設計と低コストの使用、自動Morbidostat細菌の適応進化のための抗生物質選択下

この実験の全体的な目的は、細菌の増殖を継続的にモニタリングし、細菌が薬剤耐性を獲得するにつれて抗生物質濃度を動的に調整するMorbidostatを用いて、抗生物質耐性の進化経路を特性づけることです。この手法の主な利点は、安価で容易に入手可能な電子部品で構成されており、特定の目的に合わせて簡単に再構成できる点にあります。手順のデモンストレーションは、私の研究室の大学院生であるPo Cheng LiuとYi Tai Leeが行います。

Morbidostatを組み立てるため、まず18ゲージの針を使用して、培養バイアルのキャップに3つの穴を開けます。約7 cmの長さのポリエチレンチューブを3本切り出し、キャップの穴に挿入します。テープでキャップの縁を巻き、ポリジメチルシロキサン（PDMS）混合物の型として使用します。

次に、150 mLのプラスチック容器にPDMSのコンポーネントAを5 g、コンポーネントBを0.5 g加え、つまようじで手動で撹拌します。この混合液を10 mLのシリンジに充填します。その後、シリンジを用いて、PDMS混合液をキャップ上に注入します。

PDMSを硬化させるため、キャップ全体を70 °Cで8時間加熱します。次に、はんだごてを用いて、LEDのアノードを24ゲージのワイヤーに、LEDのカソードをカーボン抵抗器にはんだ付けします。その後、680 Ohmのカーボン抵抗器を24ゲージのワイヤーにはんだ付けします。

絶縁テープを使用して配線接続部を絶縁します。フォトディテクタのコレクタを24ゲージの電線で、エミッタを100 Ohmのカーボン抵抗でハンダ付けします。その後、絶縁テープを使用して配線接続部を絶縁します。

発光ダイオードを培養バイアルホルダーに設置します。ここに示す回路図に従って発光ダイオードを接続し、5 V電源で給電します。IRを検出可能なデジタルカメラを使用して、LEDが動作することを確認してください。次に、フォトディテクターを培養バイアルホルダーに設置します。

次に、図に従って光検出器を接続し、5 V電源を使用して電力を供給します。電子制御基板の両端の電圧を測定するため、光検出器の抵抗の両端に電線を接続します。マグネチックスターラーユニットとして機能する冷却ファンシャフトに磁石を接着します。

磁気攪拌ユニットは磁石と冷却ファンで構成されているため、ファンの棚を培養バイアルに合わせて調整することが極めて重要です。また、安定した動作を確保するためには、培養バイアルと磁石の間の距離が非常に重要になります。培養バイアルの各ポリエチレンチューブを、マイクロポンプ、培地ボトル、および廃液ボトル用の対応するシリコンチューブに接続します。

ポンプを1時間作動させ、培地ボトルから培養バイアルへ送液された全量を測定して、ポンプの送液速度を決定します。標準的な送液速度は約4 mL/hであり、これは培養バイアルのワーキングボリュームが12 mLの場合、希釈率 D = 0.33 /h に相当します。セットアップが完了したら、アセンブリ全体を中型の振盪インキュベーターに設置します。

Morbidostatの事前テストを行うため、冷却ファンの電源電圧を5 Vに設定してモーターを始動させ、マグネティックスターラーをテストします。テキストのプロトコルに従って一連のE-coliサンプルを調製し、検量線をプロットした後、デバイスの入口として、内径1/32インチ、外径3/32インチの超耐薬品性Tygonチューブを7 cmの長さに3本用意し、培養バイアルを準備します。0.2% glucoseを含むM9最小培地と、薬剤Trimethoprim（TMP）を含むM9培地を調製します。

次に、培地、培地ボトル、薬剤添加培地ボトル、廃液ボトル、および培養バイアルをオートクレーブで121 °Cで滅菌します。実験の1日目に、凍結保存した野生型 E-coli MG1655 細胞 1 mLを室温で5分間解凍し、その細胞 120 µLを約 12 mLのM9増殖培地を含む培養バイアルに転移します。振盪インキュベーターの電源を入れ、温度を30 °Cに設定し、振盪なしの状態にします。

マイクロポンプ、磁気撹拌装置、および光学密度測定をオンにして、Morbidostatの運転を開始します。約23時間後、供給電圧をオフにしてマイクロポンプを停止し、培養バイアルを取り出します。培養バイアルに15% glycerolを添加し、保存のためにサンプルを-80 °Cで凍結します。

これらの各実験の開始時に新しい培養バイアルに切り替えることも、ビオチンの形成を避けるために重要です。そうしないと、2〜3日のうちにビオチンの形成が起こる可能性があります。凍結保存した日次サンプルを室温で5分間解凍した後、新鮮なM9培地を入れた新しい試験管に接種してください。

サンプルを37℃の振盪インキュベーターに入れ、一晩培養する。翌日、M9培地を用いて微生物サンプルを10倍に希釈し、微生物サンプル容器を5 PSIで加圧してマイクロ流体デバイスに導入する。次に、TMPを含むM9培地の容器を5 PSIで加圧し、TMP含有培地をチップに導入する。

マイクロ流体チップ上の2つのチャンバー間にあるマイクロメカニカルバルブを作動させ、微生物と薬剤を15分間混合させます。最後に、倒立顕微鏡に装着された顕微鏡用インキュベーターにマイクロ流体チップを設置します。CCDカメラを用いて、増殖チャンバー内の細胞画像を8時間にわたり1時間ごとに取得します。

テキストプロトコルに従って細胞数のデータを算出します。実験的進化、抗生物質感受性試験、細胞形態の確認を含む一般的なMorbidostatの操作について、抗生物質TMPに曝露させたE-coli MG1655培養株を用いて検証しました。TMPは、ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）遺伝子周辺に集積する変異により、薬剤耐性が段階的に増加するという特徴的な現象を誘発します。ここに示すように、微生物は毎日、あらかじめ設定された光学密度（OD）の閾値を超えて増殖し、薬剤の注入をトリガーすることが期待されます。

薬剤の投与により増殖が抑制され、その結果、光学密度が低下することが予想されます。このプロットは、IC50を決定するための実験における、抗菌薬耐性の経時的な上昇を示しています。薬剤耐性は約12日間で、約1500倍の1,000 micrograms per milliliterまで上昇しました。

以前の知見と一致しています。last day変異株におけるDHFRの点突然変異をサンガーシーケンシングで測定し、本表に記載しました。複数の変異を伴う薬剤耐性の獲得は、Morbidostatの有用性を証明しています。

薬剤含有アガープレートによる選択では、単一の変異のみが導入される傾向があります。この図は、さまざまな濃度のTMPにおけるチップ上の増殖曲線を示しています。変異体サンプルでは、抗生物質への薬剤耐性が著しく増加していることがわかります。

この技術の開発により、実際の制御された実験室環境において、抗生物質耐性の位置を研究する道が開かれました。本手順に続き、抗生物質への曝露によって形態が変化するかどうかなど、さらなる疑問を解決するために、マイクロ流体単一細胞測定などの他の測定を行うことができます。このデバイスを習得すれば、特定の細菌の培養や細菌株の耐性レベルの向上など、あらゆる細菌培養実験に合わせて容易に再構成することが可能です。

このビデオを視聴することで、実際の対照的な適応実験室進化実験において、抗生物質耐性の獲得をどのように研究するかについて深く理解できるはずです。薬剤耐性菌を取り扱う際は、微生物学的な実践に関するバイオセーフティルールに従うことを忘れないでください。細菌の基礎的なトレーニングを伴う実験には、特別な許可が必要な場合があります。