マウス屈筋腱損傷および修復手術

この外科的処置の全体的な目標は、屈筋腱治癒中の瘢痕および癒着形成の細胞および分子プロセスの理解を深めることです。この方法は、どの細胞タイプが瘢痕の形成と修復に寄与するかなど、屈筋腱の治癒プロセスに関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、トランスジェニックマウスとノックアウトマウスを使用して治癒過程をよりよく理解できることです。

この技術は、瘢痕化の原因となるこれらの設計が不十分な細胞集団の調査を容易にするため、屈筋腱治癒の結果を改善するための潜在的な生物学的標的を特定する可能性があります。つま先をつまんでも反応がないことを確認した後、動物の目に眼軟膏を塗り、後肢全体の毛をクリップします。手術部位をシーケンシャルなポベドンヨウ素と70%エタノールスクラブで滅菌し、ふくらはぎの内側面に長指屈筋またはFDL腱を配置します。

次に、皮膚を0.5〜1センチ切開して腱を露出させます。鉗子を使用してFDL腱を周囲の組織から分離し、腱を縮瞳接合部まで追跡します。スプリングハサミを使用して、後脛骨動脈を避けながら、接合部で腱を緩めます。

次に、5-0ナイロン縫合糸で皮膚を閉じます。次に、マウスを実体顕微鏡下に移し、スプリングマイクロハサミを使用して、後足の後外側に3ミリメートルの切開を行います。鉗子を使用して、周囲の軟部組織と筋肉を静かに引っ込め、組織の損傷を最小限に抑え、FDL腱を特定します。

次に、腱をゆっくりと持ち上げ、マイクロハサミを使用して組織を完全に横断します。修正されたケスラーパターンの8.0縫合糸を使用して、FDL腱の端を結紮します。必要に応じて、手順全体を通して生理食塩水で腱を定期的に水分補給します。

端が縫合されたら、軟部組織と筋肉を腱の上に戻し、5.0ナイロン縫合糸を使用して切開部を閉じます。次に、マウスを摂氏37度のスライドウォーマーに置き、完全に回復するまで監視します。実験終了点の24時間前に、マウスに100マイクロリットルのEDUを注入します。

翌日、先ほど示したように修復された腱を特定し、切除された組織を採取します。治癒腱の周囲の顆粒組織を分離することは、最終的なアミノサイト化学分析を可能にするための重要なステップです。また、末梢組織への混入を最小限に抑えるように注意する必要があります。

1ミリリットルのコラゲナーゼが入ったシャーレに腱を入れます。次に、メスで組織をミンチにし、続いて18ゲージの針を数回通過させてフラグメントをトリチュレーションします。スラリーを1.5ミリリットルの遠心チューブに移し、腱片を振とうしながら1時間、摂氏37度で消化します。

消化の終わりに、組織懸濁液を遠心分離し、ペレットをPBS中の3パーセントBSAの500マイクロリットルに再懸濁します。次に、70ミクロンのストレーナーで細胞をろ過し、未消化の腱の破片と大きな破片を取り除きます。そして、細胞を摂氏37度のインキュベーターに入れます。

未消化の腱片を、1ミリリットルの新鮮なコラゲナーゼが入った新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移し、パイプの見出しでピースを混合します。振とうしながらさらに1時間の消化後、組織片を再度スピンダウンし、ペレットを500マイクロリットルのBSA添加PBSに再懸濁します。次に、新しい70ミクロンの細胞ストレーナーを介して懸濁液をろ過し、最初の消化後に収集された細胞のチューブに入れます。

細胞をカウントし、遠心分離によりスピンダウンします。次いで、BSA濃度を添加したPBSの100マイクロリットル当たり10〜4番目の細胞の3〜6倍でペレットを再懸濁する。免疫細胞化学によってEDUの取り込みを検出するには、まず疎水性バリアペンを使用してスライド上の細胞を円で囲み、すぐにサンプルを室温で150マイクロリットルの3%パラホルムアルデヒドとPBSで固定します。

15分後、150マイクロリットルのBSA添加PBSで5分間の洗浄を2回行い、細胞をすすぎます。次に、0.5%トリトン×100のPBS溶液でサンプルを20分間透過させます。今示したように洗浄した後、調製したばかりのEDU反応カクテル150マイクロリットルを細胞に加え、室温で30分間インキュベートします。

次に、細胞を再度洗浄し、150マイクロリットルのHoechstでサンプルを対比染色します。室温で30分後、色あせ防止封入剤を1〜2滴細胞に加え、気泡を避けながら各サンプルをカバースリップで慎重に覆います。封入剤を室温の暗闇で一晩硬化させます。

次に、カバースリップを透明なマニキュアで密封します。最後に、40倍の倍率を使用して蛍光顕微鏡でスライドを画像化します。修復が成功すると、肉芽組織は損傷していない腱と比較して細胞性が大幅に向上します。

この画像では、屈筋腱の断裂修復の組織学的例が示されています。EDU標識は、生命マウスのEDUパルス後24時間の間に活発に増殖する細胞のみを強調します。治癒腱の肉芽組織内の増殖の定量的評価を容易にします。

このビデオを見た後、マウスで屈筋腱の損傷と修復手術を行う方法をよく理解し、治癒中に屈筋腱の瘢痕形成に寄与する細胞集団をよりよく理解する必要があります。