繰延成長阻害アッセイは、競争上の細菌由来の抗菌剤の効果を定量化するために

本プロトコルの全体的な目的は、ある細菌分離株が別の分離株に及ぼす競争の影響を、定量的および定性的な方法で検討することです。この手法は、細菌コミュニティ内における競争的排除に関する調査において、重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、細菌コミュニティ内で実際に起こっている現象を反映している点にあります。

侵入株が成功裏に侵入するためには、既定の分離株による抑制効果を生き延びることができなければなりません。本手順の実演は、病院生物学専攻の大学院生であるEmma Crankが行います。まず、製造元の指示に従って、ブレインハートインフュージョン（BHI）寒天培地を調製します。

滅菌するため、寒天を121 °C、15 psiで20分間オートクレーブします。滅菌したBHI寒天を15 mLずつ滅菌ペトリ皿に分注し、凝固させます。製造元の指示に従ってBHI液体培地を調製し、10 mLずつ28 mLガラス製ユニバーサルボトルに分注します。

その後、BHIブロスを20分間オートクレーブで滅菌します。気化ボトルを準備するには、まずボトルの分解から始めてください。気化器内部の汚染物質を除去するため、5%界面活性洗浄剤を気化器を通して噴霧します。

その後、気化器ボトル、蓋、および気化器を洗浄剤に一晩浸します。翌日、滅菌エアフローフードの下で気化器、蓋、およびボトルを乾燥させます。次に、70% ethanolでボトルを満たします。

その後、気化器を再装着し、エタノールを気化器から噴霧します。気化器に蓋をし、使用するまでエタノールを入れた状態で保存します。使用前に、滅菌済みBHIブイヨンを用いてボトルを無菌的に洗浄し、ブイヨンを気化器から噴霧してください。

細菌のオーバーナイト培養を調製するために、競合株および阻害株を滅菌済みBHI寒天プレートにストリークし、37 °Cで好気的に約18時間インキュベートします。28 mLユニバーサルボトルを用い、10 mLの滅菌済みBHIブイヨンに、必要な競合細菌株の単一コロニーを接種します。この培養液をユニバーサルオービタルシェーカーにて、37 °C、250 RPMで一晩インキュベートします。

翌日、接種した培養液がプレート上で広がってしまうのを防ぐため、アガープレートが完全に乾燥し、蓋に結露がないことを確認します。オーバーナイト培養液25 µLをアガープレートの中央にピペットで分注します。この際、培養液がアガー上に飛散する原因となる気泡の発生を防ぐため、ピペットのプランジャーを完全に押し切らないように注意してください。培養液の広がりを抑えるため、室温で乾燥させます。

その後、アガープレートを37°Cで好気的に一晩インキュベートします。一晩培養した後、吸収紙を敷いたセーフティーキャビネット（レベル2）内で、BHIブロスを用いて培養液を10倍に希釈し、1 mLあたり約4×10⁶ CFUになるようにします。次に、希釈した培養液を滅菌済みのプラスチック製香水アトマイザーボトルに注ぎます。

遅延増殖抑制試験を行うには、各噴霧ボトルを用いて培養液を噴霧し、アガーに噴霧する前に噴霧機構内に培養液が充填されていることを確認します。アガーから約15センチメートルの距離から、希釈した培養液約250 µLをアガー表面全体に噴霧します。プレートを37 °Cで好気的に一晩インキュベートします。

遅延増殖抑制を判定するために、噴霧した競合菌株の増殖抑制帯の直径をミリメートル単位で測定し、そこから抑制物質産生菌をスポットした中心部の直径を差し引きます。最後に、テキストプロトコルに従って、抑制帯の透明度スコアを記録します。この図に示すように、アッセイ結果は、中心にスポットした抑制物質産生菌の周囲にある、重ね塗りされた競合菌株の差異として観察されるはずです。

その差異は、完全な阻止、部分的な阻止、阻止なし、または正の相関である可能性があります。このグラフは、阻止物質を産生する分離株間の阻止円を比較したものであり、これは産生される抗菌物質の量、阻止物質の培地中への拡散能、産生される阻止物質の種類、または競合菌株の阻止物質に対する耐性レベルの結果である可能性があります。この例では、試験に用いる競合培養液が希釈されすぎている場合、阻止円が通常よりも大きく現れ、エッジの境界が不明瞭になることが示されています。

阻害剤産生菌のスポットが、一晩の培養前に完全に乾燥していなかった場合、阻害菌が広がり、明確なスポットが形成されません。また、競合菌が均一に散布されていないと、細菌の広がりにムラが生じることがあります。最後に、競合菌の濃度が高すぎると、阻害菌の上で増殖し、極端な場合には競合菌と阻害菌の役割が逆転する可能性があります。

この手法に習熟すれば、検査する分離株のペア1組あたり、4日間に分けて合計1時間を要します。この手順を実施する際は、アッセイ間で良好な再現性を得られるよう、均一に噴霧することが重要です。本手順に従うことで、抑制データと、コミュニティにおける細菌種の有無に関する分類学的データを重ね合わせて解析することが可能になります。

これにより、抑制効果が種が環境に定着する能力に影響を与えるかどうかを判断することが可能になります。この手法の開発により、コミュニティマイクロバイオーム分野の研究者は、競争的排除における抗菌ペプチド予測などの形質分散がコミュニティ構造に及ぼす影響を調査できるようになります。このビデオを視聴することで、ある細菌分離株が別の分離株の増殖を競争的に抑制する能力を、定性的および定量的な方法で比較する方法について十分な理解を得ることができます。

エアロゾル化した細菌の取り扱いは極めて危険であるため、本手順を実施する際は、レベル2安全キャビネット内での作業や適切なPPE（個人用保護具）の着用などの予防措置を常に講じてください。