Name: 肉認証にペプチド応用のMRM質量分析法を用いて混合物中の種の決意と定量 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: 学ぼう、MRM質量分析法を用いて肉混合物中の種を同定・定量する手法。食品偽装検出のため、ミオグロビンを熱変性・トリプシン消化し、HPLC-MSでペプチドを分析します。高感度で迅速な食品安全性評価が可能です。

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私たちは、Institute of Food ResearchのBBSRCコア戦略助成金、BBSRCプロジェクトBB/J004545/1からの財政的支援に感謝します。

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<li>Claydon, A. J., Grundy, H. H., Charlton, A. J., Romero, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+peptides+for+horse+meat+speciation+in+highly+processed+foodstuffs%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Addit.+Contam.+Part+A-Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of novel peptides for horse meat speciation in highly processed foodstuffs.</a> Food Addit. Contam. Part A-Chem. 32, 1718-1729 (2015).</li>
<li>von Bargen, C., Brockmeyer, J., Humpf, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meat+Authentication%3A+A+New+HPLC-MS%2FMS+Based+Method+for+the+Fast+and+Sensitive+Detection+of+Horse+and+Pork+in+Highly+Processed+Food%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Agric.+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Meat Authentication: A New HPLC-MS/MS Based Method for the Fast and Sensitive Detection of Horse and Pork in Highly Processed Food.</a> J. Agric. Food Chem. 62, 9428-9435 (2014).</li>
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<li>Montowska, M., Alexander, M. R., Tucker, G. A., Barrett, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Authentication+of+processed+meat+products+by+peptidomic+analysis+using+rapid+ambient+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Authentication of processed meat products by peptidomic analysis using rapid ambient mass spectrometry.</a> Food Chem. 187, 297-304 (2015).</li>
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<li>Keeton, J. T., Ellerbeck, S. M., Nunez de Gonzalez, M. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKeeton%2C+JT+%22Encyclopedia+of+Meat+Sciences%22">Encyclopedia of Meat Sciences</a>. Devine, C., Dikeman, M. 1, Academic Press. 235-243 (2014).</li>
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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

好適な標的タンパク質の選択が重要です。優れた標的タンパク質は、目的の種の対応する形態は、十分な種依存性配列変異、種特異性を有し、生物内でアクセス可能な量で存在する必要があります。処理を受けた混合物（例えば、熱処理）を評価するため、その処理に比較的免疫配列を有するタンパク質であることが望ましいです。ミオグロビンは、調理された赤身肉などの赤肉、のための良い候補であるが、唯一の可能性ではありません。標的タンパク質が決定されると、プロトコルの最も重要な部分は、タンパク質のタンパク質分解です。ミオグロビンは異なるタンパク質がよく、代替タンパク質分解プロトコルを要求することができます。 記載されているようにプロトコルは、基準精製タンパク質に基づいてセグメントを含みます。これは、保持時間ウィンドウと、適切な前駆体およびフラグメントイオンを発見することを目指しています。このセグメントは非常に有用であるが、必須ではありません。 <p関心の2種からの対応するペプチドのペアがあっても実験することなく記載されていることができますが、クラス= &quot;jove_contentは&quot;&gt;、それは時々、配列の差が消化プロファイルに劇的な影響を有している場合です。例えば、ペプチドペアVLGFHG（牛肉）とELGFQG（馬）（ 図2の1未満の勾配としてマニフェスト）異常 ​​な定量結果を与えます。後者のペプチドは、混合物中の馬のレベルの過少見積もりを引き起こし、比較的抑制KE切断から生じるためです。異なるアミノ酸で始まる対応するペプチドは、したがって、最高の回避されます。多くの場合、対応する二つのペプチドのフラグメントは、同一のアミノ酸配列を有し、行儀されているが、これは常にそうではなく、方法の開発中にチェックする必要があります。種の同定は、相対定量よりも、これらの問題に非常に敏感ではありません。 プロトコルは、4つの赤肉のために実証されています秒3。あまりにも多くのマーカーペプチドが共溶出場合、遷移ピーク形状の品質を効果的に滞留時間を減少させ、最終的に相対的な定量推定値を分解、劣化するかもしれないが、追加の肉種が、含まれ得ます。すでに利用可能な改善された機器は、これを改善します。関連する問題ではない、すべての肉は、異なるミオグロビンを有することです。例えば、馬、ロバとシマウマミオグロビンは同一であり、したがって、厳密方法を言えば牛肉に馬やロバやシマウマを検出することができるだけです。いくつかのケースでは、ミオグロビンが同一ではないにもかかわらず、いくつかの重要なペプチドは、することができます。例えば、いくつかのラムミオグロビン由来のマーカーペプチドはまた、ヤギに表示されます。 このおよび他のタンパク質ベースの定量法が直面している合併症は、タンパク質またはペプチドのレベルは、混合物中の肉のレベルに自明と同一視することがある場合、タンパク質レベルは、全ての種にわたって一定であると仮定しなければならないことです。ミオグロビンと4赤メートルのためにこれは普遍的真実ではありません食べます。一般的にレベルは豚肉は4の最低レベルを示すと、依存種です。また、ミオグロビンレベルは肉カットと動物の年齢に応じて変化します。遷移のピーク面積の比が、ミオグロビンの比率に確実にマッピングがので、実際の肉の割合へのマッピングは、混合物中の肉の可能性ソースに関する仮定の推定図です。 この作業で概説したアプ​​ローチは、他の公開の貢献から、いくつかの方法で異なっています。より典型的な経路は、異なる種のマーカーが互いに8-12,14,19とは特定の関係を有していない、その場合には、様々な異種の種依存性マーカーペプチドを同定するプロテオミクスの方法を使用することです。これとは対照的に、我々は3バリアント 、種依存性シーケンスまで関心のあるすべての種に共通するタンパク質を選択しました。別に私たちの相対定量戦略の中心であることから、これはそのサンプル利点を有しています調製ストラテジーを最適化することができます。さらに、このような対応するタンパク質は、抽出、またはそのような調理または缶詰などのサンプルの商業的処理、例えば、同様に挙動することが予想されるかもしれません。種の同定は、その後、通常、典型的には、1つまたは2配列の差異を有する密接に関連するペプチドの検出によりCPCPアプローチ種の識別が進む中で、一方、異種のマーカーペプチドの検出を介して進行します。最後に、他に1種の重量％を推定するタンパク質の定量は、従来別々に既知の標準7,14,15に基づいて、各タンパク質の絶対定量を介して進行することがあります。しかし、較正方法を必要としないCPCP法を用いて。代わりに、相対的なレベルは、完全に絶対測定ステージをバイパスし、両種からの対応する二つのペプチドの信号強度を比較することによって推定されます。究極の目標は、あの、1つの種の重量％であることからTHER、相対定量、その後CPCPは両方のより直接的かつ2つの絶対定量測定値を比較するよりも簡単です。これらの機能は、食品の不正検出の分野における急速な監視ツールとしての技術が有用なもの、洗練されたプロトコルを用いて、約2時間であることが予想される短い実験時間、に変換されます。

2013年のヨーロッパの馬肉スキャンダルでは、多くのスーパーマーケットの牛肉製品1から未申告の馬肉が発見され、肉中の食品偽装を検出および測定できる試験方法の必要性が浮き彫りになりました。いくつかの技術、特に酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)とDNAベースの方法2が検討されています。質量分析に基づく別のルートは、種特異的なペプチドを標的とし、そのペプチドは種特異的なタンパク質から生じます。ここでは、肉混合物中の混入物種の同定と相対定量の両方を提供するペプチドベースのアプローチの1つについて概説します3。
このプロトコルは、赤身の肉と、1重量%のレベルで互いに存在したいという願望の文脈で組み立てられています。このレベルは、汚染4とは対照的に、不正な食品の混入を表すと考える人もいます。この方法は、まず、すべての対象肉で名目上「同じ」タンパク質を特定することに依存しています。ミオグロビンは、肉の赤い色の原因となるタンパク質であり、豊富で、比較的耐熱性があり、水溶性であるため、有力な候補であり、以前に肉の種決定に使用されてきました5,6。例えば、牛肉(Bos Taurus)、豚肉(Sus scrofa)、馬(Equus caballus)、子羊(Ovis aries)3のミオグロビンは、必要に応じて名目上は同じですが、それらの配列は同一ではありません。これらの4つのミオグロビンのように、このような「類似しているが異なる」タンパク質のグループは、便宜的に「対応するタンパク質」と説明できます。これら4つのミオグロビンの配列の違いは種特異的であり、例えば、牛肉と馬の全ミオグロビンタンパク質であるP02192とP68082は、それぞれ154個のアミノ酸を含み、両者の間には18の配列違いがあります。トリプシンを用いたタンパク質分解を受けると、これらのタンパク質は2組のペプチドを産生し、その一部は同一であり、一部は1つ以上の種特異的アミノ酸の違いを示す:したがって、対応するタンパク質は対応するペプチドを生じさせる。
したがって、CPCPアプローチは、まず、これらのタンパク質が限られた種特異的な配列変異を示す2つ以上の種からのタンパク質を特定しようとします。これらは対応するタンパク質です。タンパク質分解後、対応するタンパク質がペプチドを生じさせ、その一部は同様に親タンパク質から受け継がれた種特異的な配列変異体を示します。これらは対応するペプチドです。CPCPアプローチを使用すると、対応するペプチドのレベルをモニタリングすることにより、混合種サンプル中の2つの対応するタンパク質のレベルを比較できます。
既知のペプチドを検出するための自然な技術は、多重反応モニタリング質量分析、またはMRM-MS7です。種特異的なペプチドはプリカーサーイオンを生成し、そのプリカーサーイオンは、質量分析フラグメントイオンとともに、ソフトウェアツールによって事前に簡単に項目化できます。次に、これらのリストを使用して、トランジションと呼ばれる特定のプリカーサーイオンペアとフラグメントイオンペアのみを記録するように質量分析計に指示します。したがって、特定の標的ペプチドは、質量分析計に先行するクロマトグラフィーでの保持時間だけでなく、共通のプリカーサーイオンを共有する一連のトランジションによっても同定されます。これは、質量分析計のリソースを効率的に利用する、既知のペプチドを検出するための選択性の高い手段です。
他の著者は、ペプチドマーカーを介した肉の不純物混入を検査するために質量分析を使用していますが、異なるタンパク質8-14からのものです。しかし、対応するタンパク質、対応するペプチド(CPCP)スキームを使用すると、実験条件を最適化でき、既知の種特異的遷移から混合物中の種を特定するのに役立ちます。さらに、対応するタンパク質とペプチドは、一般に、抽出、タンパク質分解、および検出の段階で同様に動作します。トランジションピーク面積は定量的で再現性が高いため、異なる生物種由来の対応するペプチドのペアから生じるピーク面積の比率から、混合物中の 2 種類の肉の相対量を直接推定できます。対照的に、より伝統的な定量ルートでは、標準物質に基づくキャリブレーションを利用して絶対定量を確立します14,15。
プロトコルはミオグロビンと肉の文脈で概説されていますが、ミオグロビン以外のタンパク質は、肉の混合物におけるCPCP戦略による同定と相対定量に使用することができます。ただし、プロトコルに修正が加えられる可能性があります。さらに、この戦略は、1つ以上の対応するタンパク質を共有する他の種の二元混合物にも適用できます。
プロトコルの出発点は精製された「参照」ミオグロビンで、これは一部の種では購入可能ですが、他の種では従来のサイズ排除クロマトグラフィーによって調製する必要があります。参照ミオグロビンを調製する手順は、プロトコールには含まれていないが、他の場所で説明されている3。ソフトウェアツール16は、目的のミオグロビンから生じる候補ペプチドおよびトランジションをリストアップするために使用される。各参照ミオグロビンをタンパク質分解し、得られたペプチドを液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析(LC-ESI-MS/MS)で分析して、候補となるプリカーサーイオンとトランジションのどれが最も有用であるかを発見し、一致するペプチド保持時間を決定します。この段階の結果、種測定に適した標的ペプチドとその遷移の改訂されたリストと、相対定量に適したCPCPペアのリストが作成されました。実際の肉を試験するために、サンプル抽出物を調製し、タンパク質分解を行って、ミオグロビンと他の無関係なタンパク質の両方からペプチドを生成します。次に、ミオグロビンベースのペプチドを、リストされた遷移に基づいてLC-ESI-MS/MSでモニターします。混合物中に存在する分子種は、マーカーペプチドに関連するトランジションピークによって同定されます。バイナリー混合物中の 2 つのミートの相対量の推定値は、トランジションピーク面積の比を使用して計算されます。肉のペアのテスト混合物のセットにより、特定のトランジションのペアのピーク面積の比率をチェックし、実際の混合物に対して較正することができます。

<table><tbody><tr><td>Uniprotデータベース</td><td><a href="http://www.uniprot.org/">www.uniprot.org</a></td><td></td>自由に<td>アクセスできるタンパク質配列のデータベースSkyline</td></tr><tr><td>ソフトウェア</td><td><a href="http://www.skyline.gs.washington.edu/">www.skyline.gs.washington.edu</a>プロ</td><td></td><td>テオミクス研究、ペプチド、フラグメントの標的法を作成できるダウンロード可能なフリーソフトウェア予想&nbsp;</td></tr><tr><td>Ammonium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com</td><td>O9830</td><td></td></tr><tr><td>Methanol, HPLC grade</td><td>Fisher Scientific, Loughoborough, UK www. fisher.co.uk</td><td>10674922</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile, HPLC grade</td><td>Fisher Scientific, Loughoborough, UK www. fisher.co.uk</td><td>10010010</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン(TPCKで処理されたウシ膵臓由来)</td><td>Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td>ギ酸&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Plus Protein Assay 試薬</td><td>Thermo Fisher Scientific www.thermofisher.com</td><td>1856210</td><td></td></tr><tr><td>Protein standard</td><td>Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com</td><td>P0914</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Turrax homogeniser T25</td><td>Fisher Scientific, Loughoborough, UK www. fisher.co.uk</td><td>13190693</td><td></td></tr><tr><td>エドモンド&ビューラー KS10 ラボシェーカー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヘレウス・フレスコ 17 遠心分離機</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック・www.thermoscientific.com 75002420</td><td></td><td></td></tr><tr><td>真空遠心分離機 RC 1022</td><td>ジョアン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プレートリーダー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strata-X 33u ポリマー逆相カートリッジ 60 mg/3 ml チューブ</td><td>フェノメネックス、マックルズフィールド、英国</td><td>8B-S100-UBJ</td><td></td></tr><tr><td>4000 QTrap トリプル四重極質量分析計</td><td>AB Sciex, Warrington, UK www.sciex.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1200 高分解能 LC システム</td><td>Agilent, Stockport, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XB C18 逆相キャピラリーカラム (100 mm x 2.1 mm, 2.6 &micro;m 粒子径)</td><td>Phenomenex, Macclesfield, UK www.phenomenex.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analyst 1.6.2 software</td><td>AB Sciex, Warrington, UK www.sciex.com</td><td></td><td>QTrap データ取得および分析(ピーク面積積分</td></tr>を含む) <tr><td>オートサンプラーバイアル</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

肉認証にペプチド応用のmrm質量分析法を用いて混合物中の種の決意と定量

Species Determination and Quantitation in Mixtures Using MRM Mass Spectrometry of Peptides Applied to Meat Authentication

私たちは、1つ以上の類似したタンパク質を持つ種の二元混合物の二成分を特定し定量するための簡単なプロトコルを記述します。この方法の中心となるのは、対象種における「対応するタンパク質」、つまり、名目上は同じであるが、種特異的な配列の違いを持つタンパク質の同定です。タンパク質分解を受けると、対応するタンパク質は、同様に類似しているが種特異的な変異体を持ついくつかのペプチドを生じさせます。これらは「対応するペプチド」です。種特異的ペプチドは種決定のマーカーとして使用でき、対応するペプチドのペアは混合物中の2つの種の相対定量を可能にします。ペプチドは、複雑なシステムでもペプチドベースの種決定を可能にする非常に特異な手法である多重反応モニタリング(MRM)質量分析を使用して検出されます。さらに、対応するペプチドに由来する MRM ピーク面積の比率は、相対定量をサポートします。対応するタンパク質とペプチドは、主にプロセシングと実験抽出およびサンプル調製の両方で同様に振る舞うため、相対定量は比較的頑健なままであるべきです。さらに、このアプローチでは、絶対定量法に必要な標準試料やキャリブレーションは必要ありません。このプロトコルは、それぞれのミオグロビンの形で便利な対応するタンパク質を持つ赤身の肉の文脈で説明されています。このアプリケーションは食品偽装の検出に関連しています:この方法は、牛肉の馬肉の重量の1%の重量を検出できます。MRM ピーク面積比を使用した対応するタンパク質、対応するペプチド(CPCP)の相対定量により、馬と牛肉の混合物の重量組成の重量を良好に推定できます。

単一の動的モードMRM実験では、各プログラムの移行が指​​定された保持時間ウィンドウにわたって（検出器秒あたりのカウント、CPSとして）別々に記録されています。したがって、1つの実験において収集されたすべてのデータから、各遷移のピーク強度は、個々に抽出することができます。そして、唯一の有限の信号は、その遷移に設定保持時間枠のためです。窓の外では、信号は定義によりゼロです。例えばいずれかの遷移のための信号、馬から752→1269（質量1,501.66ダルトンは、前駆体イオンの m / z 751.84ダルトンは、状態= 2、フラグメントイオンyの13を充電するモノアイソトピックペプチド）は、典型的には、測定ノイズとないとだけ競うために持っていますおそらく他の種に由​​来する可能性がある他の遷移ピークから。出力は、したがって、共通の前駆体イオンを共有し、それらの遷移のための共通の保持時間できれいなピークは、遷移ごとに1、のセットです。 図1は、1％の混合物のための4つのトランジション752→（1269、706、248、1366）のセットの出力/重量を示しています牛肉で馬。表示された4遷移が馬に関連付けられており、純粋な牛肉、羊肉や豚肉のサンプルに存在しないされているので、これらのピークは、馬の存在を意味します。ロバスト性の基準に応じて、ノイズレベルにある特定の信号を超える二つ以上の遷移の組それぞれは、識別を確立します。この図は、したがって、牛肉で馬ワット/ wの1％の混合物中の馬の存在を確立します。 時折、単一の孤立遷移が検出されます。これは、質量分析計にシステムから期待され、プログラムしたもので、おそらく無関係なタンパク質から、前駆イオンと単一フラグメントの偶然の一致を示します。予期しない保持時間における特異ピークの性質、及びその発生は、Siであります無視することができ、偶発的移行のgnature。 各遷移のピーク下の面積を個別に計算することができます。適切なフラグメントに基づいて、牛肉の遷移ピーク面積に対する馬の割合は、例えば、767→1299へ→1269年752（馬）（牛肉）は、混合物中の実際の肉の割合に比例します。 図2は、Aを示し牛肉と馬との混合物中の馬の重量のための重量百分率対これらの2つの遷移のピーク面積百分率のプロット。パーセンテージ遷移ピーク面積は、肉の重量のための重量パーセントと一致した場合、傾きはこのプロットにおける傾きがこれらの遷移とCPCP対について、遷移ピーク面積は、相対的な量の信頼性の尺度を与える、ことを示す、1.03 1です。混合物中の2つの肉の。他の要因変わらずで、試料中の馬の肉は、その後の傾斜牛肉としてミオグロビンで二倍の豊富だった場合<html>行は、1よりも大きいであろう。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54420/54420fig1.jpg" /> 牛肉で馬w / wの1％の保持時間に対する 図1. MRM遷移強度を。遷移はそれぞれ、黒、青と緑、オレンジ色で示され、752→（1269、706、248、1366）です。マーカーペプチドはHPGDFGADAQGAMTKです。 4遷移フラグメントはここで、yはそれぞれ、Y 13、Y 7、Y 2及びY 14で表さNペプチドのC末端からN個のアミノ酸で計数表すことができます。信号対雑音比は、4つの遷移上で23から53まで変化します。追加の赤い線は0％馬、比較のために100％ビーフのための752→1269推移を示しています。保持時間の唯一の非ゼロの領域が表示されます。この図は、ワトソンらから変更されている。3。エス/ ftp_upload / 54420 / 54420fig1large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54420/54420fig2.jpg" /> パーセント遷移ピーク面積として牛肉で馬対重量のパーセント重量などの牛肉で馬の 図2. プロット、。プロットは、ペプチド牛肉（767）と馬（752）との両方のためのyの13フラグメントイオンのペアを使用しています。 Aはピーク面積を表す場合には、縦軸が100 A、H /（H + B）です。最良適合線（R 2 = 0.99）の傾きは1.03です。この図は、ワトソンら 3から変更されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54420/54420fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

私たちは、類似のタンパク質を持つ種の混合物の成分を特定し定量するためのプロトコルを提示します。質量分析では、同定のためにペプチドを検出し、ピーク面積の比率によって相対的な定量を行います。不正検出のためのツール食品として、この方法では牛肉中の1%の馬を検出できます。

肉認証にペプチド応用のMRM質量分析法を用いて混合物中の種の決意と定量

We describe a simple protocol for identifying and quantifying the two components in binary mixtures of species possessing one or more similar proteins. ...

本手法の全体的な目的は、マルチリアクションモニタリング質量分析を用いて、食品偽装検出のツールとして生肉混合物中に存在する種を同定および定量することです。この手法は、ソーセージやバーガーなどの製品に含まれる種を確認するなど、食品の完全性（フード・インテグリティ）の分野における重要な課題の解決に役立ちます。本アプローチは、タンパク質成分の質量分析に基づいています。この手法の主な利点は、迅速かつ定量的な結果が得られることです。同じ名称で知られているタンパク質であっても、種が異なれば種同定を可能にする十分な差異がある一方で、定量を可能にする程度の類似性も保持していることに気づいたとき、この手法の着想を得ました。精製した参照用ミオグロビンを、ホットブロックを用いて 95 degrees celsius で 30 minutes 加熱し、熱変性させます。試料を室温になるまで約15分間冷却します。次に、消化を促進させるために30 mgの尿素を加え、混合します。酵素と基質の重量比が1:30になるように、トリプシン溶液を試料に加えます。その後、緩やかにボルテックスして混合し、37 °Cで一晩タンパク質分解させます。次に、タンパク質分解後のサンプルを水で1:2（v/v）に希釈し、脱塩します。30 mgのリバースフェーズ材料を充填したポリマー製逆相カートリッジに、1 mLのメタノールを加えて活性化させます。次に、1%ギ酸を1 mL加えてカートリッジを平衡化します。サンプルを重力下でカートリッジにロードします。続いて、1%ギ酸を含む5%メタノールを1 mL用いて洗浄します。5 µLのDMSOをあらかじめ分注した2 mLマイクロ遠心チューブに、1 mLのアセトニトリル水を用いてペプチドを溶出させます。次に、遠心エバポレーターを用い、50 °Cの真空条件下で120分間溶媒を除去します。その後、残渣を250 µLのアセトニトリル水に再溶解させます。溶液を低容量オートサンプラーバイアルに移します。UniProtデータベースで、異なる肉類におけるミオグロビンの配列を確認します。ペプチドおよび遷移予測ソフトウェアのターゲットボックスに、ミオグロビンの配列を入力します。必要に応じて、ペプチドの上にカーソルを置くとフラグメントリストが表示されます。テキストプロトコルに記載されている通りに設定を入力した後、[Export]をクリックし、[Transition List]を選択して、生成されたMRMトランジションとパラメータを含むスプレッドシートを作成します。オートサンプラーとC18コアシェルHPLCカラムを備えたバイナリーグラジエントの高速液体クロマトグラフィー（HPLC）システムを構築し、MRM検出を行うポジティブエレクトロスプレーモードで動作するトリプル四極子質量分析計に接続します。液体クロマトグラフィー質量分析（LC-MS）データ収集ソフトウェアの編集パラメータセクションで、スキャンタイプにMRMを、極性に正（positive）を選択します。スプレッドシートで作成したトランジションのQ1、Q3、時間、ID、DP、およびCEの値を入力し、収集メソッドを保存します。テキストプロトコルに従ってメソッドパラメータを設定した後、データ収集ソフトウェアに移動し、「Acquire」をクリックして「Equilibrate」を選択します。開いたボックスで、必要な取得方法を選択して装置の平衡化を開始します。次に、サンプルバイアルをオートサンプラーのラックにセットします。[File] をクリックして [New] を選択し、続いて [Acquisition Batch] を選択します。「サンプル名」に、分析対象となる各サンプルの識別情報を入力してください。取得したデータの可視化方法の詳細については、テキストプロトコルを参照してください。以前に冷凍し、その後粉末状に粉砕した肉を使用してください。15 mLのプラスチック製遠心チューブに規定量の肉を秤量し、一連の肉混合物を用意します。肉粉末に4 mLの抽出バッファーを加えます。30秒間ボルテックスした後、ラボシェーカーを用いて室温で250 cycles per minuteの速度で2時間抽出します。抽出液2 mLを2 mLマイクロ遠心チューブに移し、4 °C、17,000 Gで5分間遠心分離します。上清を200 µLずつ2 mL遠心チューブに分注します。テキストプロトコルに従って試料のタンパク質濃度を測定する前に、遠心濃縮機を用いて試料を乾燥させます。肉混合物のタンパク質分解を行うには、乾燥した残渣を1 mLの25 mM炭酸水素アンモニウム溶液で再溶解させます。ボルテックスミキサーで十分に混合し、前述と同様にタンパク質分解を行います。その後、スケジューリングMRMを用いて、同様の手順でLCMSのセットアップおよび分析を実施します。データ閲覧ソフトでフルクロマトグラムを表示してください。各トランジションセットについて、抽出されたイオンを順番に表示します。各クラスターに、想定される保持時間に必要数のベル型のピークが含まれていることを視覚的に確認してください。これにより、選択したペプチドの存在を確認します。次に、ナビゲーションバーのQuantiation Wizardをダブルクリックします。「Select Samples」ウィンドウで、単一のデータファイルを選択して定量セットを作成します。その後、利用可能なサンプルを1つまたは複数選択します。「Next」を選択して、選択設定とクエリボックスを表示します。デフォルト設定のまま「Next」を選択し、「Select Method」を表示させます。Methodのドロップダウンボックスから積分手法ファイルを選択し、最後に「Finish」を選択してください。結果テーブルを保存し、テキストファイルとしてエクスポートして、テキストプロトコルに従いデータを確認するためにスプレッドシートで開きます。この図は、牛肉と1%（重量比）で混合した試料から得られた、馬の最も強度の高いMRM遷移を示しています。対照的に、赤線は馬が存在しない場合の牛肉の遷移を示しています。これは、牛肉中に調製した馬肉の量と測定された量を比率として示したプロットです。このプロットから、本手法が定量測定に利用可能であることが明確にわかります。習熟し、バッチ処理を用いることで、本手法によるスループットは24時間あたり最大20サンプルに達します。この手順を行う際は、抽出分析に適したタンパク質を選択することが重要です。ミオグロビンは、含有量が多く、水溶性で熱安定性が高いため、赤身肉種の検討に適した候補となります。この手順を拡張することで、さらに多くの種を同時に同定および定量することが可能です。最大数はマススペクトロメトリーのスキャン速度によってのみ制限されます。この技術は、消費財やブランド保護などの分野でペプチドフィンガープリント法を利用するための道を研究者に切り拓いています。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

安定同位体の標準と抗ペプチド抗体（SISCAPA）によって、それぞれのタンパク質の代用物としてのペプチドの定量的な測定を提供するために、安定同位体希釈質量分析法（MRM -...

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プロテオミクスから骨格筋の性別二型

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ここでは、高解像度 (〜 30,000) の MS モノクローナル抗体のスパイク ペプチド水準の定量化のためのペプチド断片の検出続くペプチド前駆体のイオン移動度分離と相まってガスクロマト...

液体クロマトグラフィーによるイオン移動 QTOF 質量分析法によるタンパク質のバイオ医薬品の宿主細胞蛋白質の定量化のための HS MRM アッセイ

このプロトコルでは、定量的かつ包括的に複数の栄養源の代謝を調査する実験手順について説明します。このワークフローは、同位体トレーサー実験と分析手順の組み合わせに基づいて決定する微生物による消費された栄養素の運命と分子 synthetized...

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組織サンプルの質量分析ベースのショットガンプロテオミクスの包括的ワークフロー

このプロトコルは、液体クロマトグラフィー質量分析と高度な特徴抽出およびバイオインフォマティクス分析ソフトウェアを組み合わせたペプチドグリカン組成の詳細な分析をカバーしています。...

液体クロマトグラフィー質量分析とバイオインフォマティクスによるペプチドグリカンの半定量分析

タンパク質アルギニン(R)-メチル化は、複数の生物学的経路を調節する広範な翻訳後修飾です。質量分析は、修飾ペプチド濃縮のための生化学的アプローチと組み合わせると、R-メチルプロテオームをグローバルにプロファイリングするための最良の技術です。ここでは、ヒト細胞における全体的なR-メチル化を高信頼で同定するために設計されたワークフローについて説明します。...

質量分析に基づくプロテオミクスアプローチによるグローバルで信頼性の高いタンパク質R-メチル化分析

この記事では、熱不活性化に基づくサンプル調製方法を、後分析による分解を回避する内因性ペプチドを保存し、続いて同位体標識とLC-MSを使用した相対定量を行う方法について説明します。...

ペプチド学研究におけるアミンの還元メチル化を用いたサンプル調製と相対定量

学ぼう、MRM質量分析法を用いて肉混合物中の種を同定・定量する手法。食品偽装検出のため、ミオグロビンを熱変性・トリプシン消化し、HPLC-MSでペプチドを分析します。高感度で迅速な食品安全性評価が可能です。

肉認証にペプチド応用のMRM質量分析法を用いて混合物中の種の決意と定量

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