F9 RARE-lacZをセルベースレポーターアッセイを使用したE8.5胚および神経球培養における相対的なレチノイン酸レベルの定量的測定

本手順の目的は、細胞ベースのリポーターアッセイを用いて、E8.5マウス胚や成体ニューロスフェア培養などの組織標本におけるレチノイン酸（RA）の相対レベルを定量的に測定することです。RAシグナル伝達経路は十分に解析されていますが、RAを組織学的に直接測定することは技術的に不可能です。本アッセイは、遺伝子変異がRAレベルにどのように影響するかという重要な疑問を解決するのに役立ちます。

この手法の主な利点は、感度が非常に高く汎用性があり、さまざまな組織試料における広範囲のRA濃度を測定できることです。この方法は、さまざまな組織試料中のRAレベルを決定するための直接的な知見を提供できるだけでなく、RAレベルの変化をモニタリングすることでRA代謝酵素の有無を判定するなど、他の研究にも応用可能です。実験を開始する前に、F9 RARE-LacZ細胞のRAに対する反応性を確認してください。96ウェルプレートに播種したF9 RARE-LacZ細胞に、1 nMのall-trans RAを添加します。

次に、プレートをインキュベートし、37 °Cで一晩培養します。翌日、LacZ染色を行い、細胞に青色の沈殿があるかを確認します。細胞全体に色が均一でない場合は、細胞のサブクローニングに進みます。

選択した培養物を、10 cmディッシュに10 mLあたり100,000個の密度で分注します。2日間培養した後、24ウェルプレートの各ウェルに0.2%ゼラチンを500 µLずつ分注し、室温で30分間静置します。その後、ゼラチンを除去し、各ウェルを500 µLの蒸留水で2回洗浄します。

次に、各ウェルにF9 RARE-LacZ細胞培養液を500 µL加えます。続いて、滅菌済みのP10ピペットチップを用いてF9細胞のコロニーをピックアップし、それぞれを1つのウェルに移します。3〜4日間培養した後、コロニーをゼラチンコートした24ウェルプレート2枚に分割し、一方は試験用、もう一方は拡大培養用に用います。

さらに2日間培養した後、24ウェルプレートの各ウェルに1 nanomolarのRAを添加し、一晩培養します。翌日、LacZ染色を行い、高反応個体を判定して、対応する培養物を拡大培養します。E8.5胚の回収またはニューロスフィアの分散を行う1日前に、96ウェルプレートの各ウェルに0.2%ゼラチンを100 microlitersずつコーティングし、30分間静置します。

次に、ゼラチンを吸引し、各ウェルを200 µLの蒸留水で2回洗浄します。続いて、10 cmディッシュで維持している選択後のF9 RARE-LacZ細胞をトリプシン処理します。その後、G418を含まない培地を用いて、96ウェルプレートの各ウェルに100,000個の細胞を播種します。

各胚を共培養するのに十分な数のウェルにロードするか、ニューロスフィアを用いる場合はジェノタイプにつき3つのウェルを用意します。また、標準曲線用に24ウェルを用意します。その後、プレートを24時間インキュベートします。

胚細胞の共培養を行うため、E8.5胚の解剖を開始します。次に、新しい1.5 mLチューブに10 µLのtrypsinを加え、口径を広げたP20ピペットチップを用いて胚全体をチューブに移し、チューブを氷上に置きます。すべての胚を単離した後、すべてのチューブを37 °Cで5分間インキュベートし、組織を解離させます。

5分後、P20ピペットチップを用いて各チューブの内容物を穏やかにトリチュレートし、F9 RARE-LacZ細胞が入った準備済みの96ウェルプレートのウェルに10 µL分注します。プレートを一晩培養します。ニューロスフィア共培養を行う場合は、まずニューロスフィア培養物を15 mLチューブに移すことから始めてください。

チューブを200 gで10分間遠心分離し、上清を1 mL残してすべて除きます。次に、P1000ピペットを用いて内容物をトリチュレーション（撹拌）します。その後、少量を採取し、解離した細胞の密度を測定します。

次に、100,000個の分散させたニューロスフィア細胞をF9 RARE-LacZ細胞の上に播種します。各ニューロスフィア培養タイプを3ウェルずつ分注してください。ここで、標準曲線のためのウェルを必ず準備しておきます。

F9 RARE-LacZ培養培地を用いて、7つの異なる濃度に連続希釈して調製したオールトランスRA溶液を、100 µLずつ3連（triplicate）で添加します。未処理の細胞を陰性対照として含めてください。最後に、完全に充填した96ウェルプレートを一晩培養します。

翌日、培地を除去し、1ウェルあたり100 µLの2.5%グルタルアルデヒドを用いて培養物を固定します。プレートを室温で15分間インキュベートします。その後、固定液を除去し、200 µLのPBSで1回10分間、2回ウェルを洗浄します。

次に、ウェルを200 µLのLacZ洗浄液で1回10分間、計3回洗浄します。3回目の洗浄中に、アルミホイルで包んだ15 mLチューブ内でX-gal染色液を調製します。また、96ウェルプレート用の加湿チャンバーを準備します。

次に、各ウェルにX-gal染色液を200 µL加えます。プレートを加湿チャンバーに入れ、37 °Cでインキュベートします。インキュベーション後、LacZ染色液を除去し、200 µLのPBSに置換します。

次に、610ナノメートルでの吸光度を測定し、プレートを撮影します。F9 RARE-LacZリポーター細胞株は、RAに対してβ-ガラクトシダーゼの比例的な誘導により定量的に反応する接着性胚がん細胞で構成されています。また、これらの細胞は上皮様形態を有しています。

G418選択条件下で培養しても、これらの細胞のRAに対する反応性は数代の継代を経て弱まります。したがって、RAに対して強力かつ均一に反応する細胞を確保するためには、定期的なサブクローニングが必要です。Gpr161のvl変異をホモ接合的に持つE8.5胚では、胚のRAシグナル伝達が低下することが予想されます。解離胚とF9 RARE-LacZ細胞を用いた前述の共培養アッセイにより、この予想が確認されました。

野生型成体由来ニューロスフィアとF9 RARE-LacZ細胞の共培養を用いて、ニューロスフィア培養におけるRAの検出試験も行いました。ステージE8.5の細胞と比較して染色の強度が上昇したのは、ニューロスフィア培養の均質性による可能性があります。RAレベルの標準曲線を作成することで、野生型ニューロスフィア培養およびE8.5胚におけるRAレベルの定量が可能となりました。

この手順を行う際は、RAに強く反応するF9 RARE-LacZ細胞を定期的なサブクローニングによって維持することを忘れないでください。また、均一な分布と一貫したRA測定を促進するため、サンプルを十分に分散させてください。本手順の後、遺伝子変異がRAレベルに及ぼす影響を調査することができ、その後、RAシグナリング経路のどの構成要素が直接的に影響を受けているかを調査するための他の手法を実施することが可能です。