空気圧液滴操作プラットフォームのマルチ塩基多型の視覚比色検出

この手順の全体的な目標は、多塩基多型を視覚的に検出する簡単な方法と空気圧式液滴操作プラットフォームを組み合わせることです。DNA検出プラットフォームはオープンサーフェスにあり、生化学研究者が簡単に使用できます。遺伝子変異や遺伝性疾患を繰り返し検出する簡便なツールについて検討しました。

遺伝的変異がどのように病気につながるかを理解するのに役立つ大きな可能性を秘めています。私たちは、2つの斬新でシンプルな方法を組み合わせています。多塩基多型は、肉眼で、追加の機器なしで空気圧式液滴操作プラットフォームで検出できます。

多塩基多型を検出する方法は、私たちのグループのポストドクターであるTzu-Ming Wangによって実証されます。この手順を開始するには、テキストプロトコルに示されているように、プローブDNAの100マイクロモル溶液を調製します。次に、プローブDNAを金ナノ粒子の1ミリリットルあたり1OD溶液に添加します。

SDSの最終濃度を0.01%に、PBSの最終濃度を0.01モルにします。溶液を20分間インキュベートします。次に、2モルの塩化ナトリウムと0.01モルのPBSの溶液を追加して、塩化ナトリウムの濃度を0.01モルに上げます。

SDS濃度を0.01%に維持し、溶液を20分間インキュベートします。塩化ナトリウムの濃度を20分間隔で0.1モル刻みで増加させ、最終濃度が1モルに達するまで。溶液を23°Cでローテーターで一晩インキュベートします。

DNAサンプルと金ナノ粒子が結合した後、溶液を7, 000倍gで30秒間遠心分離します。上清を取り除きます。次に、ペレットを脱イオン水に再懸濁することにより、25ナノモルの金ナノ粒子プローブ溶液を調製します。

テキストプロトコルに概説されているように、ターゲットDNAサンプルを調製します。塩化ナトリウムを含む各DNAサンプルに6マイクロリットルの金ナノ粒子プローブ溶液を加えます。ボルテックスミキサーを使用して、各サンプル溶液を摂氏23度で5分間振とうします。

次に、6マイクロリットルの400ミリモルヒドロキシルアミンと6マイクロリットルの25.4ミリモルクロロオーリン酸を各DNAサンプル溶液に加えます。これらのサンプルは、次の1時間で色の着実な変化が発生するため、脇に置いておきます。ナノ粒子のサイズ、形状依存性の光学特性、典型的なサンプルDNA断片のミスマッチの数は、目で識別することができる。

液滴操作プラットフォームの製造を開始するには、0.5ミリメートルのドリルビットを備えたコンピューター数値制御マシンを利用して、微細構造を備えたPMMAベースのマスターモールドを作成します。ドリルには、毎秒7ミリメートルの送り速度と26、000rpmの回転速度を使用し、穴あけ後に金型を検査します。送風機と脱イオン水を使用してマスターモールドの表面を清掃し、PMMAスクラップを取り除きます。

その後、PDMSベースと硬化剤を10対1で混合した液を調製します。すべての気泡が除去されるまで、混合物をデシケーターで脱気します。次に、PDMS混合物をマスターモールドに流し込みます。

摂氏60度で3時間焼成し、空気室と空気チャネルの逆微細構造を取得します。ベーキングが完了したら、マスターモールドからPDMSレイヤーを取り外し、エアサクションインレット用に穴を開けます。酸素プラズマ処理システムを使用して、PDMSメンブレンとPDMS層を洗浄します。

処理後、PDMSメンブレンとPDMS層を接着し、この結合構造に穴を開けます。次に、PDMSとガラス基板を90°Cのホットプレートで10分間接着します。層が接着されたら、複合プレートをレーザー切断機のPDMS膜面を上にして配置します。

dwgファイルをインポートして超疎水性領域を定義し、これがPDMS膜に直接刻印されることに注意してください。新しく彫刻された超疎水性表面を脱イオン水で洗浄します。これにより、炭化した残留物が洗い流されます。

表面を清掃した後、エアサクションインレットとバキュームポンプをソレノイドバルブで接続します。次に、電磁弁をコンピューターに接続して、デジタルIOUSBモジュールで制御します。空気圧式液滴操作プラットフォームをセットアップしたら、超疎水性領域に10マイクロリットルの0.5マイクロモルのターゲットDNAを追加します。

次に、新たにハイブリダイズした25ナノモル金ナノ粒子プローブ溶液10マイクロリットルを標的DNA滴の隣に加える。簡単なプログラムを使用して、ソレノイドバルブを介してプラットフォームへの空気吸引を制御します。圧力を負の 80 キロパスカルに設定し、駆動周波数を 5 ヘルツに設定します。

液滴の振動経路に沿って吸引力を提供し、液滴を衝突させて合体させます。次に、合体した液滴を吸引操作してサンプルを3分間転がして混合します。空気圧液滴操作プラットフォームの超疎水性領域に、400ミリモルのヒドロキシルアミンを2マイクロリットル、および25.4ミリモルのクロロオーリン酸を2マイクロリットル追加します。

液滴が衝突して合流するように吸引を操作します。次に、マージした液滴を1分間転がして混合します。最終的な液滴の色を肉眼で観察します。

この研究では、金ナノ粒子プローブのDNAハイブリダイゼーション媒介成長を使用して、多塩基多型を比色的に検出します。ここでは、DNAサンプルはプローブDNAに対して異なる親和性を持っており、色の変化として見られる金ナノ粒子の成長に違いを引き起こします。3塩基対のミスマッチDNAサンプルは、完全に相補的なDNAよりもハイブリダイゼーションが少なく、特に高濃度では色の顕著な違いが見られます。

6塩基ミスマッチDNAは、プローブに対するハイブリダイゼーション親和性が弱く、したがって金ナノ粒子の成長サイズは小さかった。この比色分析は、DNAの不一致の結果が肉眼で容易に観察できるため、サンプルを空気圧吸引プラットフォームを介して操作すると再現性があることが示されています。一度習得すれば、サンプルと試薬の添加から結果が出るまでの手順全体は5分未満で完了し、従来の方法よりもはるかに迅速です。

各操作の合計はわずか10マイクロリットルで、大規模なシステムで必要な量よりも大幅に少なくなります。この手順に続いて、DNA断片の空間の配列変異が特定の疾患の原因であることが確認されると。特別に設計された製品は、サンプルDNAの多数のミスマッチを取得するために使用できます。

空気圧式液滴マニピュレーションプラットフォームは、光学重み付け、色素電気蛍光、電気重み付け、シュームーの毛細管作動などの他の方法よりも生体適合性があります。提案されたマルチヌクレオチド多型検出法は、空気圧式液滴操作プラットフォームの下で実施されたため、サンプルと試薬を直接ピペットでロードして収集できます。開発後、この技術はDNAスクリーニング、およびその他の化学的および生物学的応用に高い可能性を秘めています。