マウス屈筋腱損傷および修復手術
2016年9月19日
手に屈筋腱は、一般的に損なわれた手の機能につながる、負傷しています。しかし、瘢痕組織の治癒反応は十分に特徴付けされていません。屈筋腱の治癒のマウスモデルは、ここに示されています。このモデルは、治癒過程の全体的な理解を高め、治癒を改善するための治療法を評価することができます。
この外科的処置の全体的な目標は、屈筋腱治癒中の瘢痕および癒着形成の細胞および分子プロセスの理解を深めることです。この方法は、どの細胞タイプが瘢痕の形成と修復に寄与するかなど、屈筋腱の治癒プロセスに関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、トランスジェニックマウスとノックアウトマウスを使用して治癒過程をよりよく理解できることです。
この技術は、瘢痕化の原因となるこれらの設計が不十分な細胞集団の調査を容易にするため、屈筋腱治癒の結果を改善するための潜在的な生物学的標的を特定する可能性があります。つま先をつまんでも反応がないことを確認した後、動物の目に眼軟膏を塗り、後肢全体の毛をクリップします。手術部位をシーケンシャルなポベドンヨウ素と70%エタノールスクラブで滅菌し、ふくらはぎの内側面に長指屈筋またはFDL腱を配置します。
次に、皮膚を0.5〜1センチ切開して腱を露出させます。鉗子を使用してFDL腱を周囲の組織から分離し、腱を縮瞳接合部まで追跡します。スプリングハサミを使用して、後脛骨動脈を避けながら、接合部で腱を緩めます。
次に、5-0ナイロン縫合糸で皮膚を閉じます。次に、マウスを実体顕微鏡下に移し、スプリングマイクロハサミを使用して、後足の後外側に3ミリメートルの切開を行います。鉗子を使用して、周囲の軟部組織と筋肉を静かに引っ込め、組織の損傷を最小限に抑え、FDL腱を特定します。
次に、腱をゆっくりと持ち上げ、マイクロハサミを使用して組織を完全に横断します。修正されたケスラーパターンの8.0縫合糸を使用して、FDL腱の端を結紮します。必要に応じて、手順全体を通して生理食塩水で腱を定期的に水分補給します。
端が縫合されたら、軟部組織と筋肉を腱の上に戻し、5.0ナイロン縫合糸を使用して切開部を閉じます。次に、マウスを摂氏37度のスライドウォーマーに置き、完全に回復するまで監視します。実験終了点の24時間前に、マウスに100マイクロリットルのEDUを注入します。
翌日、先ほど示したように修復された腱を特定し、切除された組織を採取します。治癒腱の周囲の顆粒組織を分離することは、最終的なアミノサイト化学分析を可能にするための重要なステップです。また、末梢組織への混入を最小限に抑えるように注意する必要があります。
1ミリリットルのコラゲナーゼが入ったシャーレに腱を入れます。次に、メスで組織をミンチにし、続いて18ゲージの針を数回通過させてフラグメントをトリチュレーションします。スラリーを1.5ミリリットルの遠心チューブに移し、腱片を振とうしながら1時間、摂氏37度で消化します。
消化の終わりに、組織懸濁液を遠心分離し、ペレットをPBS中の3パーセントBSAの500マイクロリットルに再懸濁します。次に、70ミクロンのストレーナーで細胞をろ過し、未消化の腱の破片と大きな破片を取り除きます。そして、細胞を摂氏37度のインキュベーターに入れます。
未消化の腱片を、1ミリリットルの新鮮なコラゲナーゼが入った新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移し、パイプの見出しでピースを混合します。振とうしながらさらに1時間の消化後、組織片を再度スピンダウンし、ペレットを500マイクロリットルのBSA添加PBSに再懸濁します。次に、新しい70ミクロンの細胞ストレーナーを介して懸濁液をろ過し、最初の消化後に収集された細胞のチューブに入れます。
細胞をカウントし、遠心分離によりスピンダウンします。次いで、BSA濃度を添加したPBSの100マイクロリットル当たり10〜4番目の細胞の3〜6倍でペレットを再懸濁する。免疫細胞化学によってEDUの取り込みを検出するには、まず疎水性バリアペンを使用してスライド上の細胞を円で囲み、すぐにサンプルを室温で150マイクロリットルの3%パラホルムアルデヒドとPBSで固定します。
15分後、150マイクロリットルのBSA添加PBSで5分間の洗浄を2回行い、細胞をすすぎます。次に、0.5%トリトン×100のPBS溶液でサンプルを20分間透過させます。今示したように洗浄した後、調製したばかりのEDU反応カクテル150マイクロリットルを細胞に加え、室温で30分間インキュベートします。
次に、細胞を再度洗浄し、150マイクロリットルのHoechstでサンプルを対比染色します。室温で30分後、色あせ防止封入剤を1〜2滴細胞に加え、気泡を避けながら各サンプルをカバースリップで慎重に覆います。封入剤を室温の暗闇で一晩硬化させます。
次に、カバースリップを透明なマニキュアで密封します。最後に、40倍の倍率を使用して蛍光顕微鏡でスライドを画像化します。修復が成功すると、肉芽組織は損傷していない腱と比較して細胞性が大幅に向上します。
この画像では、屈筋腱の断裂修復の組織学的例が示されています。EDU標識は、生命マウスのEDUパルス後24時間の間に活発に増殖する細胞のみを強調します。治癒腱の肉芽組織内の増殖の定量的評価を容易にします。
このビデオを見た後、マウスで屈筋腱の損傷と修復手術を行う方法をよく理解し、治癒中に屈筋腱の瘢痕形成に寄与する細胞集団をよりよく理解する必要があります。
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概要
本研究では、損傷しやすく機能障害につながりやすい手指の屈筋腱の治癒過程を調査するためのマウスモデルを提示します。このモデルは、瘢痕組織形成の理解を深め、潜在的な治療アプローチを評価することを目的としています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 再生医療
- 細胞生物学
背景
- 屈筋腱損傷は一般的であり、手の機能に深刻な影響を及ぼす可能性があります。
- 瘢痕組織が関与する治癒反応については、十分に解明されていません。
- トランスジェニックマウスおよびノックアウトマウスを用いることで、治癒における細胞の寄与に関する知見が得られます。
- これらのプロセスを理解することは、治療戦略の向上につながる可能性があります。
研究目的
- 屈筋腱の治癒過程における細胞および分子レベルのプロセスの理解を深める。
- 瘢痕形成および修復に関与する細胞種を特定する。
- 治癒成績を向上させるための生物学的標的を探索する。
使用した方法
- 屈指腱治癒におけるマウスモデルの使用。
- 治癒プロセスを研究するための外科的手法の適用。
- さまざまな実験的アプローチによる細胞応答の評価。
- 治癒ダイナミクスを理解するためのトランスジェニックマウスおよびノックアウトマウスの検討。
主要な結果
- 瘢痕形成に寄与する主要な細胞集団の特定。
- 腱治癒の根底にある分子メカニズムに関する知見。
- 治癒結果を向上させるための潜在的な治療標的。
- 腱修復の研究におけるマウスモデルの有効性の実証。
結論
- マウスモデルは、屈筋腱の治癒を研究するための有用なツールです。
- 細胞の寄与を理解することは、治療戦略に役立ちます。
- 今後の研究では、治癒を改善するために特定の細胞種を標的とすることに重点が置かれる可能性があります。
よくある質問
産業界における重要性
マウスの屈筋腱損傷および修復手術は、腱の治癒と瘢痕形成の根底にある細胞的および分子的なメカニズムを解析するための強固な前臨床モデルを提供します。このモデルにより、腱の修復結果を改善することを目的とした治療戦略において、信頼性の高いターゲットバリデーションおよびメカニズム的なリスク低減が可能になります。その有用性は、初期の創薬からトランスレーショナルリサーチまで多岐にわたり、筋骨格系および再生医療パイプラインにおけるポートフォリオ決定を支援します。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的活用
初期探索およびターゲット検証
- 腱の瘢痕形成および修復に寄与する細胞集団の解析が可能になります。
- 腱治癒における遺伝子の機能獲得または喪失の機能的検証をサポートします。
- 治療介入のための生物学的標的の同定を促進します。
- 組織修復における候補標的のメカニズム的なリスク低減を実現します。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 定量的な細胞およびタンパク質解析のためのバリデート済み生物学的サンプルを生成します。
- 腱生物学における免疫蛍光染色およびサイトメトリーアッセイの標準化をサポートします。
- 制御されたモデルにおける薬理学的介入の再現性のある評価を可能にします。
- ダウンストリームのスクリーニングワークフローに適した組織および細胞出力を調製します。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 腱治癒不全および線維化に関する疾患関連モデルと整合している。
- メカニズムの解明から前臨床有効性試験までの一貫した流れを可能にする。
- リスク調整に基づいた再生医療および抗線維化候補物質の開発促進を支援する。
- トランスレーショナルなバイオマーカー開発のための定量的エンドポイントを提供する。
パイプラインおよびワークフローの統合
このモデルは、筋骨格系研究パイプラインにおける初期探索からリード化合物の同定、そして前臨床検証までを統合するものです。
- 探索生物学：腱の修復および瘢痕化に寄与する細胞に関する仮説検証を支援します。
- スクリーニング：アッセイ開発のための再現性があり定量的な細胞およびタンパク質のリードアウトを提供します。
- 分析：実験条件間における細胞増殖およびマーカー発現の統計的比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：メカニズムの知見を、疾患関連システムにおける前臨床候補の評価へと繋げます。
- 企業での再利用：標的およびパスウェイの反復的な検証のための、標準化された再利用可能なプラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 標的選択における予測信頼度を向上させ、腱治癒のメカニズムに関する理解を深める。
- 運用的価値： 再現性のある組織および細胞解析のための、標準化された拡張可能なプロトコルを提供する。
- 戦略的価値： 初期段階のプログラムにおける生物学的曖昧さを低減し、Go/No-Go判断を改善する。
- ポートフォリオへの影響： 再生医療および抗線維化治療候補薬の、リスク調整済み優先順位付けを可能にする。
実施上の留意点
- マウスの微小外科手術および組織ハンドリングの専門知識が必要です。
- 蛍光顕微鏡およびサイトメトリー解析インフラへのアクセスが必要です。
- サンプル調製および定量解析におけるチーム間の標準化が求められます。
- 滑膜鞘が関与する腱モデルでは、適応が必要な場合があります。
- 肉芽組織からの細胞分離は技術的に困難な場合があり、スループットが制限される可能性があります。
