グレープベリーメタボロミクスとトランスクリプトを通して解釈テロワールコンセプト

これらの実験手順の全体的な目的は、ブドウ栽培品種Corvinaの果実のメタボロームおよびトランスクリプトームにおける異なるテロワールのシグネチャーを観察することです。本ケーススタディでは、3つの成長シーズンにわたり、3つのマクロゾーンにある7つのブドウ園から、3つの成熟段階のサンプルを収集し分析しました。ここで述べる手法により、果実のメタボロームに対する、ヴィンテージ効果を伴う支配的な成熟の影響が明らかになります。

熟したベリーにおいても、3つのマクロゾーンを代表する明確な化学的シグネチャーが同定されました。マクロゾーンレベルでのテロワール・シグネチャーは、トランスクリプトームおよびメタボロームのデータマトリックスの両方を解析するために、PCA（主成分分析）やauto BLSDA（双方向直交投影潜在構造判別分析）などの適切な統計的手法を用いて明らかにされました。一方で、個々のブドウ園間の差異はよりわずかであり、より高度で感度の高い統計的アプローチが必要とされます。

適切なサンプリング計画を策定することから実験を開始してください。サンプリング計画には、サンプリング場所、時間、および詳細なサンプリング手順が明記されていることを確認してください。2列のブドウの列に沿って異なる位置から30個の房を収穫した後、外見上の損傷や感染の兆候があるものを避け、各房から3粒のベリーを無作為に選択してください。

この操作を繰り返し、各成熟段階について3つの独立したプールを調製します。ベリーから種子を取り除き、果皮を直ちに液体窒素で凍結させます。各プールの凍結したベリーをすべて自動ミルグラインダーで粉砕します。

各粉末試料を、トランスクリプトーム解析用とメタボローム解析用の2等分に分けます。その後、ミルを閉じて取り出し、粉末を-80°Cで保存します。ベリー試料の代謝エキスは、0.1%ギ酸で酸性化した3容量のメタノールを用い、室温にて40 kHzの超音波バスで15分間処理して調製します。

抽出物を4°Cで16,000 ×g、10分間遠心分離します。上清を2倍量の脱イオン水で希釈し、0.2 µmフィルターでろ過します。テキストプロトコルに従い、エレクトロスプレーイオン化源を備えた高速液体クロマトグラフィー質量分析計（HPLC-ESI-MSシステム）をセットアップします。

溶媒AおよびBの線形グラジエントを用い、流速0.2 milliliters per minuteの一定速度でHPLC分離を行います。サンプル注入量は30 microlitersとしてください。テキストプロトコルに記載されたパラメータに従い、負および正のイオン化モードを交互に切り替えてマススペクトルを取得します。LCMSデータを処理するために、オープンソースソフトウェアであるM Zeta Mine（バージョン2.14）などの適切なソフトウェアを用いて、ピーク検出、アライメント、ギャップ充填、およびピークフィルタリングの手順を実施します。

得られたテキストファイルをスプレッドシートにインポートします。これにより、同定番号、質量電荷比（m/z）、および保持時間によって認識されるすべての検出代謝物が、ピーク面積値として全サンプルで定量化されたデータマトリックスが作成されます。4パックフォーマットの仕様に基づき、41.8 µLの脱イオンRNAseフリー水で最終容量とし、1.65 µgのシアニン標識相補的RNAを添加してハイブリダイゼーションアセンブリを調製します。

10Xブロッキング剤を11 µL、25Xフラグメンテーションバッファーを2.2 µL添加します。RNAを断片化するため、恒温槽を用いて60 °Cで30分間インキュベートします。30分後、直ちに氷上で1分間冷却します。

最後に、2Xハイブリダイゼーションバッファーを55 µL加え、ピぺッティングにより十分に混ぜ合わせます。室温で15,500 ×gで1分間遠心分離した後、すぐにマイクロ遠心チューブを氷上に置きます。カスタムマイクロアレイをセットするために、ガスケットスライドのラベル面を上にし、ハイブリダイゼーションチャンバーの底部にセットします。

気泡が入らないようにピペットのチップで液体を滴下しながら、ハイブリダイゼーションサンプル100 µLを各ガスケットウェルにゆっくりと分注します。カスタムマイクロアレイの数値バーコードが上を向くようにして、下向きにゆっくりと配置します。サンドイッチペアが正しく整列していることを確認してください。

最後に、ハイブリダイゼーションチャンバーのカバーを挟み込んだスライドの上に置き、クランプをチャンバーに手で締め付けます。組み立てたチャンバーを回転させ、気泡の移動状況を確認します。組み立てたスライドチャンバーを、65 °Cに設定したハイブリダイゼーションオーブン内のバランス型ロティセリーに設置します。

ローテーターを10 RPMに設定します。そのまま17時間ハイブリダイゼーションを行います。マイクロアレイスライドの洗浄に進むため、3枚のスライド染色皿を用意し、適切な洗浄バッファーを満たしておきます。

2枚のディッシュに室温の洗浄バッファー1を、もう1枚のディッシュに予め温めておいた洗浄バッファー2を満たします。ハイブリダイゼーションチャンバーを分解し、サンドイッチを取り出します。マイクロアレイスライドの数値バーコードを上に向けた状態で、サンドイッチを室温の洗浄バッファー1が入った1枚目のスライド染色用ディッシュに浸し、清潔なピンセットを用いて、ガスケットをマイクロアレイスライドから切り離します。

マイクロアレイスライドを速やかにスライドラックに移し、室温の洗浄バッファー1を満たした2番目のスライド染色容器に入れる。スライド染色容器をマグネチックスターラーに載せ、適度に撹拌しながら1分間洗浄する。スライドラックを速やかに、あらかじめ温めておいた洗浄バッファー2を満たした3番目のスライド染色容器に移し、適度に撹拌しながら1分間洗浄する。

スライド染色皿からラックをゆっくりと取り出し、液滴がつかないように注意しながら、ラックからスライドを慎重に取り出します。マイクロアレイスライドを適切なスキャナーにセットし、マイクロアレイ製造業者の取扱説明書で推奨されているパラメータ設定を用いて、各アレイをスキャンします。統計解析ソフトを準備するために、まずメタボロミクスデータとトランスクリプトミクスデータをインポートします。

[ファイル]、[新規レギュラープロジェクト]、[新規レギュラープロジェクト]の順に選択し、取得したデータマトリックスをインポートします。次に、[編集]をクリックします。マトリックス全体を転置し、[ホーム]を選択して、適切なプライマリIDおよびセカンダリIDを割り当てます。最後に、[完了]をクリックします。

多変量統計解析を行うには、Worksetウィンドウに移動し、モデルタイプとしてPCAXを選択して、AutoFitをクリックします。Scoresを選択し、次にScatterを選択して、サンプルの分類の可能性を示すプロットを表示します。PCAスコアプロットを確認してください。

良好なモデルが得られた場合は、同じサンプルのクラスを使用してO2PLS判別分析モデルを構築します。MacroZoneによって分類されたサンプルを用いて2つのO2PLS判別分析モデルを構築するには、[Home]ウィンドウから[New As]、[M1]、[Observations]の順に進み、クラスを割り当てます。目的のクラスを設定してください。

次に、モデルタイプをPCAXからO2PLS判別分析に変更します。「Autofit」を押してください。プロジェクトウィンドウで「Select M2」を選択し、「Scores」から「Scatter」をクリックして、プロットとサンプルクラスの位置を確認します。

「Select Data Type」に移動し、「Observations and Loadings」を選択します。次に「Add Series」をクリックし、「PQ correlation one」と「PQ correlation two」、または他にコンポーネントがある場合はそれらを選択します。プロット上でマウスの右ボタンを押し、「Property」から「Color」を選択し、さらに「By Terms」を選択して、分子およびクラスごとにプロット記号を区別します。

Layout（レイアウト）、Format Plot（プロットのフォーマット）、Access（アクセス）またはStyles（スタイル）に移動し、目的の特性に合わせてプロットを修正します。1つまたは複数の特定のクラスを特徴付ける代謝物を観察するには、Plot List（プロットリスト）からScatter（散布図）を選択します。PCAによるデータマトリックス全体の探索的解析の結果、サンプルは第一主成分および第二主成分に沿って、ヴェレゾン期、成熟中期、完熟期を含む成熟段階に応じてクラスターを形成することが示されました。

サンプルは、第3主成分に沿って生育シーズンごとにクラスター化されました。成熟したベリーのO2PLS判別分析により、Valpolicella、Garda Lake、Soaveの3つのマクロゾーンを代表する特定のテロワールシグネチャーの特定が可能となります。これらのモデルのローディングプロットは、サンプルのクラスであるPと、代謝物であるQとの相関であるPQ相関として示されています。

ローディングプロットにおいて、赤色の正方形はサンプルまたはマクロゾーンのクラスを表し、色付きの三角形は個々の代謝物を表しています。代謝物は化学的な分類に従って色分けされており、代謝物とサンプルの間の距離はそれらの相関関係を反映しています。ガルダ湖のマクロゾーンはスチルベンによって特徴付けられていた一方、ソアヴェとヴァルポリチェッラはフラボノイドによって特徴付けられていました。

アントシアニンのうち、ペオニジンとその誘導体はガルダ湖マクロゾーンでより多く見られた一方、その他のアントシアニンはヴァルポリチェッラマクロゾーンでより多く見られました。さらに、アントシアニン-3-O-グルコシドはヴァルポリチェッラマクロゾーンでより多く見られたのに対し、アシル化およびクマル酸誘導体はソアヴェマクロゾーンでより多く見られました。トランスクリプトーム解析、RA、およびRNA sig法を用いることで、数千のブドウの転写産物を同時にモニタリングすることが可能です。

最近、新たなカスタムマイクロアレイが設計され、さらに多くのプローブが含まれるようになりました。これにより、新たに見出されたブドウ属の種をより多く網羅することが可能です。トランスクリプトーム解析プラットフォームの陳腐化は早いため、旧プラットフォームよりも多くのプローブを含む新プラットフォームを用いた代替的な手順について詳述しました。これには、1392個の新たに同定されたpeno遺伝子座に対する249個のpeno予測転写産物と、179個のcorvina prava遺伝子が含まれています。HPLC-ESI-MSによるメタボロミクス解析は、多数の代謝物を同時に検出できる十分な感度を備えています。

サンプリング平面を構築できる能力は極めて重要です。遺伝的な差異を最小限に抑えるために単一のクローンを選択し、サンプリング期間を複数回にわたって設定したことで、テロワール間の真の差異を特定することができました。より最適ではない地域で栽培された同一の品種を比較することは興味深いと考えられますが、残念ながら、そのような葡萄園は利用できませんでした。