Name: 環境病原体に対するヒトの暴露を測定するために唾液抗体マルチプレックスイムノアッセイの開発 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: 学ぶ ビーズベースの唾液抗体マルチプレックスイムノアッセイを用いて、複数の環境病原体へのヒトの暴露を同時測定する方法。この技術は暴露科学研究の効率と精度を向上させ、公衆衛生戦略に貢献します。

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Clarissa Curiosoは、米国エネルギー省と米国環境保護庁との間の省庁間協定を通じて、オークリッジ科学教育研究所が管理する米国環境保護庁の研究参加プログラムへの任命を通じて支援を受けました。

承認は、米国の一部として、プエルトリコ、ボケロンビーチでbeachgoersから刺激滲出唾液サンプルを収集するための治験審査委員会（IRB＃08から1844まで、ノースカロライナ大学チャペルヒル、ノースカロライナ州、米国）から入手しました環境保護庁（USEPA）国立疫学およびレクリエーション（NEEAR）水研究23の環境アセスメントは、水泳関連エクスポージャーや病気を評価しました。被験者は、インフォームドコンセントを提供し、訓練を受けたUSEPA請負業者によって唾液収集装置の使用を指示されました。唾液サンプルを受信すると、それらを遠心分離し、そして4に記載のように-80℃で保存し、氷上で輸送しました。 1.ビーズのアクティベーション<ol><li>ボルテックスし、20秒間超音波処理し、マイクロ遠心チューブにストックビーズ（400μL）の転送が約5.0×10 6により再懸濁ビーズセットを取り揃えております。 注：T彼は、12.5×10 6ビーズ/ mlの濃度で供給されているビーズ。 </li><li> 2分間万×gで遠心分離することにより、在庫ビーズをペレット化。 </li><li> 20秒間ボルテックスし、超音波処理により蒸留水（のdH 2 O）の上清を除去し、100μlのペレット化したビーズを再懸濁します。繰り返し手順1.2。 </li><li>上清を除去し、20秒間ボルテックスし、超音波処理により100mMの一塩基性リン酸ナトリウム、pHが6.2の80μlの洗浄したビーズを再懸濁します。 </li><li>使用直前に、10mgのスルホ-NHSのアリコートに200μlののdH 2 Oを添加することにより、50 mg / mlでN -hydroxysulfosuccinimide（スルホ-NHS）ソリューションとなります。ボルテックスで混ぜます。 </li><li>ビーズに50 mg / mlでスルホ-NHSの10μLを加えます。ボルテックスで混ぜます。 </li><li>使用直前に、10 mgのEDCアリコートに200μlの蒸留水（のdH 2 O）を添加することにより、50 mg / mlで1-エチル- [3dimethylaminopropyl]カルボジイミド塩酸塩（EDC）ソリューションとなります。ボルテックスで混ぜます。 </li><li> 50の10μLを追加ビーズのmg / mlでEDC溶液。ボルテックスで混ぜます。 10分間隔でボルテックスすることによって混合しながら、暗所で、室温で20分間ビーズをインキュベートします。 2分間万×gでマイクロ遠心によって活性化ビーズをペレット。 </li><li>上清を除去し、20秒間ボルテックスし、超音波処理により、50mMの2- [N-モルホリノ]エタンスルホン酸（MES）、pH5.0の250μlの中でビーズを再懸濁します。 </li><li> 2分間万×gでマイクロ遠心によって活性化ビーズをペレット。 </li><li>繰り返しは、1.9と1.10を繰り返します。 注：これはの50mM MES、pHが5.0で2回の洗浄の合計を提供します。 </li><li> 20秒間ボルテックスし、超音波処理によっての50mM MES、pH5.0の100μlの中のビーズを再懸濁します。 </li></ol> 2.ビーズカップリング<ol><li>対を表1に示す濃度を用いてビーズセットの抗原。 </li><li>活性化ビーズに各抗原を追加し、50mMのMES、pHを5.0に500μlの総容積をもたらします。抗原をミックスAN渦により、Dビーズ。 </li><li>暗所で室温で回転（〜15回転）で混合しながら2時間のための抗原とビーズをインキュベートします。 2分間万×gでマイクロ遠心によって結合されたビーズをペレット化。 </li><li>上清を除去し、リン酸緩衝生理食塩水500μlのビーズを再懸濁（PBS）-bovine血清アルブミン（BSA）-polyoxyethylenesorbitanラウレート（ツイーン20） - ナトリウムアジド（PBS-TBN）ボルテックスし、超音波処理することによりpHを7.4。 2分間万×gで微量遠心によりビーズをペレット化し、上清を除去します。 注意：アジ化ナトリウムは急性毒性化学物質です。飲み込んだり皮膚に接触して取得する場合には致命的です。粉じん/煙/ガス/ミスト/蒸気やスプレーを吸入しないこと。取り扱う際は、適切な個人用保護具（P​​PEの）を着用し、適切な法律に従って処分します。 </li><li> 20秒間ボルテックスし、超音波処理によりPBS-TBNの1ミリリットル中のビーズを再懸濁します。 </li><li> 2分間万×gで微量遠心によりビーズをペレット。 </li><li>繰り返しは、2.5と2.6を繰り返します。 注：これは、PBS-TBNで2回洗浄の合計を提供します。 </li><li> 1mlのPBS、1％BSA、0.05％アジド、pH​​7.4中で結合し、洗浄したビーズを再懸濁します。暗所で2〜8℃の冷蔵庫に結合されたビーズを保管してください。 </li></ol> 3.ビーズカウント<ol><li>水またはPBS緩衝液中で結合されたビーズの1:10希釈液を準備します。 </li><li>試料導入点での血球計数器への負荷のビーズ希釈液10μLを。 </li><li> 4×4コーナーグリッドの1に見られるビーズを数えます。以下の式を用いて結合されたビーズの総数を計算する：数（4×4のグリッドの1角）×（1×10 4）×（希釈係数）はミリリットルに再懸濁体積をxは。 </li></ol>抗原結合の4確認<ol><li> 20秒間ボルテックスし、超音波処理により、目的の抗原に結合されたビーズの原料混合物を再懸濁します。 </li><li>最終的に結合されたビーズストックを希釈することにより、作業ビーズ混合物を準備します100ビーズ/ PBS-1％BSA緩衝液（PBS-1％BSA、pH7.4）中で設定された各固有のビーズμlの濃度。 </li><li> PBS-1％BSA緩衝液を用いて丸底プレートの96ウェルで、製造業者の推奨に従って抗種IgGを一次抗体の少なくとも7 2倍連続希釈液を調製します。 </li><li>洗浄バッファー100μlの各抗原結合確認試験のための96ウェルフィルター底プレートの別々の8ウェル列（8列）をプリウェット及び真空により上清を除去します。プリウェットウェルに取り組んビーズ混合物（抗原結合ビーズ）の50μLを加えます。 </li><li>バックグラウンドウェルとして機能するように希釈した抗体の代わりに 8行するために、96ウェルフィルタープレートの各列の列1-7とPBS-1％BSA緩衝液の50μlに抗体希釈液50μlを加えます。ピペッティングによって、および5回上下マルチチ​​ャンネルピペッターで混ぜます。確認するように設定し、すべての抗原結合ビーズと同じ手順を実行します。 </li><li>覆い、室温の暗所でインキュベートすることを可能にします500 rpmでマイクロプレートシェーカー上で1時間erature。真空により上清を取り除きます。 </li><li>洗浄緩衝液100μlでウェルを洗浄し、真空により上清を除去します。 1倍を繰り返します。マルチチャンネルピペッターを用いてPBS-1％BSA50μlのビーズを再懸濁します。 </li><li> PBS-1％BSA中の16μg/ mlにビオチン化抗種に特異的なIgG二次検出抗体を希釈します。 </li><li>ダウン5回ピペッティングにより各ウェルに希釈した二次抗体を50μl加えます。 </li><li>フィルタープレートを覆い、プレートシェーカー上で30分間室温で暗所でインキュベートすることを可能にします。真空により上清を取り除きます。洗浄緩衝液100μlでウェルを洗浄し、真空により上清を除去します。洗浄1Xを繰り返します。 </li><li>マルチチャンネルピペッターを用いてPBS-1％BSA50μlのビーズを再懸濁します。 </li><li> PBS-1％BSA中24 / mlのにストレプトアビジンR-フィコエリトリンレポーター（SAPE）を希釈します。 </li><li>各ウェルにレポーターの50μLを加え、ピペッティングによって、および5回上下混ぜます。 </li><li> C言語フィルタープレート上、プレートシェーカー上で30分間室温で暗所でインキュベートすることを可能にします。真空により上清を取り除きます。洗浄緩衝液100μlでウェルを洗浄し、真空により上清を除去します。洗浄1Xを繰り返します。 </li><li> PBS-1％BSAの100μl中に再懸濁ビーズおよびアナライザ29を使用して50μLを分析します。 注：ビーズベースのマルチプレックスイムノアッセイの結果は、中央値蛍光強度（MFI）で測定されます。エラーを回避するために利用可能な場合は常に、ソフトウェアのマニュアルの最新版を参照してください。 </li></ol> 5.唾液マルチプレックスイムノアッセイ<ol><li> -80°Cフリーザーから唾液を外し、室温で解凍することができます。 </li><li>再懸濁抗原は、20秒間ボルテックスし、超音波処理により、ビーズストックを結合さ。 </li><li> 100ビーズ/ PBS-1％BSA緩衝液で設定した各ユニークなビーズのμlの最終濃度に結合されたビーズストックを希釈することにより、作業ビーズ混合物を準備します。 </li><li>唾液の4希釈ワット：1を準備します96ウェル、ディープウェルプレート中のPBS-1％BSA緩衝液番目。 </li><li>プリウェットフィルター洗浄緩衝液100μlでプレートと真空により上清を除去します。 </li><li> 8最終希釈：作業ビーズ混合物および1のための96ウェルフィルタープレートの95ウェルに希釈した唾液の同体​​積の50μLを加えます。マルチチャンネルピペッターとの反応を混ぜます。 1つのウェルコントロールに、50μlの抗原結合ビーズプラス（唾液の代替として）PBS-1％BSA緩衝液50μlを追加します。 </li><li>覆い、500rpmで、マイクロプレートシェーカー上で1時間室温で暗所でインキュベートすることを可能にします。真空により上清を取り除きます。洗浄緩衝液100μlでウェルを洗浄し、真空により上清を除去します。洗浄1Xを繰り返します。 </li><li>マルチチャンネルピペッターを有するPBS-1％BSA50μlに再懸濁ビーズ。 </li><li> PBS-1％BSAで16 / mlのビオチン化ヤギ抗ヒトIgG二次検出抗体を希釈します。 </li><li>各ウェルに二次抗体を希釈した50μlのを追加して内容物を混合マルチチャンネルピペッター。 </li><li>フィルタープレートを覆い、プレートシェーカー上で30分間室温で暗所でインキュベートすることを可能にします。真空により上清を取り除きます。洗浄緩衝液100μlでウェルを洗浄し、真空により上清を除去します。洗浄1Xを繰り返します。 </li><li>マルチチャンネルピペッターを有するPBS-1％BSA50μlに再懸濁ビーズ。 </li><li> PBS-1％BSA中24 / mlのにストレプトアビジンR-フィコエリトリンレポーター（SAPE）を希釈します。 </li><li>各ウェルに50μlのレポーターを追加し、マルチチャンネルピペッターで混ぜます。 </li><li>フィルタープレートを覆い、プレートシェーカー上で30分間室温で暗所でインキュベートすることを可能にします。真空により上清を取り除きます。洗浄緩衝液100μlでウェルを洗浄し、真空により上清を除去します。洗浄1Xを繰り返します。 </li><li> PBS-1％BSAの100μl中に再懸濁ビーズおよびアナライザ29を使用して50μLを分析します。 注意：マルチプレックスイムノアッセイの結果は、蛍光強度中央値（MFI）単位で測定されています。常にを参照してください。ソフトウェアマニュアルの最新バージョン、エラーを回避するために利用可能な場合。 </li></ol>

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研究開発のその事務所を通じて米国環境保護庁が資金を提供し、ここで説明する研究を管理していました。これは、庁の行政審査を受け、出版が承認されました。商号又は商業製品に関する記述は、使用のための承認または推奨するものではありません。

これらの結果は、マルチプレックスイムノアッセイ法は、免疫または免疫陰性である唾液サンプルとを区別するために有用であることを示しています。免疫陽性を決定するために、シングルカットオフポイントは、平均+唾液試料のすべてでテスト制御カップリングしていないビーズの対数変換MFI応答の3つの標準偏差を計算することによって開発されました。カットオフポイントは、単一または複数の病原体への曝露とimmunoprevalenceを評価する能力を得ました。この弁別力は、環境および他の病原体への曝露に関連した健康リスクを調査するために集団研究において有用であり得ます。 MFIの分布、非結合対照とどの研究が答えるように設計された質問に応じてカットオフ点を決定するために用いることができる他のいくつかの方法があります。カットオフを決定するためのいくつかの例は、有限混合モデル24-26を含む平均プラス3コントロールへの応答の標準偏差、平均値プラスコントロールへの応答の2標準偏差、および3回のコントロール27,28に対する応答の平均。単純なスクリーニングのために、あま...

下痢関連の病気の85八パーセントは、全世界で約150万人の死亡を引き起こし、汚染された水へのヒトの暴露、危険な食品、および不衛生/衛生状態に関連付けられている、の大半は子供1です 。これは、公衆衛生当局や政策立案者のための懸念の主な原因です。水性およびその他の環境の病原体に関連したエクスポージャーや病気を調査するための努力で、我々は、ヒト試料2-4中の抗体を測定するためのマルチプレックスイムノアッセイを開発しました。この方法は、これらの病原体へのヒトの暴露を決定するために、より良いimmunoprevalence入射感染を定義するために疫学的研究に適用することができます。 唾液は、人間のバイオマーカー研究のための血清の代替としてかなりの可能性を秘めています。唾液を使用する利点の中でも、サンプル収集、低コストの非侵襲性と使いやすさであり、試料を容易に&lt;子供5-7から収集することができます/ SUP&gt;。血清および唾液サンプルは、Hに対する抗体のために広く研究されてきましたピロリ 2,3,8、 熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）9、 赤痢アメーバ 10、クリプトスポリジウム 3,11、 肺炎連鎖球菌 12、肝炎ウイルスAとC 13-14、 ノロウイルス 2-4,15、T.ゴンジ 2-4、デング熱ウイルス16、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）17、および大腸菌 O157：H7 18。 マルチプレックスイムノアッセイは同時に単一のサンプルボリューム内および単一サイクルまたは実行中の複数の検体の分析を可能にします。 C.からの多重化抗原ジェジュニ 、T.ゴンジ、ピロリ菌は、A型肝炎ウイルス、および2つのノロウイルスを使用して、これらの病原体に対するヒト唾液のIgGおよびIgA 2-4 3,4および血漿のIgG 2,3抗体応答を測定するために使用されましたビーズベースの多重化イムノアッセイ。水、土壌、食品中の微生物への曝露の疫学的研究に関連して使用される場合、本研究において記載されるアッセイのタイプは、環境病原体によって引き起こされる感染症の理解を高めるために貴重な情報を提供することができます。また、このような研究から得られた唾液抗体のデータは、リスク評価モデル19-22を改善するために使用することができます。

<table><tbody><tr><td>機器とソフトウェア</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心分離</td>機 <td>サーモエレクトロンコーポレーション</td><td>75002446</td><td>サンプルを遠心分離するために使用されます</td></tr><tr><td>ボルテックスミキサー</td><td>VWR</td><td>G560</td><td>サンプルを混合するために使用されます</td></tr><tr><td>ソニケーター (ミニ)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>15-337-22</td><td>ビーズを分離するために使用されます</td></tr><tr><td>ピペッター P10、P20、P100、P1000、8チャンネル。</td><td>キャップ</td><td>各種</td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤(ブライトライン)</td><td>Housser Scientific&nbsp;</td><td>3200</td><td>結合ビーズを数えるために使用</td></tr><tr><td>マルチスクリーン真空マニホールド</td><td>ミリポア</td><td>MSVMHTS00</td><td>上澄みを除去するための洗浄ステップで使用</td></tr><tr><td>マイクロシェーカー</td><td>VWR</td><td>12620-926</td><td>インキュベーション中にビーズを攪拌するために使用</td></tr><tr><td>チューブラック(1.5mlおよび0.5ml)(アソート)</td> <td>VWR</td><td>30128-346</td><td></td></tr><tr><td>計量スケール</td><td>メトラーまたはその他</td><td></td><td>バッファー作製用洗浄試薬の測定に使用</td></tr><tr><td>Dynabead Sample Mixer</td><td>Invitrogen</td><td>947-01</td><td>カップリングインキュベーションステップで使用</td></tr><tr><td>MatLab (R2014b)</td><td>The MathWorks, Inc.</td><td></td><td>抗体応答データの分析に使用</td></tr><tr><td>Microsoft Excel 2014</td><td>Microsoft Corporation</td><td></td><td>抗体応答データの分析に使用</td></tr><tr><td>Luminex Analyzer with xPonent 3.1 software</td><td>Luminex Corporation</td><td>LX200-XPON3.1</td><td>assay</td></tr><tr><td>Antigens</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GI.1 Norwalk Virus: p-particle</td><td>Xi の実行に使用江(CCHMC)*</td> <td>NA</td> <td>*シンシナティ小児病院。ファイナル・コンc. 5 &micro;g.</td></tr><tr><td>GII.4 ノロウイルス VA387: p-粒子</td><td>Xi Jiang (CCHMC)*</td><td>NA</td><td>*シンシナティ小児病院.ファイナル・コンc. 5 &micro;g.</td></tr><tr><td>A型肝炎ウイルス:細胞培養からのグレードII濃縮物</td><td>Meridian Life Sciences</td><td>8505</td><td>抗原は100 & microで結合。g</td></tr><tr><td>ヘリコバクター ピロリ: ライセート</td><td>Meridian Life Sciences</td><td>R14101</td><td>抗原 25 & micro;g</td></tr><tr><td>トキソプラズマ原虫:組換えp30(SAG1)</td><td>Meridian Life Sciences</td><td>R18426</td>抗原は<td>25で結合しました。g</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni:熱は全細胞を殺しました</td><td>KPL</td><td>50-92-93</td><td>抗原は50で結合しました。g</td></tr><tr><td>Primary Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>モルモット抗ノロウイルス</td><td>(CCHMC)*</td><td>NA</td><td>カップリング確認に使用</td></tr><tr><td>マウス抗A型肝炎IgG</td><td>メリディアンライフサイエンス</td><td>C65885M</td><td>カップリング確認に使用</td></tr> マウス<tr><td>抗A型肝炎IgG</td><td>メリディアンライフサイエンス</td><td>C65885M</td><td>カップリング確認に使用</td></tr><tr><td>BacTraceAffinity 精製抗体 Helicobacter pylori</td><td>KPL</td><td>01-93-94</td><td>カップリング確認に使用</td></tr><tr><td>ヤギ pAb to トキソプラズマ gondii</td><td>Abcam</td><td>Ab23507</td><td>カップリング確認に使用</td></tr><tr><td>BacTrace ヤギ 抗カンピロバクター</エム>種</td><td>KPL</td><td>01-92-93</td> カップリング<td>確認</td></tr><tr><td>に使用<ストロング>セカンダリ&nbsp;抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ビオチン-SP-結合型アフィニピュアロバ抗ヤギIgG(H+L)</td><td>ジャクソン</td><td>705-065-149</td><td>カップリング確認に使用</td></tr><tr><td>ビオチン化ウサギ抗ヤギIgG(H+L)</td><td>KPL</td><td>16-13-06</td><td>カップリング確認に使用</td></tr><tr><td>ビオチン化ヤギ抗マウスIgG(H+L)</td><td>KPL</td><td>16-18-06</td><td>カップリング確認</td></tr><tr><td>に使用親和性精製抗体ビオチン標識ヤギ抗ウサギIgG(H + L)</td><td>KPL</td><td>176-1506</td><td>カップリングの確認</td></tr><tr><td>消耗品</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5ml共重合体微量遠心チューブ</td><td>USAサイエンティフィック</td><td>1415-2500</td><td>低結合微量遠心チューブとして使用</td></tr><tr><td>10 & マイクロ;lピペットチップリフィル</td><td>BioVentures</td><td>5030050C</td><td></td></tr><tr><td>200 & マイクロ;lピペットチップリフィル</td><td>BioVentures</td><td>5030080C</td><td></td></tr><tr><td>1,000 & マイクロ;lピペットチップは</td><td>BioVentures</td>を補充します<td>5130140C</td><td></td></tr><tr><td>アルミホイル</td><td>様々なベンダー</td><td></td><td>インキュベーション中にビーズを暗闇に保ちます</td></tr><tr><td>ディープウェルプレート</td><td>VWR</td><td>40002-009</td><td>唾液サンプルの希釈に使用</td></tr><tr><td>マルチスクリーンフィルタープレート</td><td>ミリポア</td><td>MABVN1250</td><td>アッセイを実行するために使用されます</td></tr><tr><td>Oracol 唾液収集システム</td><td>Malvern Medical開発限定</td><td></td><td>唾液採取に使用</td></tr><tr><td><強>試薬</強></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>カルボキシル化マイクロスフェア(ビーズ)</td>ル<td>ミネックスコーポレーション</td><td>ビーズセットに依存</td><td>抗原はマイクロスフェアに結合しています</td></tr><tr><td>EDC (1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩)</td> <td>Pierce</td><td>77149または22980</td><td>ビーズ活性化</td></tr><tr><td>に使用スルホ-NHS(N-ヒドロキシスルホスクシンイミド)</td><td>Pierce</td><td>24510</td><td>ビーズ活性化に使用</td></tr><tr><td>ステプタビジン-R-フィコエリトリン(1 mg / ml)</td><td>分子プローブ</td><td>S-866</td><td>レポーターとして使用</td></tr><tr><td>MES(2-[N-モルフォリノ]エタンスルホン酸)</td><td>シグマ</td><td>M-2933</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20(ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート)</td><td>シグマ</td><td>のカップリングに使用P-9416</td><td>洗浄緩衝液で非特異的な結合</td></tr><tr><td><強>タンパク質緩衝液</強><</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>強>PBS-TBNブロッキング/保存緩衝液(PBS、0.1%BSA、0.02%Tween-20、0.05%アジド、pH 7.4)**</td><td></td><td></td><td>フィルター滅菌して4°Cで保存します。C</td></tr><tr><td>PBS、pH 7.4</td><td>シグマ</td><td>P-3813</td><td>138 mM NaCl、2.7 mM KCl</td></tr><tr><td>BSA</td><td>シグマ</td><td>A-7888</td><td>0.1% (w/v)</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>シグマ</td><td>P-9416</td><td>0.2% (v/v)</td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム (0.05% アジド)**</td><td>シグマ</td><td>S-8032</td><td>**注意: アジ化ナトリウムは急性毒性があります。皮膚や目との接触を避けてください。適切なPPEを着用してください。適用される法律に従って廃棄してください。</td></tr><tr><td>MES/カップリングバッファー (0.05 M MES, pH 5.0)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MES (2-[N-モルフォリノ]エタンスルホン酸)</td><td>Sigma</td><td>S-3139</td><td></td></tr><tr><td>5 N NaOH</td><td>Fisher</td><td>SS256-500</td><td></td></tr><tr><td>Assay Buffer (PBS, 1% BSA, pH 7.4)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Filter 滅菌し、4°Cで保管します。C</td></tr><tr><td>PBS、1% BSA、pH 7.4</td><td>Sigma</td><td>P-3688</td><td>138 mM NaCl、2.7 mM KCl、1% BSA</td></tr><tr><td>活性化バッファー (0.1 M NaH2PO4、 pH 6.2)</td><td></td><td></td><td>Filter 滅菌し、4°Cで保管してください。C</td></tr><tr><td>NaH2PO4 (リン酸ナトリウム、一塩基性無水)</td><td>Sigma</td><td>S-3139</td><td>0.1 M NaH2PO4</td></tr><tr><td>5 N NaOH</td><td>Fisher</td><td>SS256-500</td><td></td></tr><tr><td>Wash Buffer (PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4)</td><td></td><td></td><td>Filter 滅菌して4°Cで保存します。C</td></tr><tr><td>PBS、0.05% Tween-20、pH 7.4</td><td>Sigma</td><td>P-3563</td><td>138 mM NaCl、2.7 mM KCl、0.05% TWEEN</td></tr></tbody></table>

環境病原体に対するヒトの暴露を測定するために唾液抗体マルチプレックスイムノアッセイの開発

Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens

病因および環境病原体に対するヒトの曝露の影響世界中の主要な関心事であると、このように、効果的なコストを用いて露光し、感染を評価する能力、高スループットのアプローチが不可欠であろう。この原稿は、同時に複数の病原体に対するヒトの唾液中の抗体の存在を測定することができるビーズベースのマルチプレックスイムノアッセイの開発と分析を記載します。血清より収集するために、非侵襲的に安価かつ容易であるため、唾液は、この用途に特に魅力的です。環境病原体からの抗原は、カルボキシル化ミクロスフェア（ビーズ）に結合され、ビーズに基づく、溶液相アッセイを用いたヒトの唾液サンプルの非常に少量で、抗体を測定するために使用しました。ビーズはカンピロバクター、ヘリコバクター・ピロリ菌、トキソプラズマ、ノロウイルス（G I.1およびG II.4）およびA型肝炎ウイルス由来の抗原と結合させました。抗原が十分に結合させたことを確認するために、ビーズは、結合は、ビオチン化抗種二次検出抗体およびストレプトアビジンR-フィコエリトリンレポーター（SAPE）とのインキュベーション、続いて、種特異的な、動物由来の一次捕捉抗体を用いて確認しました。非特異的結合を測定するための対照として、あるビーズセットは、それが任意の抗原に結合しなかった以外、他に同様に処理しました。抗原結合およびコントロールビーズは、次いで、フローサイトメトリーの原理に基づいて、ハイスループット分析器で測定し、プロスペクティブ・採取したヒト唾液試料と共にインキュベートし、そして各抗原に対する抗体の存在は、蛍光強度中央値の単位（MFI）を測定しました。 。このマルチプレックスイムノアッセイは少ないサンプルでより多くのデータを含む多くの利点を、持っています。コスト削減と労働;関心のある多くのターゲットにアッセイをカスタマイズする機能。結果は、唾液、マルチプレックスイムノアッセイをespeciaあり得る、以前の曝露および感染を識別することが可能であることを示しています大規模な人間の集団を含むサーベイランス研究でLLY有用。

一つのユニークなビーズセットは、変動をサンプリングするために、非特異的な結合とサンプルを測定するための対照として使用しました。これらのビーズは、それらがカップリング工程の任意の抗原と共にインキュベートされなかったことを除いて、抗原結合ビーズと同じように処理しました。全唾液試料とインキュベートコントロールビーズから得られた&gt; 500 MFI値は、血清からの原因が疑われる汚染をさらなる分析から除去し、残りの応答は、分散ログました。歯茎が収集装置に、または研究の参加者が歯周病を持っている場合は添付のスポンジであまりにも激しくこすっている場合、唾液、血清で汚染することができます。対数変換されたMFIのデータは、平均プラスログMFI値の3標準偏差に基づいて、505 MFIの免疫カットオフポイントを計算するために使用しました。さらに、抗原結合ビーズを希除くすべての方法で試験ウェルのように処理した特定のウェルに添加しました。uted唾液は、バックグラウンド蛍光との交差反応性を評価するためにPBS-1％BSAで置換しました。これらのバックグラウンドウェルで得られたMFI値は、各唾液...

現在の資源不足の状況では、研究者がより安価に、より速く、より正確に研究を行うことを可能にする新しい技術が出現しています。ここでは、複数の環境病原体へのヒトの曝露を同時に測定するためのビーズベースの唾液抗体マルチプレックス免疫測定法の開発について説明します。

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and ...

この唾液抗体ビーズベース・マルチプレックス免疫測定法の全体的な目的は、複数の病原体に対するIGG抗体反応を同時に測定することにより、環境に関連する有症状および無症状の疾患の原因となる病原体を特定することです。この手法は、曝露科学の分野における重要な疑問への回答に役立ちます。例えば、特定の集団においてどの病原体が疾患の原因となっているか、といった点です。本手法の主な利点は、ごく少量の単純な分量を用いて、複数の分析対象に対する抗体を迅速かつ費用対効果高く一度に測定できることです。この方法は、食中毒、水系感染、および空気感染経路を含む、病原体およびその暴露源に関する知見を提供することができます。この手順の正確な実演は極めて重要であり、適切に設定されなければ、結果の信頼性が損なわれる可能性があります。まず、目的の抗原が結合したビーズのストック混合液を、1回20秒間ボルテックスおよび超音波処理し、均質なビーズ懸濁液を作成します。次に、1%BSAを添加したPBSを用いて、各固有ビーズセットの最終濃度が1 µLあたり100ビーズとなるように結合ビーズストックを希釈します。続いて、製造元の推奨に従い、BSA添加PBSを用いて、抗種I GG一次抗体の2倍連続希釈を96ウェル丸底プレートにて少なくとも7段階で調製します。抗原カップリング確認試験ごとに、96ウェルフィルター底プレートの独立した8列×12カラムを、100 µLの洗浄バッファーで事前的に濡らし、上澄みを真空吸引で除去します。次に、事前的に濡らしたウェルに、50 µLの抗原カップリング済みビーズを加え、96ウェルフィルタープレートの1行目から7行目に、段階希釈した抗体を50 µLずつ加えます。また、希釈抗体のバックグラウンドコントロールとして、8行目に50 µLのBSA添加PBSを加えます。マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルの内容物を5回ピペッティングして混合します。次にプレートに蓋をし、抗原結合ビーズとともに抗体を室温、暗所にて、マイクロプレートシェーカーを用いて500 rpmでインキュベートします。1時間後、上清を吸引し、100 µLの洗浄バッファーを2回加えてウェルを洗浄します。2回目の洗浄後、バッファーを50 µLのBSA添加PBSに交換します。次に、ビオチン化抗種特異的IgG二次検出抗体をPBSおよびBSAを用いて16 µg/mLに希釈し、各行に希釈した二次抗体を50 µLずつ添加します。ビーズと抗体を室温・暗所にて、プレートシェーカーを用いて30分間インキュベートします。インキュベーション終了後、上清を吸引し、100 µLの洗浄バッファーを2回用いてビーズを洗浄します。2回目の洗浄後、ビーズを50 µLのPBS + BSAに再懸濁し、ストレプトアビジンr-フィコエリスリンレポーターをPBS + BSAで24 µg/mLに希釈します。各ウェルにレポーターを50 µL加え、ピペッティングで混合します。プレートをシェーカーに乗せ、室温・暗所で30分間インキュベートした後、デモンストレーション通りに洗浄バッファーで100 µLのリンスを2回行います。その後、ビーズを100 µLのBSA添加PBSに再懸濁し、抗原結合ビーズをアナライザーで評価します。渦巻き振盪および20秒間の超音波処理によって抗原結合ビーズストックを再懸濁した後、各固有ビーズセットの最終濃度が100 beads/µLになるように、BSA添加PBSで結合ビーズストックを希釈します。次に、96ウェルディープウェルプレート内で、室温の唾液をBSA添加PBSを用いて1対4に希釈して調製します。フィルタープレートを100 µLの洗浄バッファーでプレウェットし、上清を吸引します。次に、1/1から1/8までの最終希釈を行うため、96ウェルフィルタープレートの95ウェルに、50 µLの抗原結合ビーズと等量の希釈唾液を添加します。同時に、コントロールウェルには50 µLの抗原結合ビーズと、50 µLのPBS+BSAのみを添加します。マイクロプレートシェーカーを用い、500 rpmで室温・暗所にて1時間、ビーズをインキュベートします。その後、上清を吸引し、100 µLの洗浄バッファーでウェルを2回洗浄します。2回目の洗浄後、50 µLのBSA添加PBSでビーズを再懸濁します。二次抗体を希釈し、各ウェルに50 µLずつ添加します。マルチチャンネルピペットでウェル内を混合した後、プレートをシェーカーに載せ、室温・暗所で30分間インキュベートします。その後、100 µLの洗浄バッファーでウェルを2回洗浄し、50 µLの新鮮なPBS + BSAでビーズを再懸濁します。次に、レポーターを希釈し、各ウェルに50 µLずつ添加します。マルチチャンネルピペットを用いて十分に混合します。シェーカーを用いて室温・暗所にて30分間静置した後、実演通りにウェルを2回洗浄し、ビーズを100 µLのPBS + BSAに再懸濁して、アナライザーでサンプルを評価します。抗原結合ビーズがアッセイのダイナミックレンジに到達できることを確認するため、適切な結合は平均蛍光強度が18,000以上であることと定義されます。C.jejuniおよびT.gondiiの測定における抗原の代表的なカップリング確認結果をここに示します。設定されたカットオフ値に基づくと、サンプルの免疫有病率はT.gondiiの約2%からノロウイルスゲノグループ1.1の約50%までであり、免疫有病率はノロウイルスで最も高く、次いでA型肝炎、H.Pyloriの順でした。サンプルの32%は測定したすべての病原体に対して免疫陰性でしたが、68%は1つ以上の病原体に対して免疫陽性でした。習得すれば、適切に実施することで本手順は約4時間で完了できます。本手順を行う際は、光退色を防ぐためにビーズを暗所に保存することが重要です。本手順の後、感度や特異性に関するさらなる疑問を解決するために、ELISAやウェスタンブロッティングなどの他の手法を用いることができます。抗体の交差反応性についても同様です。本手法の開発により、疫学、曝露科学、および臨床微生物学の分野の研究者が、環境曝露によるヒトへのリスクを探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、複数の病原体に対する抗体を同時に測定するマルチプレックス・イムノアッセイの開発、分析、および結果の解釈方法について、深い理解を得ることができます。体液およびアジ化ナトリウムの取り扱いは極めて危険であるため、本手順を実施する際は、適切な個人用保護具の着用や試薬の適切な廃棄などの予防策を必ず講じてください。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

ルミネックス社のXMAPのミクロスフィア技術を使用して、我々は様々な実験動物種のserosurveillanceの多重蛍光イムノアッセイ（MFIA）を開発しました。 MFIAは、抗原、組織制御や免疫グロブリンが共有結合し、色分けされたポリスチレン微小球にリンクされているサスペンションマイクロアレイである。...

多重化された蛍光イムノアッセイテスト方法とトラブルシューティング

このビデオは、ヒトの唾液中の複数の環境病原体に対する抗体を同時に検出するビーズベースのマルチプレックスイムノアッセイ技術を示しています。蛍光ビーズは、ヒト唾液サンプル中の抗体を用いて捕捉された異なる病原体由来の抗原に結合しました。蛍光レポーターを使用して抗体を標識した後、ビーズをフローサイトメトリーを使用して分析し、唾液中のさまざまな病原体特異的抗体の存在を評価しました。...

唾液中の病原体特異的抗体を同定するためのビーズベースのマルチプレックス免疫測定法

私たちは、多重化されたマイクロスフェアベースの抗体アレイを用いて唾液タンパク質をプロファイリングするための手順を説明します。モノクローナル抗体は、共有結合、カルボジイミド化学反応を用いて、蛍光色素でエンコードされた4.5ミクロンのポリマー微小球にリンクされていた。修飾された微小球は、蛍光サンドイッチイムノアッセイを使用して、唾液中のタンパク質レベルを測定するために、光ファイバのマイクロウェル内に堆積した。...

ポリマー微小球および光ファイババンドルを使用したヒト唾液タンパク質分析のための多重化された蛍光マイクロアレイ

このプロトコルでは、上気道から邪魔されず粘膜被覆液のサンプリングのための非侵襲的技術について説明します。それは、すべての年齢層の被験者でタンパク質メディエーター、サイトカイン、ケモカインなどの生体内レベルの定量化を実行する使用できます。...

体内上部気道免疫メディエーター レベルの定量化のための粘膜内層流体の非侵襲的サンプリング

ここで開発および単一分子配列デジタル ELISA 法、人間のサンプルですべての IFN-α サブタイプの超高感度検出を可能にする検証を記述するプロトコルを提案する.

超高感度単一分子の開発と検証配列人間のインターフェロン-α のデジタルの酵素免疫測定法

アレルギーの診断に血清特異免疫グロブリン E マイクロ カートリッジ ベースの化学発光システムとその有用性の評価を検出のためのプロトコルを提案する.

バイオチップ マイクロ流体技術を応用した検出の血清中のアレルゲン特異免疫グロブリン E (sIgE)

我々は、異なるウイルス株から250以上の抗原に対して複数の抗体アイソタイプの血清を同時にプローブするために、ニトロセルロースコーティングされたスライドにインフルエンザ抗原を印刷することによって構築されたタンパク質マイクロアレイを使用するためのプロトコルを提示し、したがって、ウイルスサブタイプ間の血清抗体の幅の測定を可能にする。...

インフルエンザ抗原マイクロアレイを用いたウイルスサブタイプにわたる血清抗体の幅を測定

SARS-CoV-2の中和IgGおよびIgM抗体を同時に測定できる多重血清および抗体中和アッセイの開発には、2レポーターの読み出しを提供するビーズベースの多重化アッセイのフロー分析システムが使用されました。...

多重化ビードベースの流れ分析システムのための高速多重デュアルレポーターIgGおよびIgM SARS-CoV-2中和アッセイ

この記事では、SARS-CoV-2感染またはワクチン接種に対する免疫応答から生じる2つの免疫グロブリンアイソタイプ(IgA、IgM、またはIgGのいずれか)の抗体価の動的変化を同時にモニタリングするための便利な方法について説明します。この「マルチアナライトCovid-19免疫応答パネル」は、「デュアルチャネル」機能を備えたフローベースのマルチプレックスリーダーを使用して読み取られるコード化されたミクロスフェア上に構築された3つの間接イムノアッセイを採用しています。...

Covid-19の多検体免疫ビーズアッセイを使用した血清変換の動的モニタリング

3チャンネルデュアルレポーター蛍光フロー分析システムを使用して、ヨーロッパおよび北米でライムボレリア症を引き起こす異なる ボレリア...

マルチプレックス血清学的検査における異なる抗体クラスの同時検出(英語)

マルチプレックス蛍光免疫測定法は、血清学的検査の基準になりつつあります。ただし、それらのアプリケーションは、複雑さと時間のかかるビーズ分析種カップリングプロセスによって制限されます。このレポートは、結果を得るまでの時間を大幅に短縮しながら、標準的な方法に匹敵する、半自動で再現性のあるマルチプレックスマイクロスフィアビーズカップリングプロトコルを提示します。...

アルボウイルスに対する抗体応答の検出のためのマルチプレックス血清学的アッセイ

学ぶ ビーズベースの唾液抗体マルチプレックスイムノアッセイを用いて、複数の環境病原体へのヒトの暴露を同時測定する方法。この技術は暴露科学研究の効率と精度を向上させ、公衆衛生戦略に貢献します。

環境病原体に対するヒトの暴露を測定するために唾液抗体マルチプレックスイムノアッセイの開発

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