肉認証にペプチド応用のMRM質量分析法を用いて混合物中の種の決意と定量

この分析法の全体的な目標は、多重反応モニタリング質量分析を使用して、生肉混合物中に存在する種を同定および定量し、食品偽装検出のツールとして使用することです。この方法は、ソーセージやハンバーガーなどの製品に存在する種の確認など、食品の完全性の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。私たちのアプローチは、タンパク質成分の質量分析に基づいています。

この手法の主な利点は、迅速かつ定量的な結果が得られることです。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、同じ名前で知られているタンパク質と異なる種が実際には種を同定するのに十分なほど異なるだけでなく、定量を可能にするほど類似していることに気付いたときです。サンプルを95°Cのホットブロックで30分間加熱することにより、精製した参照ミオグロビンを熱変

サンプルが室温に達するまで約15分間冷却します。次に、30ミリグラムの尿素を加えて消化を促進し、混合します。トリプシン溶液をサンプルに、酵素と基質の重量比が1対30で加えます。

その後、穏やかなボルテックスで混合し、摂氏37度で一晩タンパク質分解します。次に、タンパク質分解後のサンプルを脱塩し、まずサンプルを水で1〜2容量に希釈します。30ミリグラムの逆相材料で満たされたポリマー逆相カートリッジを活性化し、1ミリリットルのメタノールを追加します。

次に、1ミリリットルの1パーセントギ酸を追加してカートリッジを平衡化します。重力下でサンプルをカートリッジにロードします。次に、1%のギ酸を含む1ミリリットルの5%メタノールで洗浄します。

1ミリリットルのアセトニトリル水でペプチドを、5マイクロリットルのDMSOをあらかじめ充填した2ミリリットルの微量セントロフュージチューブに溶出します。次に、遠心蒸発器を使用して摂氏50度の真空下で溶媒を120分間除去します。次に、残留物を250マイクロリットルのアセトニトリル水に再溶解します。

溶液を少量のオートサンプラーバイアルに移します。UniProtデータベースで、さまざまなミートのミオグロビン配列を見つけます。ミオグロビン配列をペプチドおよび遷移予測ソフトウェアのターゲットボックスに入力します。

必要に応じて、ペプチドにカーソルを合わせると、そのフラグメントリストが表示されます。テキストプロトコルで説明されているように設定を入力した後、[エクスポート]をクリックして[トランジションリスト]を選択し、生成されたMRMトランジションとパラメータを含むスプレッドシートを作成します。オートサンプラーとC18コアシェルHPLCカラムをトリプル四重極質量分析計に接続された、MRM検出を備えた正のエレクトロスプレーモードで動作するバイナリグラジエントの高性能液体クロモトグラフィーまたはHPLCシステムを構築します。

液体クロモトグラフィー質量分析データ収集ソフトウェアの「パラメータ編集」セクションで、スキャンタイプとして「MRM」を、極性として「ポジティブ」を選択します。スプレッドシートで作成したトランジションのQ1、Q3、時間、ID、DP、CEの値を入力し、集録方法を保存します。テキストプロトコルに記載されているメソッドパラメータを設定した後、データ収集ソフトウェアに移動し、[Acquire]をクリックして[Equilibrate]を選択します。

開いたボックスで、装置の均衡化を開始するために必要な取得方法を選択します。次に、サンプルバイアルをオートサンプラーのラックに入れます。[ファイル] をクリックして [新規] を選択し、次に [取得バッチ] を選択します。

[サンプル名] に、分析する各サンプルの ID を挿入します。取得したデータを視覚化する方法の詳細については、テキストプロトコルを参照してください。以前に冷凍して粉末にした肉を使用してください。

15ミリリットルのプラスチック遠心分離管にそれぞれの量の肉を計量することにより、さまざまな肉の混合物を準備します。ミートパウダーに4ミリリットルの抽出緩衝液を加えます。30秒間ボルテックスした後、ラボシェーカーで室温で2時間、毎分250サイクル

抽出物の2ミリリットルを2ミリリットルの微量遠心分離機チューブに移し、摂氏4度と17、000 Gで5分間遠心分離します。遠心式蒸発器を使用してサンプルを乾燥させてから、テキストプロトコルに記載されているサンプルのタンパク質濃度を決定します。肉混合物のタンパク質分解を行うには、乾燥残留物を1ミリリットルの25ミリモル重炭酸アンモニウム溶液に再溶解します。

ボルテックスでよく混合し、前回と同様にプロテオロイシスを行います。次に、スケジュールされた MRM を使用して、同様の方法で LCMS をセットアップして実行します。データ表示ソフトウェアで完全なクロマトグラムを表示します。

各トランジションセットの抽出されたイオンを順番に表示します。各クラスターに、予想される保持時間に必要な数の釣鐘形のピークが含まれていることを視覚的に確認します。これにより、選択されたペプチドの存在を確認する。

次に、ナビゲーションバーの「Quantiation Wizard」をダブルクリックします。Select Samplesウィンドウで、1つのデータファイルを選択して定量セットを作成します。次に、使用可能なサンプルを 1 つ以上選択します。

[次へ] を選択して、選択設定とクエリ ボックスを表示します。デフォルト設定をそのままにして [次へ] を選択し、[方法の選択] を表示します。ドロップダウンの [メソッド] ボックスから統合メソッド ファイルを選択し、最後に [完了] を選択します。

結果テーブルを保存し、テキスト ファイルとしてエクスポートし、スプレッドシートで開いて、テキスト プロトコルで説明されているようにデータを確認します。この図は、牛肉と体重の混合物の 1% の重量から得られた馬の最も強い MRM 遷移を示しています。対照的に、赤い線は馬がいないときの牛肉からの移行を示しています。

これは、牛肉の馬の測定値と準備された量のプロットであり、比率で表されます。このプロットは、この方法を使用して定量的な測定を行う方法を明確に示しています。一度習得し、バッチ処理を使用すると、この方法によるスループットは24時間あたり最大20サンプルに達することができます。

この手順を試行する際には、抽出分析に適したタンパク質を選択することを忘れないでください。ミオグロビンは、豊富で水溶性で、熱に安定しているため、赤身の肉種を調べるのに適した候補です。この手順は、同時に同定および定量されるべきさらなる種を含むように拡張することができます。

最大数は、質量分析スキャン速度によってのみ制限されます。この技術は、研究者が消費者やブランド保護などの分野でペプトフィンガープリントを使用する道を開いています。