Name: 繰延成長阻害アッセイは、競争上の細菌由来の抗菌剤の効果を定量化するために (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: 学ぶ繰延成長阻害アッセイを用いて細菌間の競争阻害を定量的・定性的に評価する方法。BHI寒天培地とスプレー法を使用し、阻害ゾーンを測定することで微生物群集の動態を解明できます。

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以下の方法は阻害剤産生株で競合他社の株をテストするために7,8を適合されています。 注：このプロトコルは、細菌培養でエアロゾル生成を含みます。これは、ローカルでのみ、承認された安全性を考慮の実装に含まれる空間で実行することができます。レベル2の安全キャビネット内で寒天プレート上に文化の噴霧は寒天プレートと周辺環境の汚染を最小限に抑えることができます。研究者は封じ込めレベル2の生物を使用している場合、これはまた、噴霧菌のエアロゾル吸入から研究者を保護する、これが主要な関心事です。適切な個人保護具を着用する必要があります。ペトリ皿の周囲に最良使い捨て吸収性組織で覆われています。 UV光を用いて、ポストスプレー除染をお勧めします。 1.寒天プレートの準備<ol><li>マヌーに応じて、ブレインハートインフュージョン（BHI）寒天を準備facturerの指示。 </li><li> 、121℃でBHI寒天培地をオートクレーブ20分間、15 psiの、またはオートクレーブ製造業者の推奨に従って、滅菌します。 </li><li>滅菌ペトリ皿に滅菌BHI寒天15mlのアリコートを注ぎ、それを設定することができます。 注：このアッセイ内で使用するすべての寒天プレートは、寒天の同じ株に由来し、寒天の同じ量を各プレートに存在することを確認してください。これは、利用可能な栄養素と比較を可能にするプレート間の阻害剤拡散の変動を制限します。 </li></ol> 2.無菌ブロスの準備します<ol><li>製造元の指示に従ったBHIブロスを準備します。 </li><li> 28ミリリットルのガラスユニバーサルボトルにBHIの10ミリリットルのアリコートを追加します。 </li><li> 、121℃でBHIブロスをオートクレーブ20分間、15 psiの、またはオートクレーブ製造業者の推奨に従って、滅菌します。 注：ブロスAUTの同じバッチに由来するアッセイで使用されているすべてのスープを確認してください結果の変動を引き起こす可能性の栄養素の変動を制限するために、同時にoclaved。 </li></ol> 3.準備滅菌気化ボトル（複数可） <ol><li> vapourizerボトルを解体。 </li><li>一晩5％の界面活性洗浄剤でvapourizerボトル、蓋とvapourizerを浸し、内部汚染物質を除去するためにvapourizerを通して5％の界面活性洗浄剤をスプレーします。 注：界面活性洗浄剤を取り扱う際には手袋と適切な個人保護具を使用する必要があります。 </li><li>無菌空気流フードの下で気化器、蓋と瓶を乾燥させます。 </li><li> 70％エタノールでボトルを記入し、vapourizerを再接続し、vapourizerを通してエタノールの一部をスプレー。 </li><li>気化器の蓋を入れて、使用するまで内部のエタノールで保管してください。 </li><li>使用直前に、無菌的に滅菌BHIブロスでボトルを洗浄し、vapourizerを通して培養液をスプレー。 注：これは、エタノールAFFを防止します6.3節でボトルに加え接種材料をecting。 </li></ol>細菌の一晩培養物（複数可）を準備4 <ol><li>無菌BHI寒天プレート上にストリーク競合他社と阻害剤の株を、約18時間（一晩）好気的に37℃でインキュベートします。 注：このプレートを4℃で保存した場合、同じ週間内の複数の複製のために使用することができる細菌のストックを生成します。 </li><li> 28ミリリットル万能ボトル内の必要な競争相手の細菌株の単一コロニーを滅菌BHIブロスの10ミリリットルを接種します。 </li><li>オービタルシェーカーで250 rpmで振とうして好気的に37℃で一晩ユニバーサルボトルをインキュベートします。 </li></ol>インヒビター産分離株の5スポット文化<ol><li>セクション4で説明したように一晩培養物（複数可）を準備します。 </li><li>寒天プレートは蓋の上結露しないと、完全に乾燥していることを確認し、接種前に（PLAをインキュベートすることにより、 例えば37℃で60分間）のためのTE;これは、接種部位から板全体に広がるの接種材料を防ぐことができます。 </li><li>寒天プレートの中央に一晩培養のピペットを25μl。完全に寒天を横切っ文化をスプレー気泡を防止するために、ピペットプランジャーを押し下げることは避けてください。 </li><li>文化は文化の広がりを制限するために、室温で乾燥することができます。好気的に37℃で一晩寒天プレートをインキュベートします。 </li></ol> 6.準備テスト他社株のスプレー接種物（複数可） <ol><li>約4×10 6 CFU ml -1の得るためにBHIブロス中で部4希釈で一晩培養10倍に説明したように一晩培養液を用意し、OD 600 0.3±0.05のサスペンション。 注：10倍希釈は、4×10 6 CFUミリリットルを与えることはありません-1すべての細菌種のために、1×10の間の連続希釈液をメッキ普及により、必要な希釈係数を計算します<s&gt; -1 -1×10 -6アップ。 </li><li>無菌のプラスチック製の香水の気化器ボトルに希釈した培養を注ぎます。 注：総容積は寒天プレートの数がスプレーされるために必要とされる以上でなければなりません。プレート当たり約250μlを直径9cmのシャーレに適しています。 </li></ol> 7.繰延成長阻害アッセイ<ol><li>文化は前寒天上に噴霧するスプレー機構にロードされていることを保証するために、気化器ボトルの各を通じて文化をスプレーしてください。 </li><li>寒天上記の15cm程度の距離から、全体の寒天表面上に希釈した培養の約250μlの（典型的な50ミリリットル気化器の3スプレー）をスプレー。好気的に37℃で一晩寒天プレートをインキュベートします。スプレーの同じ番号を持つ他のプレートについて、この手順を繰り返します。 </li></ol> 8.繰延成長阻害アッセイの結果の解釈<ol><li>噴霧competiの増殖阻害ゾーンを測定しますタ株（ 図1A - C、「X」「X」へ）（ - C、 &quot;Y&quot;に&quot;Y&quot; 図1A）阻害剤プロデューサーの中心スポットの直径を差し引いミリメートルで、。 メモ： 図1Eは、このデータを提示する方法を示してい</li><li>阻害ゾーンのための透明度スコアを記録します。 注：これは、観察された阻害の程度を示します。例は、 図1Aに示されている- D、標準化のために使用することができる株は、代表的な結果のセクションで提案されています。以下の規模は、明確化のスコアリングに使用することができます：0の透明度スコアは、競合他社株の成長の完全な阻害のゾーンを記述すること。 1のスコアがクリアのゾーンに存在する唯一の個々のコロニーで、成長のほぼ完全な阻害のゾーンを説明します。 2のスコアが減少し、成長の可視ゾーンを記述するために、このゾーン内の成長は詐欺です流暢またはコンフルエントに近いが、&gt; 50％の密度が縮小されています。 3のスコアは最小限の成長の減少を説明するために、増殖がコンフルエントと50％未満減少し、ゾーンが依然として可視で測定されます。成長の目に見える阻害を記載していないための4つのスコア。 5のスコアは、競合他社の株の増殖が試験阻害剤産生株の近くに増加したことを記述します。例については、 図1を参照してください。これらのスコアは、実験者に主観的です。 </li></ol> 9.レプリケート<ol><li>得られた結果の再現性を決定するために、生物学的三重に少なくともアッセイを繰り返します。 注：複製を別の日に行っている場合は、測定を行い、4℃で、その後、インキュベーションから取り出した直後のいずれかのストアプレートをプレートスコアまたはそれらを廃棄する前に、プレートの高品質の写真を撮ります。ストレージまたはプレートの写真は別の日の間の結果の比較が容易に可能になり、トン彼は日/実験全体で再現性の得点を確認するために特に重要です。プレートのストレージが結果を変える可能性を持っていることに注意してください。 注：明確な写真の場所プレートのために直立拡散光の領域でつや消し黒の背景にその蓋なしでは、レンズ（マクロモード）に近いオブジェクトに焦点を合わせることのできる高解像度カメラ（≥8MP）を使用します。また、白色光に設定し、トランスイルミネーターといくつかのゲルイメージャは、高品質、再現性の高い画像を生成することができます。 </li></ol>

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著者らは、開示することは何もありません。

他人からそれを区別し、この細菌種の競争プロトコルの重要なステップで、阻害剤の一晩のインキュベーションは、競合他社の単離物の添加前に隔離される。阻害剤の株は、阻害化合物を生成するために、この成長期間を必要とします。競合株を同一培地の上にオーバーレイされているように、この方法は完全な可能性を観察するための研究を可能にします 競合他社の株の増殖を妨害する阻害剤株の。その結果、このアッセイは、自然と何が起こるかを反映しています。 1分離株は完全にニッチに設立され、他方が正常にニッチに侵入することができるように、任意の阻害変数に対抗することができなければなりません。 誤って行うと、誤った結果を引き起こす可能性が最も高いこのプロトコルには2つの部分があります。まず、気化器ボトルの不完全な滅菌は、アッセイに細菌の混入導入することができます。 Incu滅菌容器に、ステップ3.6において気化ボトルを洗浄するために使用される培養液のbationを完全に滅菌したボトルを確認するために使用することができます。追加の殺菌が必要な場合などVirkonなどの消毒剤溶液中での追加の洗浄は、ステップ3.2で説明した界面活性洗浄剤で前洗浄に使用することができます。 誤った結果を引き起こす可能性がある第二段階は、競合他社株（ステップ6.1）の希釈です。希釈が最適でない場合には、阻害の明確な測定が容易に決定されなくてもよいです。このアッセイは、阻害剤を産生するS.対グラム陽性およびグラム陰性種の幅広い株をなど、様々な鼻の分離株を用いて最適化しました競合他社株7,8として黄色ブドウ球菌 SH1000。続いて、それを競合他社と阻害剤生産菌として様々なコアグラーゼ陰性とコアグラーゼ陽性ブドウ球菌を使用してテストされています。競争相手として上述したもの以外の属のテスト時株は、接種物のための希釈のいくつかの最適化が必要になることがあります。 透明度スコアは繰り返しの間で大幅に変化した場合、特定の光学密度に設定することで、競合他社株接種物を標準化する必要があるかもしれません。しかし、これは、アッセイがセットアップにかかり、実験ごとに処理することができる株の数を削減する可能性がある時間が長くなります。視覚的に迅速な代替手段を提供することができるマクファーランド標準を使用して、適切なODに培養物を調整します。 この手法の1つの制限は、それが唯一の培養可能細菌に適用することが可能です。多くの研究は競争的排除の相互作用3,4,13を予測するために、16S rRNAの塩基配列決定を使用する理由です。しかし、遺伝的およびメタゲノム技術が唯一の種レベルにコミュニティのメンバーを区別することができ、および/または特定の種内の形質変化を考慮していません。 particulの関連性についてスクリーニングすることが可能です細菌種5の有無に形質をコードするAR遺伝子が、しかし、この種の排除と関連する可能性が高い遺伝子の事前知識を必要とします。 この技術の安全性の考慮事項は、細菌のエアロゾル生成のために、それが唯一のレベル2の安全キャビネットに研究室で使用される、または類似の安全上の注意事項を説明することができ、ということです。種内特性ばらつきを考慮し、菌のエアロゾルを発生させない分離株との間の競合をテストするための代替技術があります。そのような方法の一つは、同時拮抗アッセイ2です。この方法では、1分離株の接種材料を寒天プレート上に広げられ、最初は乾燥させた後に第二の分離株の接種材料は、上部にスポットまたは刺されています。これは、両方の阻害化合物を生成し、最初の栄養素​​を捕捉するために競合する、株は直接競合（同時拮抗作用）にある環境を生成することになります。 advantag同時拮抗アッセイを超える繰延増殖阻害アッセイのeは阻害剤の分離株は、常に完全に競合分離株の侵攻前に確立されているの競争上の優位性を持っているべきであるということです。これは、別の歪みが追加される前に、ほとんどのニッチでは、1分離株ではなく、2つの単離は、同時に8で追加されているよりも、確立されるように、環境に何が起こるかをより反映しています。 細菌のエアロゾル発生を回避するための別の方法として、注ぎよりもむしろ阻害剤の単離物の上に噴霧することができたトップアガー、に分離する競技者を追加することです。しかし、追加されたトップ寒天の量は、プレートの偶数カバレッジを確保するために、約3 mlであることが必要であろう。このボリューム内では、競合他社の分離株は、阻害剤の分離株と同じメディア上に成長されることはないので、縮小栄養素苦しむないだろう。競技者はまた、UNT任意の阻害化合物と直接接触しないであろう彼らはトップアガー中に拡散IL。このようなアッセイは、繰延阻害または同時拮抗作用として記述することができませんでした。 同様の方法は、以前の臨床S.間バシトラシン耐性のレベルを評価するために使用されています黄色ブドウ球菌は 10を分離します。プロトコル間の主な違いは、ここで説明し、それが10で説明した、などの機密（スコア0 inhibition-明瞭さを完了）または耐性後者のみ分類された競合他社の株（無inhibition-明快に部分的には1-5のスコア）です。繰延成長阻害アッセイは、したがって、特定の抗菌剤の生産に対する耐性のレベルをスクリーニングするために使用することができ、あるいは多剤耐性病原体に対して活性な新規な抗菌剤を検索します。 ホスト微生物叢が細菌コミュニティ9の望ましくないメンバーを排除するように操作され得ることが示唆されています。コリネバクテリウムまたは黄色ブドウ球菌の応用ylococcus表皮すでにS.を排除することが示されています人口11,12のかなりの割合で鼻孔内球菌のコロニー形成。競争的にホスト内細菌叢の望ましくないメンバーを除外することができ、特定の株への研究は、そのようなここで説明したものなどの技術を介して、したがって、将来の治療法につながる可能性があります。

コミュニティに住むバクテリアは、空間と栄養素をめぐって種間および種内レベルで競争します6。微生物間の競争は、しばしばコミュニティ内の特定の種や菌株の排除につながる可能性があります。排除は、特定の受容体または栄養素をめぐる競争、またはコミュニティのメンバーによる抗菌化合物の生産によるものである可能性があります6。
競争的排除を調査する研究では、16S rRNAシーケンシング3,4,13を使用して種の存在と不在を頻繁に調査します。しかし、種内形質の変動、例えば抗菌ペプチド産生の有無は、ある種が別の種を阻害する能力に大きな影響を与える可能性があります1。16S rRNAシーケンシングでは同種の株を区別できないため、種内形質の変動を評価することはできません。ここで説明する手法は、個々の菌株が他の細菌を排除する可能性を評価するために使用できます。この方法は、鼻腔群集における黄色ブドウ球菌阻害細菌の存在と黄色ブドウ球菌の不在との間に正の相関を示すために以前に使用されてきた7。
遅延増殖阻害(競合)アッセイは、抗菌化合物の生産または阻害剤株による栄養素の競合を特定することができます。また、正の相互作用を検出することもでき、それによって阻害剤株の存在が実際に競合菌株の成長を改善します。このアッセイは、定量的データ(クリアリングサイズのゾーン)および定性的データ(抑制の程度)を作成するために使用でき、どちらもコミュニティ内の種の有無のデータに重ね合わせて、表現型(形質)と競合的排除7との間の相関関係を見つけることができます。

<table><tbody><tr><td>脳の心臓注入ブロス</td><td>ラボM</td><td>lab049</td><td>豊富な汎用メディア</td></tr><tr><td>寒天-寒天</td>メル<td>クMilipore</td><td>101614</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>Sarstedt</td><td>82.1473.001</td><td></td></tr><tr><td>プラスチック香水気化器</td><td>不明</td><td>-</td><td>直径3.5cmの蓋付き透明プラスチックスプレーボトルで高さ10cm、スーパーマーケット</td></tr><tr><td>の旅行セクションから購入生産が終了したユニバーサルボトル</td><td></td><td>、代替SLS BOT5006</td><td>28 mlガラス円筒形ボトル(直径~280 mm、高さ850 mm)、プラスチックスクリューキャップ付き平底</td></tr><tr><td>Decon 90</td><td>Decon&nbsp;</td><td></td><td>界面活性洗浄剤&nbsp;</td></tr></tbody></table>

繰延成長阻害アッセイは、競争上の細菌由来の抗菌剤の効果を定量化するために

Deferred Growth Inhibition Assay to Quantify the Effect of Bacteria-derived Antimicrobials on Competition

例えば、阻害剤を生産する菌株が必須栄養素をめぐって競合他社を凌駕したり、競合他社が耐性を持たない抗菌化合物を生産したりすると、微生物群集で競争排除が発生する可能性があります。ここでは、抗菌化合物の産生または栄養素の競合を通じて、ある細菌が別の細菌の成長を阻害する能力を評価する方法である遅延増殖阻害アッセイについて説明します。この手法は、鼻分離株とコミュニティからの特定の種の除外との相関関係を調査するために使用されてきました。この技術は、抗生物質の生産者や新規の可能性のある抗菌薬のスクリーニングにも使用できます。アッセイは、まず試験阻害剤産生菌株を寒天プレート上で一晩培養し、次に試験競合菌株に噴霧して再度インキュベートすることによって行われます。インキュベーション後、阻害の程度は、阻害剤産生株の周囲のクリアリングゾーンのサイズを通じて定量的に測定でき、阻害ゾーンの透明度を評価することによって定性的に測定できます。ここでは、遅延阻害アッセイのプロトコルを提示し、実験間の変動を最小限に抑える方法を説明し、阻害の程度を定性的に評価するために使用できるクラリティスケールを定義します。

アッセイの結果は、中央にスポット阻害剤産生株（ 図1）の近くにオーバーレイされた競合他社の株の違いとして観察可能でなければなりません。これらの違いは、完全な阻害（ 図1A）、部分的な阻害（ 図1Bおよび1C）、無阻害（ 図1D）または正の関連性として解釈することができます。広く利用可能なラボは、S菌株表皮 Tü3298とS.表皮 Rp62A、およびS.表皮 Rp62AとS.黄色ブドウ球菌 Newmanのは、それぞれ図1Bおよび1Dに使用しました。我々は、これらの株は、このプロトコルを試験するために使用され得ることを示唆しています。 テストした種に応じて、完全な阻害と部分的な阻害は、最も可能性の高い抗菌ペプチド、抗生物質または他の拡散性の成長inhibitoの結果であります阻害剤産生株によって産生されるrsの。部分的な阻害はまた、阻害剤株6によって競合他社の取り込みに起因する歪みや栄養素の封鎖のための減少栄養利用にリンクされています。 同じ競合他社株に対して試験した異なる阻害剤を産生する分離株の間で阻止帯の大きさの比較は、次のいずれかの違いを示しています阻害剤生産菌によって産生される抗菌剤の量;メディアを通じて拡散する阻害剤の能力;阻害剤の種類が生成され、生成される阻害剤の競合株の抵抗レベル。同じ阻害剤産生株に対してテスト異なる競合他社の株の間で阻止帯の大きさを比較すると、生成される阻害剤に競合他社株の抵抗レベルの指標です。 細菌の一貫性のないアプリケーションが発生した場合のプレートを使用するべきではありません。例えば、テスト競合文化はあまりにも阻害ゾーンは、典型的には、（ 図2A）が観察されたよりも大きく、あまり明確に定義されたエッジに表示されます希薄である場合、これは、任意の比較ゾーンの測定値の信頼性に影響を与えるだろう。阻害剤産生株のスポットが完全に一晩のインキュベーションの前に乾燥されなかった場合、阻害剤の株は、典型的には、ゾーンの測定に影響を与えるだけでなく、透明度スコアに影響を与える可能性が明確に定義されたスポット（ 図2B）を形成広がっていない可能性があります。競合株である場合均等に噴霧していない、これは、細菌（ 図2C）の不均一広がりにつながることができます。競合他社株があ ​​まりにも集中している場合、それは競合他社の株が阻害剤株（ 図2C）の上に成長する可能性があり、極端な場合には、これは競合他社/インヒビター株の役割のいくつかの反転につながることができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54437/54437fig1.jpg" /> 図1： 繰延増殖阻害アッセイから得られる定性的および定量的な結果の範囲増殖阻害についての結果は、（B）部分阻害（スコア1）、（A）完全な阻害（0のスコア）の範囲とすることができます、（C）部分阻害（2のスコア）（D）阻害なし（4のスコア）へ。ラベルは（Y）阻害剤の株の増殖のエッジと抑制の最も外側のエッジを示していますゾーン（X）。 A、B、CおよびDの結果は、最近のブドウ球菌の分離株について示されているで撮影プレートのための測定値を示す（E）に示すように0 mmのから10mm以上の阻害帯のゾーンのサイズ、（ 、C）または共通ラボブドウ球菌は、Sを分離します表皮 Tü3298（阻害剤）とS.表皮 Rp62A（競争相手）（B）、及びS.表皮 Rp62A（阻害剤）とS.球菌ニューマン（競技者）（D）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54437/54437fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54437/54437fig2.jpg" /> 図2： 貧しい技術による矛盾した結果の例 （た場合の結果は予想よりも異なる場合があります</stro競合他社株が均一に散布していなかった、あまりにも濃縮した場合はNG&gt;）競技株があ ​​まりにも希薄た、（B）阻害剤の株は、インキュベーション/プレートの前に完全に乾燥しませんでしたが、乾燥または（C）はありませんでした。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54437/54437fig2large.jpg" target="_blank">拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図の。</a>

遅延増殖阻害アッセイは、ある細菌分離物が他の細菌分離株に及ぼす競争効果を評価するために使用することができます。阻害は、阻害剤産生分離物の周囲のクリアリングゾーンを測定することによって定量化されるか、または阻害の目に見える程度を決定することによって定性的に評価されます。

Competitive exclusion can occur in microbial communities when, for example, an inhibitor-producing strain outcompetes its competitor for an essential ...

本プロトコルの全体的な目的は、ある細菌分離株が別の分離株に及ぼす競争の影響を、定量的および定性的な方法で検討することです。この手法は、細菌コミュニティ内における競争的排除に関する調査において、重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、細菌コミュニティ内で実際に起こっている現象を反映している点にあります。侵入株が成功裏に侵入するためには、既定の分離株による抑制効果を生き延びることができなければなりません。本手順の実演は、病院生物学専攻の大学院生であるEmma Crankが行います。まず、製造元の指示に従って、ブレインハートインフュージョン（BHI）寒天培地を調製します。滅菌するため、寒天を121 °C、15 psiで20分間オートクレーブします。滅菌したBHI寒天を15 mLずつ滅菌ペトリ皿に分注し、凝固させます。製造元の指示に従ってBHI液体培地を調製し、10 mLずつ28 mLガラス製ユニバーサルボトルに分注します。その後、BHIブロスを20分間オートクレーブで滅菌します。気化ボトルを準備するには、まずボトルの分解から始めてください。気化器内部の汚染物質を除去するため、5%界面活性洗浄剤を気化器を通して噴霧します。その後、気化器ボトル、蓋、および気化器を洗浄剤に一晩浸します。翌日、滅菌エアフローフードの下で気化器、蓋、およびボトルを乾燥させます。次に、70% ethanolでボトルを満たします。その後、気化器を再装着し、エタノールを気化器から噴霧します。気化器に蓋をし、使用するまでエタノールを入れた状態で保存します。使用前に、滅菌済みBHIブイヨンを用いてボトルを無菌的に洗浄し、ブイヨンを気化器から噴霧してください。細菌のオーバーナイト培養を調製するために、競合株および阻害株を滅菌済みBHI寒天プレートにストリークし、37 °Cで好気的に約18時間インキュベートします。28 mLユニバーサルボトルを用い、10 mLの滅菌済みBHIブイヨンに、必要な競合細菌株の単一コロニーを接種します。この培養液をユニバーサルオービタルシェーカーにて、37 °C、250 RPMで一晩インキュベートします。翌日、接種した培養液がプレート上で広がってしまうのを防ぐため、アガープレートが完全に乾燥し、蓋に結露がないことを確認します。オーバーナイト培養液25 µLをアガープレートの中央にピペットで分注します。この際、培養液がアガー上に飛散する原因となる気泡の発生を防ぐため、ピペットのプランジャーを完全に押し切らないように注意してください。培養液の広がりを抑えるため、室温で乾燥させます。その後、アガープレートを37°Cで好気的に一晩インキュベートします。一晩培養した後、吸収紙を敷いたセーフティーキャビネット（レベル2）内で、BHIブロスを用いて培養液を10倍に希釈し、1 mLあたり約4×10⁶ CFUになるようにします。次に、希釈した培養液を滅菌済みのプラスチック製香水アトマイザーボトルに注ぎます。遅延増殖抑制試験を行うには、各噴霧ボトルを用いて培養液を噴霧し、アガーに噴霧する前に噴霧機構内に培養液が充填されていることを確認します。アガーから約15センチメートルの距離から、希釈した培養液約250 µLをアガー表面全体に噴霧します。プレートを37 °Cで好気的に一晩インキュベートします。遅延増殖抑制を判定するために、噴霧した競合菌株の増殖抑制帯の直径をミリメートル単位で測定し、そこから抑制物質産生菌をスポットした中心部の直径を差し引きます。最後に、テキストプロトコルに従って、抑制帯の透明度スコアを記録します。この図に示すように、アッセイ結果は、中心にスポットした抑制物質産生菌の周囲にある、重ね塗りされた競合菌株の差異として観察されるはずです。その差異は、完全な阻止、部分的な阻止、阻止なし、または正の相関である可能性があります。このグラフは、阻止物質を産生する分離株間の阻止円を比較したものであり、これは産生される抗菌物質の量、阻止物質の培地中への拡散能、産生される阻止物質の種類、または競合菌株の阻止物質に対する耐性レベルの結果である可能性があります。この例では、試験に用いる競合培養液が希釈されすぎている場合、阻止円が通常よりも大きく現れ、エッジの境界が不明瞭になることが示されています。阻害剤産生菌のスポットが、一晩の培養前に完全に乾燥していなかった場合、阻害菌が広がり、明確なスポットが形成されません。また、競合菌が均一に散布されていないと、細菌の広がりにムラが生じることがあります。最後に、競合菌の濃度が高すぎると、阻害菌の上で増殖し、極端な場合には競合菌と阻害菌の役割が逆転する可能性があります。この手法に習熟すれば、検査する分離株のペア1組あたり、4日間に分けて合計1時間を要します。この手順を実施する際は、アッセイ間で良好な再現性を得られるよう、均一に噴霧することが重要です。本手順に従うことで、抑制データと、コミュニティにおける細菌種の有無に関する分類学的データを重ね合わせて解析することが可能になります。これにより、抑制効果が種が環境に定着する能力に影響を与えるかどうかを判断することが可能になります。この手法の開発により、コミュニティマイクロバイオーム分野の研究者は、競争的排除における抗菌ペプチド予測などの形質分散がコミュニティ構造に及ぼす影響を調査できるようになります。このビデオを視聴することで、ある細菌分離株が別の分離株の増殖を競争的に抑制する能力を、定性的および定量的な方法で比較する方法について十分な理解を得ることができます。エアロゾル化した細菌の取り扱いは極めて危険であるため、本手順を実施する際は、レベル2安全キャビネット内での作業や適切なPPE（個人用保護具）の着用などの予防措置を常に講じてください。

deferred-growth-inhibition-assay-to-quantify-effect-bacteria-derived

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

出典:Speare、L.、et al。Vibrio fischeri分離株間の競合的相互作用を定量化するための共同培養法J. Vis.

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