトームにおける異なるテロワールのシグネチャーを観察することです。本ケーススタディでは、3つの成長シーズンにわたり、3つのマクロゾーンにある7つのブドウ園から、3つの成熟段階のサンプルを収集し分析しました。ここで述べる手法により、果実のメタボロームに対する、ヴィンテージ効果を伴う支配的な成熟の影響が明らかになります。熟したベリーにおいても、3つのマクロゾーンを代表する明確な化学的シグネチャーが同定されました。マクロゾーンレベルでのテロワール・シグネチャーは、トランスクリプトームおよびメタボロームのデータマトリックスの両方を解析するために、PCA（主成分分析）やauto BLSDA（双方向直交投影潜在構造判別分析）などの適切な統計的手法を用いて明らかにされました。一方で、個々のブドウ園間の差異はよりわずかであり、より高度で感度の高い統計的アプローチが必要とされます。適切なサンプリング計画を策定することから実験を開始してください。サンプリング計画には、サンプリング場所、時間、および詳細なサンプリング手順が明記されていることを確認してください。2列のブドウの列に沿って異なる位置から30個の房を収穫した後、外見上の損傷や感染の兆候があるものを避け、各房から3粒のベリーを無作為に選択してください。この操作を繰り返し、各成熟段階について3つの独立したプールを調製します。ベリーから種子を取り除き、果皮を直ちに液体窒素で凍結させます。各プールの凍結したベリーをすべて自動ミルグラインダーで粉砕します。各粉末試料を、トランスクリプトーム解析用とメタボローム解析用の2等分に分けます。その後、ミルを閉じて取り出し、粉末を-80°Cで保存します。ベリー試料の代謝エキスは、0.1%ギ酸で酸性化した3容量のメタノールを用い、室温にて40 kHzの超音波バスで15分間処理して調製します。抽出物を4°Cで16,000 ×g、10分間遠心分離します。上清を2倍量の脱イオン水で希釈し、0.2 µmフィルターでろ過します。テキストプロトコルに従い、エレクトロスプレーイオン化源を備えた高速液体クロマトグラフィー質量分析計（HPLC-ESI-MSシステム）をセットアップします。溶媒AおよびBの線形グラジエントを用い、流速0.2 milliliters per minuteの一定速度でHPLC分離を行います。サンプル注入量は30 microlitersとしてください。テキストプロトコルに記載されたパラメータに従い、負および正のイオン化モードを交互に切り替えてマススペクトルを取得します。LCMSデータを処理するために、オープンソースソフトウェアであるM Zeta Mine（バージョン2.14）などの適切なソフトウェアを用いて、ピーク検出、アライメント、ギャップ充填、およびピークフィルタリングの手順を実施します。得られたテキストファイルをスプレッドシートにインポートします。これにより、同定番号、質量電荷比（m/z）、および保持時間によって認識されるすべての検出代謝物が、ピーク面積値として全サンプルで定量化されたデータマトリックスが作成されます。4パックフォーマットの仕様に基づき、41.8 µLの脱イオンRNAseフリー水で最終容量とし、1.65 µgのシアニン標識相補的RNAを添加してハイブリダイゼーションアセンブリを調製します。10Xブロッキング剤を11 µL、25Xフラグメンテーションバッファーを2.2 µL添加します。RNAを断片化するため、恒温槽を用いて60 °Cで30分間インキュベートします。30分後、直ちに氷上で1分間冷却します。最後に、2Xハイブリダイゼーションバッファーを55 µL加え、ピぺッティングにより十分に混ぜ合わせます。室温で15,500 ×gで1分間遠心分離した後、すぐにマイクロ遠心チューブを氷上に置きます。カスタムマイクロアレイをセットするために、ガスケットスライドのラベル面を上にし、ハイブリダイゼーションチャンバーの底部にセットします。気泡が入らないようにピペットのチップで液体を滴下しながら、ハイブリダイゼーションサンプル100 µLを各ガスケットウェルにゆっくりと分注します。カスタムマイクロアレイの数値バーコードが上を向くようにして、下向きにゆっくりと配置します。サンドイッチペアが正しく整列していることを確認してください。最後に、ハイブリダイゼーションチャンバーのカバーを挟み込んだスライドの上に置き、クランプをチャンバーに手で締め付けます。組み立てたチャンバーを回転させ、気泡の移動状況を確認します。組み立てたスライドチャンバーを、65 °Cに設定したハイブリダイゼーションオーブン内のバランス型ロティセリーに設置します。ローテーターを10 RPMに設定します。そのまま17時間ハイブリダイゼーションを行います。マイクロアレイスライドの洗浄に進むため、3枚のスライド染色皿を用意し、適切な洗浄バッファーを満たしておきます。2枚のディッシュに室温の洗浄バッファー1を、もう1枚のディッシュに予め温めておいた洗浄バッファー2を満たします。ハイブリダイゼーションチャンバーを分解し、サンドイッチを取り出します。マイクロアレイスライドの数値バーコードを上に向けた状態で、サンドイッチを室温の洗浄バッファー1が入った1枚目のスライド染色用ディッシュに浸し、清潔なピンセットを用いて、ガスケットをマイクロアレイスライドから切り離します。マイクロアレイスライドを速やかにスライドラックに移し、室温の洗浄バッファー1を満たした2番目のスライド染色容器に入れる。スライド染色容器をマグネチックスターラーに載せ、適度に撹拌しながら1分間洗浄する。スライドラックを速やかに、あらかじめ温めておいた洗浄バッファー2を満たした3番目のスライド染色容器に移し、適度に撹拌しながら1分間洗浄する。スライド染色皿からラックをゆっくりと取り出し、液滴がつかないように注意しながら、ラックからスライドを慎重に取り出します。マイクロアレイスライドを適切なスキャナーにセットし、マイクロアレイ製造業者の取扱説明書で推奨されているパラメータ設定を用いて、各アレイをスキャンします。統計解析ソフトを準備するために、まずメタボロミクスデータとトランスクリプトミクスデータをインポートします。[ファイル]、[新規レギュラープロジェクト]、[新規レギュラープロジェクト]の順に選択し、取得したデータマトリックスをインポートします。次に、[編集]をクリックします。マトリックス全体を転置し、[ホーム]を選択して、適切なプライマリIDおよびセカンダリIDを割り当てます。最後に、[完了]をクリックします。多変量統計解析を行うには、Worksetウィンドウに移動し、モデルタイプとしてPCAXを選択して、AutoFitをクリックします。Scoresを選択し、次にScatterを選択して、サンプルの分類の可能性を示すプロットを表示します。PCAスコアプロットを確認してください。良好なモデルが得られた場合は、同じサンプルのクラスを使用してO2PLS判別分析モデルを構築します。MacroZoneによって分類されたサンプルを用いて2つのO2PLS判別分析モデルを構築するには、[Home]ウィンドウから[New As]、[M1]、[Observations]の順に進み、クラスを割り当てます。目的のクラスを設定してください。次に、モデルタイプをPCAXからO2PLS判別分析に変更します。「Autofit」を押してください。プロジェクトウィンドウで「Select M2」を選択し、「Scores」から「Scatter」をクリックして、プロットとサンプルクラスの位置を確認します。「Select Data Type」に移動し、「Observations and Loadings」を選択します。次に「Add Series」をクリックし、「PQ correlation one」と「PQ correlation two」、または他にコンポーネントがある場合はそれらを選択します。プロット上でマウスの右ボタンを押し、「Property」から「Color」を選択し、さらに「By Terms」を選択して、分子およびクラスごとにプロット記号を区別します。Layout（レイアウト）、Format Plot（プロットのフォーマット）、Access（アクセス）またはStyles（スタイル）に移動し、目的の特性に合わせてプロットを修正します。1つまたは複数の特定のクラスを特徴付ける代謝物を観察するには、Plot List（プロットリスト）からScatter（散布図）を選択します。PCAによるデータマトリックス全体の探索的解析の結果、サンプルは第一主成分および第二主成分に沿って、ヴェレゾン期、成熟中期、完熟期を含む成熟段階に応じてクラスターを形成することが示されました。サンプルは、第3主成分に沿って生育シーズンごとにクラスター化されました。成熟したベリーのO2PLS判別分析により、Valpolicella、Garda Lake、Soaveの3つのマクロゾーンを代表する特定のテロワールシグネチャーの特定が可能となります。これらのモデルのローディングプロットは、サンプルのクラスであるPと、代謝物であるQとの相関であるPQ相関として示されています。ローディングプロットにおいて、赤色の正方形はサンプルまたはマクロゾーンのクラスを表し、色付きの三角形は個々の代謝物を表しています。代謝物は化学的な分類に従って色分けされており、代謝物とサンプルの間の距離はそれらの相関関係を反映しています。ガルダ湖のマクロゾーンはスチルベンによって特徴付けられていた一方、ソアヴェとヴァルポリチェッラはフラボノイドによって特徴付けられていました。アントシアニンのうち、ペオニジンとその誘導体はガルダ湖マクロゾーンでより多く見られた一方、その他のアントシアニンはヴァルポリチェッラマクロゾーンでより多く見られました。さらに、アントシアニン-3-O-グルコシドはヴァルポリチェッラマクロゾーンでより多く見られたのに対し、アシル化およびクマル酸誘導体はソアヴェマクロゾーンでより多く見られました。トランスクリプトーム解析、RA、およびRNA sig法を用いることで、数千のブドウの転写産物を同時にモニタリングすることが可能です。最近、新たなカスタムマイクロアレイが設計され、さらに多くのプローブが含まれるようになりました。これにより、新たに見出されたブドウ属の種をより多く網羅することが可能です。トランスクリプトーム解析プラットフォームの陳腐化は早いため、旧プラットフォームよりも多くのプローブを含む新プラットフォームを用いた代替的な手順について詳述しました。これには、1392個の新たに同定されたpeno遺伝子座に対する249個のpeno予測転写産物と、179個のcorvina prava遺伝子が含まれています。HPLC-ESI-MSによるメタボロミクス解析は、多数の代謝物を同時に検出できる十分な感度を備えています。サンプリング平面を構築できる能力は極めて重要です。遺伝的な差異を最小限に抑えるために単一のクローンを選択し、サンプリング期間を複数回にわたって設定したことで、テロワール間の真の差異を特定することができました。より最適ではない地域で栽培された同一の品種を比較することは興味深いと考えられますが、残念ながら、そのような葡萄園は利用できませんでした。

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

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グレープベリーメタボロミクスとトランスクリプトを通して解釈テロワールコンセプト

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