小動物モデルにおける尿路感染症: 雌雄マウスの尿道カテーテル

この実験的アプローチの全体的な目標は、尿路感染症に対する免疫応答を調査し、雄と雌の動物間の直接比較を防ぐことです。この方法は、男性と女性が尿路感染症にどのように反応するかに関連する粘膜免疫学の重要な質問に答えるのに役立ちます。主な利点は、感染が自然の根を介して確立されることです。

私たちは最初に、雄マウスの膀胱の取り付けが不可能であると述べられている頻度に注目した後、この方法のアイデアを持っていました。この方法は尿路感染症についての洞察を提供しますが、膀胱がんなどの他の疾患研究にも適用できます。まず、感染するマウスの各グループに対して、小児用静脈内アクセスカニューレを1つ準備します。

内蔵のスプリングメカニズムを使用して、製造元の指示に従って各カニューレの針を離します。針を廃棄し、プラスチック製の静脈カニューレのみを保存します。層流フード内のカテーテルを約25〜30分のUVサイクルで滅菌します。

尿路病原性大腸菌、またはUPECの一晩培養を行った後、テキストプロトコルに従って、17, 000回gの卓上微量遠心分離機で細菌懸濁液を1分間回転させ、得られた細菌ペレットをPBSの1ミリリットルあたり8番目のCFUに10倍の2倍で再懸濁します。懸濁液のアリコートを連続希釈し、必要に応じて抗生物質でLB寒天上にプレートし、各感染の正確な接種物を決定します。細菌の接種物を1ミリリットルの注射器に引き込み、注射器の端にカテーテルを取り付けます。

シリンジを軽くたたいて空気を取り除き、注入を開始する前にプランジャーを押し下げてカテーテルのデッドエアスペースを埋めます。承認されたプロトコルに従って雌マウスに麻酔をかけた後、動物を仰臥位に置き、下腹部に中程度の圧力を加えて膀胱の尿を空にします。満杯の膀胱は、腸骨稜の間の皮膚の下でエンドウ豆のように感じます。

膀胱が空のら、利き手ではない方の手を使って、親指を尾に置き、同じ手の指をマウスの腹部に置き、反対方向に穏やかな圧力を加えてマウスをしっかりと固定します。次に、カテーテルの先端をマウスに対して垂直に尿道開口部に置き、次に穏やかな圧力で、ハブが尿道開口部に接するまでカテーテルを尿道にスライドさせ、同時にシリンジを下げて作業面と平行になるようにします。カテーテルが所定の位置に配置されたら、マウスの腹部にある利き手ではない手の指を使用して、腹部の皮膚をマウスの頭に向かって非常に優しく引っ張ります。

尿道口は動かないことに注意してください。ただし、カテーテルが膣内にある場合、組織は上に移動してカテーテルから離れます。カテーテルのハブを尿道開口部に当てて、15マイクロリットルの細菌接種物をゆっくりと分注します。

設置速度が遅いと、腎臓への膀胱尿管逆流が最小限に抑えられます。漏れを防ぐために、カテーテルをゆっくりと取り外します。次に、動物を仰臥位にしてケージに入れます。

オスのマウスに接種するには、2つの親指鉗子をマウスの外性器の頭蓋と尾側に配置します。.包皮を引っ込めて、腺の陰茎を完全に露出させます。次に、陰茎が外部に配置されたら、親指鉗子を放します。

鉗子の位置を変えて、突き出た陰茎を動物に対して垂直に安定させ、臓器を優しく、しかしぴんと張って保持します。次に、尿道口の先端にある小さな開口部から、カテーテルを慎重に導入し、鉗子を使用して陰茎に優しく導き、緊張を穏やかに保ちます。カテーテルのハブが陰茎の先端に接触したら、陰茎の位置を維持しながら、50マイクロリットルの接種材料を非常にゆっくりと分注します。

ここに示されているような所定の点滴品質スコアに従って、点滴の品質に注意してください。接種物の漏れを防ぐために、カテーテルを5秒かけてゆっくりと引っ込めます。マウスを仰臥位にしてケージに入れます。

動物は麻酔薬の投与後30〜45分で回復し始めるはずです。承認されたプロトコルに従ってマウスを犠牲にした後、70%エピナールを使用して腹部を完全に湿らせ、毛皮による汚染を最小限に抑えます。はさみを使用して、マウスの腹部の下3分の1を横切って2センチメートルの切開を行い、膀胱と他の任意の所望の臓器を無菌的に除去します。

臓器を1ミリリットルの滅菌PBSを含む5ミリリットルのポリプロピレンスナップキャップチューブに移し、すべてのサンプルを氷上に保ちます。ハンドヘルドホモジナイザーを使用して、固形組織がほとんどなくなるまで臓器を均質化します。均質化がうまくいかない光沢のあるベージュホワイトの脂肪組織は捨ててください。

次に、Epinalを使用し、続いてPBSを使用して、各実験グループまたは臓器グループ間でホモジナイザーを洗浄します。均質化臓器懸濁液の段階希釈液を調製した後、LB寒天プレート上でプレート希釈し、必要に応じて抗生物質を添加し、摂氏37度で一晩インキュベートします。膀胱組織でフローサイトメトリーを行うには、このビデオで前述したように膀胱を単離した後、ハサミを使用して組織をよくミンチにします。

消化バッファーを含むチューブごとに1つのみじん切り膀胱を追加します。.次に、チューブを振って、消化バッファーでミンチ組織を洗い、すべての膀胱が解剖されてミンチになるまで氷の上に保ちます。みじん切りにした膀胱を摂氏37度で60〜75分間インキュベートし、手で5秒間、15分ごとに激しく振る

ティッシュが濡れたティッシュペーパーに似たガラスのような透明な外観になったら、消化が完了します。2〜3ミリリットルの氷冷フローサイトメトリーバッファーを加えて消化酵素を不活性化し、穏やかに混合します。次に、チューブを氷の上に置きます。

単一細胞懸濁液を確保し、結合組織を除去するには、チューブの内容物を15ミリリットルの円錐管に配置された100マイクロメートルのフィルターに通します。次に、シリンジプランジャーの端で、残っている組織をフィルターにそっと押し込みます。さらに2ミリリットルのフローサイトメトリーバッファーでフィルターを洗浄し、サンプルを氷上に保ちます。

サンプルを200倍g、摂氏4度で7分間遠心分離して洗浄します。ペレットをFcブロックを含む100マイクロリットルのフローサイトメトリー緩衝液に再懸濁し、1ミリリットルあたり5マイクログラムに希釈し、96ウェル丸底プレートに移します。10〜15分後、各サンプルに目的の抗体カクテルを100マイクロリットル加えます。

次に、光から保護された氷上でサンプルを30〜45分間インキュベートします。サンプルを200倍g、摂氏4度で7分間遠心分離して洗浄します。最後に、細胞ペレットを200マイクロリットルのフローサイトメトリーバッファーに再懸濁し、サンプルを5ミリリットルのポリスチレンチューブ上の40マイクロメートルのセルストレーナーに通し、フローサイトメーターで取得します。

この図は、24時間感染したマウスの代表的なデータを示しています。細菌負荷は、感染後24時間で雄マウスと雌マウスの間で同等でした。感染時の接種物の喪失が感染の確立に影響を与えたかどうかを判断するために、各点眼は1から5のスケールで採点され、1つが最も最適です。

細菌のコロニー形成は、感染の24時間後に決定されました。ノンパラメトリックなKruskal-Wallis検定によって評価された点滴スコアが異なる動物から得られたCFUの間に統計的に有意な差は見つかりませんでした、各列の平均ランクを他のすべての列の平均ランクと比較し、ダンの検定を使用して多重比較を補正しました。最適でない点滴は、感染中に細菌の接種物の大幅な漏出をもたらし、24時間での細菌のコロニー形成に大きな影響を与えないと結論付けることができます。

重要なのは、最適でない点滴の頻度は練習とともに減少することです。最後に、ナイーブ動物に存在するCD45陽性免疫細胞の数は、雌マウスと雄マウスで差はなかったが、感染した雌マウスの膀胱への浸潤は統計的に有意に増加した。カテーテル挿入を試みるときは、ゆっくりとした穏やかな動きを使用することが重要です。

その開発により、この技術は、オスとメスの動物の膀胱における免疫の性別に基づく違いを調査するのに役立ちました。