Name: 小動物モデルにおける尿路感染症: 雌雄マウスの尿道カテーテル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: 学ぶ尿路感染症の免疫応答をマウスで調べる新しい雌雄比較モデル。自然経路で感染を確立し、膀胱がん研究にも応用可能な手法で、性別差の理解に貢献します。

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このプロトコルとプロジェクトの開発中に原稿および樹状免疫生物研究所の有用な洞察力のための重要な読書を Dr マチュー ルソーを感謝いたします。この作品は一部欧州連合第 7 フレームワーク プログラム マリー キュリー アクション (免疫腫瘍学 LabEx (MAI) PCIG11 GA 2012 3221170 からの資金によって支えられました。

Comité d プロトコル番号 2012-0024 の承認に従ってマウス実験を行った ' éthique アン expérimentation animale パリ中心部 et シュッド (動物実験倫理委員会)、欧州指令 2010年/63 のアプリケーションでEU。
1. カテーテルの準備
<ol><li>感染マウスのグループごとに 1 つの小児静脈アクセス カニューレを準備します。製造元の指示に従って、その針の各カニューレを売却作り付けのバネ機構を使用して。プラスチックの静脈カニューレだけを保持する、針を破棄します。</li>
	<li>1 つ紫外 (紫外線) サイクル、通常 25-30 分の層流フードのカテーテルを滅菌します。 メモ: カテーテルは実験グループ、男女、または細菌の緊張の間新しいカテーテルを使用しかし、1 つ以上のマウスに使用できます。</li>
</ol>2. 尿路エシェリヒア属大腸菌の感染症のための準備
<ol><li>適切な場合、感染、滅菌接種ループ、ルリア スープ (LB) 寒天プレートの上に冷凍の細菌の在庫から連勝 UPEC を使用する前に、少なくとも 2 日間は抗生物質を含みます。37 ° C で一晩インキュベートします。プレートは、4 ° C で 1 週間保存できます。</li>
	<li>100 ml 滅菌エルレンマイヤー フラスコ 10 ml 場合 LB プレートから単一のコロニー、適切な抗生物質を含む LB を接種して立っている 37 ° c 一晩 (約 16-18 時間) を孵化させなさい。 注: 立っている文化は 1 ピリ pili、感染症23に必要な型の式を許可します。文化揺れ栽培は効率の pili 式を持っているため、感染率が矛盾。</li>
	<li>一晩かけて培養の光学濃度 (OD)600を測定し、あらかじめ決められた成長曲線を用いた ml 当たりの細菌数を計算します。たとえば、UPEC ひずみ UTI89、外径600 = 0.35 は 2 × 108 CFU ml、したがって、外径600一晩文化あたりに相当 = 2.4 13.7 x 10 に相当する8 CFU/ml 経験的判断との関係、外径600と細菌感染症のために用いられるすべての新しいひずみと。</li>
	<li>
50 μ l の PBS で感染している動物の数を考慮した必要な細菌の量と各マウスが約 107コロニー形成単位 (CFU) を受信する必要がありますを決定します。カテーテルと注射器の要点と接種を決定に必要な 100 μ l の ~ 130 μ l のデッド ボリュームを計算に含めます。
	<ol>
<li>1 分 17,000 x g で卓上遠心機で細菌懸濁液を回し、2 x 108 CFU PBS で ml あたりで結果細菌ペレットを再懸濁します。この懸濁液と抗生物質に応じて、各感染症の正確な接種を決定すると、LB 寒天プレートの因数を連続希釈します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 ml 注射器に、菌を描画し、注射器の端にカテーテルを接続します。任意の空気を除去し、注入を開始する前にカテーテルでデッドエアを領域にプランジャーを押し下げるにシリンジをタップします。</li>
</ol>3. マウスの作製
<ol><li>100 mg/kg のケタミン 5 mg/kg とキシラジンの腹腔内投与によるマウスを麻酔します。補足熱を提供することができます。</li>
	<li>各マウスが中型圧力の足蹠を絞ることによって完全に鎮静させられたことを確認します。マウスは、彼らは反応してこの状態に到達する 3-5 分を必要とするときに完全に鎮静されています。</li>
	<li>仰臥位マウスを配置し、中圧を尿の膀胱を空に下腹部に適用します。完全に膀胱はイレウスの紋章の間の皮膚下に豆粒のような感じ。 注: イソフルレンの吸入はカテーテルを入れて下さい雌マウス15,22に使用されています、しかし、それはテストされていない雄マウスはこのプロシージャの吸入のイソフルラン麻酔十分にかどうか。</li>
</ol>4. 尿道注入雌マウスの
<ol><li>非利き手を使用すると、尾とマウスの腹部に同じ手の指に親指を置くし、場所でマウスをしっかりと保持する方向を反対に穏やかな圧力を適用します。</li>
	<li>
尿道口にカテーテルの先端をマウスに垂直に配置します。穏やかな圧力とハブが作業面に平行になるので、同時に注射器を削減しながら尿道口を満たすまで、尿道にカテーテルをスライドします。カテーテルに潤滑が必要がありません。プッシュしたり、尿道にカテーテルを強制しないでください。カテーテルは、ほとんど抵抗せずに、尿道にスムーズかつ簡単にスライドするが。
	<ol>
<li>1 回接種 (ステップ 4.3) を浸透させる前にカテーテルは非常に優しく非利き手から指でマウスの頭に向かって腹部の皮膚に手がプルは既に (手順 4.1) マウスの腹部の上の場所では。場合は尿道カテーテルは、カテーテルを膣内挿入することはなく、組織が移動、カテーテルからに対し、尿道の開口部を構成する組織は移動しません。この急速なテストは、それぞれのマウスの実行必要があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>カテーテルのハブには、尿道口が満たしている、ゆっくりと、菌の 50 μ l を分配します。低速注入率は、腎臓に膀胱尿管逆流を最小限に抑えます。数 5 以上の漏れを防ぐためにカテーテルをゆっくり取り外します。仰臥位で檻の中でマウスを配置します。</li>
</ol>5 雄マウスの経尿道的注入
<ol><li>マウスの性器に頭側と尾側 2 つ親指鉗子を配置します。亀頭を完全に公開する包皮を撤回します。外部の陰茎を配置すると、一度親指鉗子をリリースします。</li>
	<li>動物に優しく、緊張して臓器を保持する垂直な突出のペニスを安定させるために鉗子の位置を変更します。尿道口を視覚化し、器官の先端に小さな開口部にカテーテルを慎重に導入します。鉗子と穏やかな緊張感を維持する、マウスの体に向かって、ペニスにカテーテルをゆっくりとガイドします。カテーテルに潤滑が必要がありません。ペニスにカテーテルを押し込まないでください。カテーテル尿道に、適切な配置を示すにスムーズにスライドしてください。</li>
	<li>カテーテルのハブには、陰茎の先端が満たしている、一度、非常にゆっくりとペニスの位置を維持しながら、菌の 50 μ l を分配する必要があります。この時点であらかじめ決められた注入の品質スコアは、図 2に示すようによると、注入の品質を明記します。</li>
	<li>5 接種の漏れを防ぐために数をゆっくりとカテーテルを撤回します。仰臥位で檻の中でマウスを配置します。動物は、麻酔薬の投与 30-45 分を回復し始める必要があります。</li>
</ol>6. 感染した臓器に CFU の定量
<ol><li>所定の時点では、犠牲のマウスを使用しては、標準操作手順書 (例えば、頚部転位または二酸化炭素の過剰摂取) を承認しました。毛皮による汚染を最小限に抑えるための 70% のエタノールで十分に腹部を湿らせます。</li>
	<li>2 cm 以上のはさみを使用してマウスの腹部のより低い三番目の間で切開を行い、無菌 5 ml に膀胱とその他を含むが、これらに限定されない目的の臓器、腎臓、精巣、精嚢、または包皮腺を削除ポリプロピレン製スナップ キャップ チューブ 1 ml 滅菌 PBS を含みます。氷の上のすべてのサンプルを保ちます。</li>
	<li>固体組織にほぼないまま、臓器によって異なります約 15 60 秒までハンドヘルド ホモジナイザーを用いた臓器をホモジナイズしてください。脂肪がないまあ、均質化、光沢のあるベージュ ホワイト組織としてわかりやすいです。脂肪を前または次の均質化を破棄します。PBS の間続いてエタノールで、ホモジナイザーを洗う各実験または臓器グループ。 注: 通常、ハンドヘルド ホモジナイザーまたはビード ミル ホモジナイザーを使用します。細菌生存率を維持しながらホスト組織を均質化するための最適の条件必要があります前に経験的に定められる一方、これらすべてのシステムが、24 時間後の感染症で細菌 CFU の直接の比較によって決定されると、同様の結果を得られています。日常的にこのプロトコルを実行します。</li>
	<li>均質化器官の懸濁液のシリアル希薄を実行します。プレートのとき、適切な抗生物質を含む LB 寒天プレートに希釈し, 37 ° C で一晩 (~ 15 時間)UPEC 系統倍加時間が非常に高速があるなど注意が必要ないこれは個々 のコロニーをカウントする機能を低下させるため長すぎる寒天をインキュベートします。</li>
</ol>7. 膀胱組織のフローサイトメトリーによる解析
<ol><li>34 単位/ml でコラゲナーゼと 100 μ g/mL、PBS で DNase を含む消化バッファーを準備します。氷の上を保ちます。動物を分析するのにあたり 1 つの 15 ml の円錐管と管ごとに分注 1 ml 消化バッファーを準備します。</li>
	<li>あらかじめ決められた縦長犠牲マウスを使用して標準操作手順書 (例えば、頚部転位または二酸化炭素の過剰摂取) を承認しました。毛皮による汚染を最小限に抑えるための 70% のエタノールで十分に腹部を湿らせます。</li>
	<li>
2 cm 以上のはさみを使用してマウスの腹部のより低い三番目の間で切開し全体の膀胱を外します。ミンチも、はさみで 2 〜 3 mm にサイズ2個、通常は約 8 個の膀胱を切断します。
	<ol>
<li>消化バッファーを含むチューブあたり 1 つのみじん切りにした膀胱を追加します。消化バッファーにみじん切りにした膀胱組織を洗浄するために振る。氷すべて膀胱を切除し、みじん切りまで続けます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>5 手で活発な動揺と、37 ° C で 60-75 分のみじん切りにした膀胱を孵化させなさい s 15 分毎。ティッシュ、ティッシュ ペーパーのようなガラスの透明な外観消化は完了です。長時間消化識別に必要な細胞の表面蛋白質を削除され、避けるべきであります。</li>
	<li>2-3 mL の冷たい流れ cytometry バッファー (PBS 2% ウシ胎児血清 (FBS)、0.2 mM EDTA を含む) を追加することで消化酵素を不活性化、軽く混ぜます。氷の上の管を配置します。</li>
	<li>単一細胞懸濁液を確認し、任意の結合組織を削除するは、管の内容を 15 mL の円錐管に 100 μ m フィルターを通過します。シリンジのプランジャーの最後がフィルターを任意の残りのティッシュを軽く押してください。追加 2 mL 流れ cytometry バッファーが付いているフィルターを洗います。氷の上のサンプルを保ちます。</li>
	<li>200 x g、4 ° C で 7 分間の遠心分離によってサンプルを洗う100 μ L 流れ cytometry バッファー含む Fc ブロック、96 ウェル底板ラウンドに 5 μ g/mL に希釈でペレットを再懸濁します。10-15 分後に、各サンプルに 100 μ L 必要な抗体カクテルを追加します。30-45 分、氷、光から保護のためのサンプルをインキュベートします。 注: Fc ブロックは Fc 受容体を発現する細胞に抗体の Fc 部分の結合を防ぐために使用される試薬です。その目的は、非特異的な抗体の結合を最小限に抑えることです。使用する抗体の定量実験でテストされている仮説に依存するが、文献からの入力で選択する必要があります。図 3、全体的な免疫細胞の浸潤を測定する抗 CD45 抗体を用いて、パン免疫細胞タンパク質であります。</li>
	<li>200 x g、4 ° C で 7 分間の遠心分離によってサンプルを洗う200 μ L 流れ cytometry バッファーで細胞ペレットを再懸濁します、40 μ m の細胞のストレーナーを直前の流れの cytometer によるポリスチレン 5 ml チューブにサンプルを通過します。</li>
	<li>流れの cytometer で全体のサンプルを収集します。良い消化になります 200,000 400,000 セル、8,000-10,000 CD45+素朴なマウス膀胱、感染臓器が含まれている以上中から免疫細胞細胞16 (図 3)。 注: フローサイトメトリー解析用試料は、CFU を評価する使用できません。その UPEC 植民地化を実証する証拠が存在しないなどの免疫細胞の浸潤が組織全体に均一な膀胱を 2 つの部分に分割することはお勧めしません。</li>
</ol>

<ol><li>Hooton, T. M., Stamm, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+treatment+of+uncomplicated+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Dis+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and treatment of uncomplicated urinary tract infection.</a> Infect Dis Clin North Am. 11 (3), 551-581 (1997).</li>
<li>Harper, M., Fowlis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+urinary+tract+infections+in+men%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Urology%2C+Gynaecology+%26+Sexual+Health%22%5BJournal%5D)">Management of urinary tract infections in men.</a> Trends in Urology, Gynaecology & Sexual Health. 12 (1), 30-35 (2007).</li>
<li>Foxman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidemiology+of+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Urol%22%5BJournal%5D)">The epidemiology of urinary tract infection.</a> Nat Rev Urol. 7 (12), 653-660 (2010).</li>
<li>Lipsky, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+tract+infections+in+men.+Epidemiology%2C+pathophysiology%2C+diagnosis%2C+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Urinary tract infections in men. Epidemiology, pathophysiology, diagnosis, and treatment.</a> Ann Intern Med. 110 (2), 138-150 (1989).</li>
<li>Conway, L. J., Carter, E. J., Larson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+Factors+for+Nosocomial+Bacteremia+Secondary+to+Urinary+Catheter-Associated+Bacteriuria%3A+A+Systematic+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Urol+Nurs%22%5BJournal%5D)">Risk Factors for Nosocomial Bacteremia Secondary to Urinary Catheter-Associated Bacteriuria: A Systematic Review.</a> Urol Nurs. 35 (4), 191-203 (2015).</li>
<li>Markle, J. G., Fish, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeXX+matters+in+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">SeXX matters in immunity.</a> Trends Immunol. 35 (3), 97-104 (2014).</li>
<li>Yu, C. Y., Whitacre, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex%2C+MHC+and+complement+C4+in+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Sex, MHC and complement C4 in autoimmune diseases.</a> Trends Immunol. 25 (12), 694-699 (2004).</li>
<li>Castelao, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender-+and+smoking-related+bladder+cancer+risk%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Gender- and smoking-related bladder cancer risk.</a> J Natl Cancer Inst. 93 (7), 538-545 (2001).</li>
<li>Donsky, H., Coyle, S., Scosyrev, E., Messing, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+incidence+and+mortality+of+bladder+and+kidney+cancers%3A+national+estimates+from+49+countries%5BTitle%5D)+AND+%22Urol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Sex differences in incidence and mortality of bladder and kidney cancers: national estimates from 49 countries.</a> Urol Oncol. 32 (1), 40-e31 (2014).</li>
<li>Garg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender+Disparities+in+Hematuria+Evaluation+and+Bladder+Cancer+Diagnosis%3A+A+Population-Based+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">Gender Disparities in Hematuria Evaluation and Bladder Cancer Diagnosis: A Population-Based Analysis.</a> J Urol. , (2014).</li>
<li>Dobruch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender+and+Bladder+Cancer%3A+A+Collaborative+Review+of+Etiology%2C+Biology%2C+and+Outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Urol%22%5BJournal%5D)">Gender and Bladder Cancer: A Collaborative Review of Etiology, Biology, and Outcomes.</a> Eur Urol. , (2015).</li>
<li>Hsu, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+tumorigenesis+and+mortality+from+bladder+cancer+in+mice+lacking+urothelial+androgen+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Decreased tumorigenesis and mortality from bladder cancer in mice lacking urothelial androgen receptor.</a> Am J Pathol. 182 (5), 1811-1820 (2013).</li>
<li>El Behi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+for+decorin+in+bladder+cancer+invasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">An essential role for decorin in bladder cancer invasiveness.</a> EMBO Mol Med. 5 (12), 1835-1851 (2013).</li>
<li>Foxman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+urinary+tract+infections%3A+incidence%2C+morbidity%2C+and+economic+costs%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs.</a> Am J Med. 113, Suppl 1A. 05S-13S (2002).</li>
<li>Ingersoll, M. A., Kline, K. A., Nielsen, H. V., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-CSF+induction+early+in+uropathogenic+Escherichia+coli+infection+of+the+urinary+tract+modulates+host+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">G-CSF induction early in uropathogenic Escherichia coli infection of the urinary tract modulates host immunity.</a> Cell Microbiol. 10 (12), 2568-2578 (2008).</li>
<li>Mora-Bau, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+Subvert+Adaptive+Immunity+to+Urinary+Tract+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Macrophages Subvert Adaptive Immunity to Urinary Tract Infection.</a> PLoS Pathog. 11 (7), e1005044(2015).</li>
<li>Oliveira, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+Report%3A+Technique+of+Bladder+Catheterization+in+Female+Mice+and+Rats+for+Intravesical+Instillation+in+Models+of+Bladder+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22%28Conference+Title%2939th+Scand-LAS+and+ICLAS+Joint+Meeting%22%5BJournal%5D)">Technical Report: Technique of Bladder Catheterization in Female Mice and Rats for Intravesical Instillation in Models of Bladder Cancer.</a> (Conference Title)39th Scand-LAS and ICLAS Joint Meeting. 36, 5-9 (2009).</li>
<li>Seager, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravesical+delivery+of+rapamycin+suppresses+tumorigenesis+in+a+mouse+model+of+progressive+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Prev+Res+%28Phila%29%22%5BJournal%5D)">Intravesical delivery of rapamycin suppresses tumorigenesis in a mouse model of progressive bladder cancer.</a> Cancer Prev Res (Phila). 2 (12), 1008-1014 (2009).</li>
<li>Hagberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascending%2C+unobstructed+urinary+tract+infection+in+mice+caused+by+pyelonephritogenic+Escherichia+coli+of+human+origin%29%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Ascending, unobstructed urinary tract infection in mice caused by pyelonephritogenic Escherichia coli of human origin).</a> Infect Immun. 40 (1), 273-283 (1983).</li>
<li>Olson, P. D., Hruska, K. A., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androgens+Enhance+Male+Urinary+Tract+Infection+Severity+in+a+New+Model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Androgens Enhance Male Urinary Tract Infection Severity in a New Model.</a> J Am Soc Nephrol. , (2015).</li>
<li>Knipper, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-4+Receptor+alpha+Signaling+in+Myeloid+Cells+Controls+Collagen+Fibril+Assembly+in+Skin+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Interleukin-4 Receptor alpha Signaling in Myeloid Cells Controls Collagen Fibril Assembly in Skin Repair.</a> Immunity. 43 (4), 803-816 (2015).</li>
<li>Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A murine model of urinary tract infection.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1230-1243 (2009).</li>
<li>Wright, K. J., Seed, P. C., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+intracellular+bacterial+communities+of+uropathogenic+Escherichia+coli+depends+on+type+1+pili%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development of intracellular bacterial communities of uropathogenic Escherichia coli depends on type 1 pili.</a> Cell Microbiol. 9 (9), 2230-2241 (2007).</li>
</ol>

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雄マウスの尿道注入にセックスが膀胱粘膜病に与える影響の多くの新しい研究の機会を提供していますが、いくつかの課題について述べる。第一に、1 つの制限は、注入がカテーテル挿入時に過剰な炎症の結果、技術的に困難であると最初に証明するかもしれない。エバンス ブルー色素などの着色溶液で死んだマウスの点眼による技術の向上を実現できます。点眼が成功したことを確認するため膀胱を視覚的に調べる必要があり、ツベルクリン注射器で抽出して浸透させた液体の量を評価できます。ゆっくりとした穏やかな動きの重要性を誇張することはできません: 抵抗なし、これが過剰な炎症や組織の損傷で起因するので、カテーテルを挿入するために使用力がない必要があります。正しく実行されると、カテーテルは尿道に楽々 スライドされます。閉塞、または抵抗が感じられる場合、カテーテルを削除し、挿入を再試行することをお勧めします。
示しましたが、細菌負荷 24 時間感染後に注入の質を関連付けることによって、細菌の菌量が少ないが、感染症の時に失われた、不完全な技術はまだ堅牢な植民地化の結果、膀胱。このプロトコルを利用したで調査官は漏れのない注入を達...

尿路感染症 (UTI)、先進国1の最も一般的な感染症の 1 つです。感染率は女性と新生児や高齢者の2の間で男性の間と似ています。閉経前の成人女性、ただし、男性2,3と比較して市中の尿路感染症の発生率の大幅増加があります。この病気主に女性に影響を与える、ことを考える基礎研究と臨床研究が圧倒的に焦点を当てて UTI 女性。しかし、男性の尿路感染症は重要かつ流医療課題4です。確かに、男性の尿路感染症は高い罹患率に関連付けられて、ためこれらの感染症は複雑な4,5として定義されます定期的に。
生理学および病理学のセックス先入観の中心的な役割の私達の理解の拡大に伴って、新しいメソッドがこの以前無視された病気の側面を探索する必要です。性差は免疫と感染で重要な役割を再生します。女性が男性は特定の感染症、結核、マラリア、HIV6,7などになりやすい自己免疫疾患の発症率が高いがあります。別の泌尿器科病理膀胱癌は大幅、女性よりも男性においてより一般的、いくつかの研究は、悪性腫瘍8,9,10,11 の開発でアンドロゲンの役割を示しています。 ,12。特に、ただし、膀胱癌の膀胱内注入療法の検討、繰り返し男性マウス13カテーテルを入れて下さいできないのため、雌の動物でのみ実行されます。
尿路感染症の病態の研究は、感染 (例えば、マウスおよびラット) の齧歯動物モデルに大きく依存します。尿路感染症のマウスモデルを用いるかもしれない uropathogens もともとクレブシエラ属や腸球菌、ブドウ球菌、プロテウス14尿路エシェリヒア属大腸菌(UPEC) など人間の感染症から分離されました。通常、細菌は尿道カテーテルで膀胱に導入されます。次の感染症、膀胱、腎臓は、感染症、細菌の植民地化、組織の損傷、またはホストの免疫反応15,16などの特定のパラメーターを評価するために削除できます。普遍的に、ただし、女性動物だけは、尿路感染症研究のために使用されます。確かに、多くの研究は、解剖学的な理由により男性マウスのカテーテルはない可能な13,17,18,19を指摘しています。最近では、男性の注入する外科的アプローチが記載されている、腹部を開く膀胱は腹部の開口部に穏やかな圧力を適用することによって転置される外部および20膀胱に細菌を注入します。このアプローチにより、外科的介入を犠牲にして、男性の感染症です。したがって、このアプローチの主要な警告には、切開21に抗炎症創傷治癒応答を誘導する可能性など感染の結果に炎症の影響が含まれています。老舗非外科的経尿道的アプローチ女性齧歯動物22 で使用により近い男性マウスの細菌の膀胱内注入の手法を開発した我々 の利益が病気への応答における性差の理解として、.
私たちのモデルは、確立された方法論に基づいて構築し、直接女性と男性の動物でウチに宿主免疫応答を比較する機能を提供します。このメソッドは感染、セックスによる違いの解剖を許可し、感受性の発音の違いを分子・細胞の手がかりと男女間感染への応答を提供する可能性があります。さらに、このモデルは、膀胱癌、前立腺炎の下で- またはオーバーな膀胱症候群、間質性膀胱炎など、他の膀胱関連疾患を調べるためのモデルの確立を許可する UTI 研究を超えて値を持ちます。

<table><tbody><tr><td>BD Insyte Autoguard シールド IV カテーテル 24 G、外径 0.7 mm、長さ 14 mM</td><td>BD Medical</td><td>381811 または 381411*</td><td>* カタログ番号は国によって異なります</td></tr><tr><td>接種ループ</td><td>Greiner Bio-One</td><td>731171</td><td></td></tr><tr><td>LB Miller broth</td><td>Difco</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>LB Miller agar</td><td>Difco</td><td>244520</td><td></td></tr><tr><td>Cuvettes</td><td>Bio-rad</td><td>223-9955</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>B Braun</td><td>9166017V</td><td></td></tr><tr><td>親指(アドソン)鉗子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>5 ml チューブ、ポリプロピレン</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Ruptor 使い捨てプローブ</td><td>Qiagen</td><td>990890</td><td></td></tr><tr><td>15 ml フリップキャップチューブ</td><td>Thermo Scientific</td><td>362694</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Invitrogen</td><td>18047019</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5401119001</td>は<td>、-20 °Cで分注して保存する必要があります。Cは、凍結融解の繰り返しを避けるための</td></tr><tr><td>100&micro;M MACS スマートストレーナー&nbsp;</td><td>Miltenyi</td><td>130-098-463</td>は<td>15mlチューブと互換性があり、</td></tr><tr><td>100 & microが推奨されます。mセルストレーナー&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>352360</td>は<td>50mlチューブと互換性があり、MACSスマートストレーナーが利用できない場合</td></tr><tr><td>96ウェルプレート</td><td>Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>Fcブロック</td><td>BD Pharmingen</td><td>553142</td><td>抗CD16/CD32</td></tr><tr><td>抗マウスCD45抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>561487</td><td>多くの異なる蛍光標識オプションが利用可能です</td></tr><tr><td>5mlチューブ フィルターキャップ付きポリスチレン</td><td>ファルコン</td><td></td><td></td>352235</tr><tr><td>インスリン用シリンジ</td><td>テルモ</td><td>BS05M2913</td><td></td></tr><tr><td>ハンドヘルドホモジナイザー</td><td>Qiagen</td><td>9001272</td><td>TissueRuptor</td></tr><tr><td>フローサイトメーター</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>Fortessa SORP&nbsp;</td></tr><tr><td>フローサイトメトリーソフト</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>Diva</td></tr></tbody></table>

小動物モデルにおける尿路感染症: 雌雄マウスの尿道カテーテル

Urinary Tract Infection in a Small Animal Model: Transurethral Catheterization of Male and Female Mice

尿路感染症 (UTI)、非常に一般的な世界、重大な合併症と医療関連費用を負うことです。正確に病気の確立との進行を反映して、小型の動物モデルは、宿主-病原体相互作用の郭清と感染症への免疫の生成を許可します。マウスで尿路エシェリヒア属大腸菌、コミュニティの 85% 以上の原因となるエージェントの膀胱内注入は尿路感染症を取得し、感染人間観察の段階の多くを繰り返します。最近まで、ただし、UTI がメスでモデル化されるだけでした。この制限は、癌のような他の膀胱疾患として尿路感染症、セックスに関連した差異の研究を阻害しています。ここでは、女性と男性の動物間の直接比較を可能にする男性マウスを植え付けるし、フローサイトメトリーによる感染に対する宿主の反応をよりよく理解するための手段として膀胱組織を評価するために詳細なプロトコルを提供する方法をについて説明します。一緒に、これらのアプローチは、尿路感染症や膀胱疾患にみられるセックス バイアスに貢献する宿主因子の同定に役立ちます。

このプロトコルの開発、女性と男性の c57bl/6 マウスのコホートは 6 ~ 8 週間 1 時間から 30 日までの時点で膀胱の評価、植え付けや細菌の負担をされた高齢者。これらの研究からの結果は、他の場所で詳細な (Zychlinsky · シャーフら、保留中)。24 時間感染から代表的なデータを紹介します。特に、細菌負荷は感染後 24 時間 (図 1) でオスとメスのマウスとの間に相当します。細菌負荷の小さな変化認められた各グループ 24 hr 後感染雌マウス15,16に報告されているものに似ています。
感染前に尿の膀胱を十分に空に注意は、雌マウスに接種の重要な漏れはめったに観察されます。しかし、雄マウスに注入は、このプロトコルの開発段階で特に漏れ、尿道から菌が大量につながった。菌...

マウスの尿道カテーテル法の確立されたモデルなど尿路感染症、膀胱の病理の研究をできますが、女性でのみ実行することができます。今回紹介した男性の尿道注入の新しいモデルは、男女間の厳密な臨床的および疫学的違いでマークされたエリアの研究を有効になります。

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, ...

この実験的アプローチの全体的な目標は、尿路感染症に対する免疫応答を調査し、雄と雌の動物間の直接比較を防ぐことです。この方法は、男性と女性が尿路感染症にどのように反応するかに関連する粘膜免疫学の重要な質問に答えるのに役立ちます。主な利点は、感染が自然の根を介して確立されることです。私たちは最初に、雄マウスの膀胱の取り付けが不可能であると述べられている頻度に注目した後、この方法のアイデアを持っていました。この方法は尿路感染症についての洞察を提供しますが、膀胱がんなどの他の疾患研究にも適用できます。まず、感染するマウスの各グループに対して、小児用静脈内アクセスカニューレを1つ準備します。内蔵のスプリングメカニズムを使用して、製造元の指示に従って各カニューレの針を離します。針を廃棄し、プラスチック製の静脈カニューレのみを保存します。層流フード内のカテーテルを約25〜30分のUVサイクルで滅菌します。尿路病原性大腸菌、またはUPECの一晩培養を行った後、テキストプロトコルに従って、17, 000回gの卓上微量遠心分離機で細菌懸濁液を1分間回転させ、得られた細菌ペレットをPBSの1ミリリットルあたり8番目のCFUに10倍の2倍で再懸濁します。懸濁液のアリコートを連続希釈し、必要に応じて抗生物質でLB寒天上にプレートし、各感染の正確な接種物を決定します。細菌の接種物を1ミリリットルの注射器に引き込み、注射器の端にカテーテルを取り付けます。シリンジを軽くたたいて空気を取り除き、注入を開始する前にプランジャーを押し下げてカテーテルのデッドエアスペースを埋めます。承認されたプロトコルに従って雌マウスに麻酔をかけた後、動物を仰臥位に置き、下腹部に中程度の圧力を加えて膀胱の尿を空にします。満杯の膀胱は、腸骨稜の間の皮膚の下でエンドウ豆のように感じます。膀胱が空のら、利き手ではない方の手を使って、親指を尾に置き、同じ手の指をマウスの腹部に置き、反対方向に穏やかな圧力を加えてマウスをしっかりと固定します。次に、カテーテルの先端をマウスに対して垂直に尿道開口部に置き、次に穏やかな圧力で、ハブが尿道開口部に接するまでカテーテルを尿道にスライドさせ、同時にシリンジを下げて作業面と平行になるようにします。カテーテルが所定の位置に配置されたら、マウスの腹部にある利き手ではない手の指を使用して、腹部の皮膚をマウスの頭に向かって非常に優しく引っ張ります。尿道口は動かないことに注意してください。ただし、カテーテルが膣内にある場合、組織は上に移動してカテーテルから離れます。カテーテルのハブを尿道開口部に当てて、15マイクロリットルの細菌接種物をゆっくりと分注します。設置速度が遅いと、腎臓への膀胱尿管逆流が最小限に抑えられます。漏れを防ぐために、カテーテルをゆっくりと取り外します。次に、動物を仰臥位にしてケージに入れます。オスのマウスに接種するには、2つの親指鉗子をマウスの外性器の頭蓋と尾側に配置します。.包皮を引っ込めて、腺の陰茎を完全に露出させます。次に、陰茎が外部に配置されたら、親指鉗子を放します。鉗子の位置を変えて、突き出た陰茎を動物に対して垂直に安定させ、臓器を優しく、しかしぴんと張って保持します。次に、尿道口の先端にある小さな開口部から、カテーテルを慎重に導入し、鉗子を使用して陰茎に優しく導き、緊張を穏やかに保ちます。カテーテルのハブが陰茎の先端に接触したら、陰茎の位置を維持しながら、50マイクロリットルの接種材料を非常にゆっくりと分注します。ここに示されているような所定の点滴品質スコアに従って、点滴の品質に注意してください。接種物の漏れを防ぐために、カテーテルを5秒かけてゆっくりと引っ込めます。マウスを仰臥位にしてケージに入れます。動物は麻酔薬の投与後30〜45分で回復し始めるはずです。承認されたプロトコルに従ってマウスを犠牲にした後、70%エピナールを使用して腹部を完全に湿らせ、毛皮による汚染を最小限に抑えます。はさみを使用して、マウスの腹部の下3分の1を横切って2センチメートルの切開を行い、膀胱と他の任意の所望の臓器を無菌的に除去します。臓器を1ミリリットルの滅菌PBSを含む5ミリリットルのポリプロピレンスナップキャップチューブに移し、すべてのサンプルを氷上に保ちます。ハンドヘルドホモジナイザーを使用して、固形組織がほとんどなくなるまで臓器を均質化します。均質化がうまくいかない光沢のあるベージュホワイトの脂肪組織は捨ててください。次に、Epinalを使用し、続いてPBSを使用して、各実験グループまたは臓器グループ間でホモジナイザーを洗浄します。均質化臓器懸濁液の段階希釈液を調製した後、LB寒天プレート上でプレート希釈し、必要に応じて抗生物質を添加し、摂氏37度で一晩インキュベートします。膀胱組織でフローサイトメトリーを行うには、このビデオで前述したように膀胱を単離した後、ハサミを使用して組織をよくミンチにします。消化バッファーを含むチューブごとに1つのみじん切り膀胱を追加します。.次に、チューブを振って、消化バッファーでミンチ組織を洗い、すべての膀胱が解剖されてミンチになるまで氷の上に保ちます。みじん切りにした膀胱を摂氏37度で60〜75分間インキュベートし、手で5秒間、15分ごとに激しく振る。ティッシュが濡れたティッシュペーパーに似たガラスのような透明な外観になったら、消化が完了します。2〜3ミリリットルの氷冷フローサイトメトリーバッファーを加えて消化酵素を不活性化し、穏やかに混合します。次に、チューブを氷の上に置きます。単一細胞懸濁液を確保し、結合組織を除去するには、チューブの内容物を15ミリリットルの円錐管に配置された100マイクロメートルのフィルターに通します。次に、シリンジプランジャーの端で、残っている組織をフィルターにそっと押し込みます。さらに2ミリリットルのフローサイトメトリーバッファーでフィルターを洗浄し、サンプルを氷上に保ちます。サンプルを200倍g、摂氏4度で7分間遠心分離して洗浄します。ペレットをFcブロックを含む100マイクロリットルのフローサイトメトリー緩衝液に再懸濁し、1ミリリットルあたり5マイクログラムに希釈し、96ウェル丸底プレートに移します。10〜15分後、各サンプルに目的の抗体カクテルを100マイクロリットル加えます。次に、光から保護された氷上でサンプルを30〜45分間インキュベートします。サンプルを200倍g、摂氏4度で7分間遠心分離して洗浄します。最後に、細胞ペレットを200マイクロリットルのフローサイトメトリーバッファーに再懸濁し、サンプルを5ミリリットルのポリスチレンチューブ上の40マイクロメートルのセルストレーナーに通し、フローサイトメーターで取得します。この図は、24時間感染したマウスの代表的なデータを示しています。細菌負荷は、感染後24時間で雄マウスと雌マウスの間で同等でした。感染時の接種物の喪失が感染の確立に影響を与えたかどうかを判断するために、各点眼は1から5のスケールで採点され、1つが最も最適です。細菌のコロニー形成は、感染の24時間後に決定されました。ノンパラメトリックなKruskal-Wallis検定によって評価された点滴スコアが異なる動物から得られたCFUの間に統計的に有意な差は見つかりませんでした、各列の平均ランクを他のすべての列の平均ランクと比較し、ダンの検定を使用して多重比較を補正しました。最適でない点滴は、感染中に細菌の接種物の大幅な漏出をもたらし、24時間での細菌のコロニー形成に大きな影響を与えないと結論付けることができます。重要なのは、最適でない点滴の頻度は練習とともに減少することです。最後に、ナイーブ動物に存在するCD45陽性免疫細胞の数は、雌マウスと雄マウスで差はなかったが、感染した雌マウスの膀胱への浸潤は統計的に有意に増加した。カテーテル挿入を試みるときは、ゆっくりとした穏やかな動きを使用することが重要です。その開発により、この技術は、オスとメスの動物の膀胱における免疫の性別に基づく違いを調査するのに役立ちました。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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マウス尿路感染症の経尿道的誘導

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生物発光を用いたマウスモデルにおける尿路感染症の可視化

出典: Conover, M. S. ら, J. マウスモデルにおける尿路感染症およびCAUTIの確立と特徴付け。 J. Vis. Exp.

マウスモデルにおけるカテーテル関連尿路感染症

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学ぶ尿路感染症の免疫応答をマウスで調べる新しい雌雄比較モデル。自然経路で感染を確立し、膀胱がん研究にも応用可能な手法で、性別差の理解に貢献します。

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