Name: 新生児心臓足場：再生研究のための新しい行列 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: 学ぶ新生児マウス心臓由来足場の作製法。細胞外基質の脱細胞化と再細胞化により、再生循環器研究における細胞・基質相互作用の新たなモデルを提供し、心臓再生治療への応用可能性を示します。

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著者は、図の作成についてCynthia DeKay氏に感謝します。

すべてのマウス実験は米国の動物福祉法に基づいて行われたミネソタ大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。 マウスの心臓の単離のための1手法<ol><li>単回使用の刃で断頭により新生児マウスを安楽死させます。 </li><li> 70％エタノールで胸部を綿棒。 </li><li> ＃5ピンセットで横方向に皮膚を引っ張りながら、標準的なはさみで胸壁から離れて切断することにより、胸部から肌を解剖。 </li><li>腹壁を通して切断することによりハサミで胸骨のすぐ下の腹部を穿孔。はさみで胸の両側にリブかかわらず切断しながら、＃5鉗子で剣状突起をつかみ、身体から吻側胸骨を撤回。胸郭は、心臓を明らかにするためにピンセットで上方に反射されます。 </li><li>ぶっきらぼうにさらす、＃5鉗子で横方向に引っ張ることにより、胸腺の二つの主ローブを分析大動脈弓だけでなく、大静脈と肺静脈。 </li><li> 10cmの春のはさみで、大動脈弓、大動脈自体からの主要な動脈を横断。心のベースと腕頭動脈の間に大動脈を保持します。気管と食道からそれを分離し、前方の心を反映するために、＃5鉗子で切断された血管の端をつかみます。 </li><li> 10cmの春のはさみで心臓の両側に肺と心臓の間で切断することにより、肺血管系および他の主要な静脈を横断。静脈は排水を提供するために開いたままになります。 </li><li>主要な血管の切断端を把持し、＃5鉗子で縦隔から心臓を取り出します。カテーテル挿入のための滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を含む60mm培養皿に心を置きます。 </li></ol>ランゲンドルフ灌流によって脱細胞化のため2.方法<ol><li>事前にカテーテルアセンブリを準備します。 4センチメートルセクションを描きます小型化、薄型化カテーテルを作成するための小さなアルコールの炎におけるPE 50チューブの。寸法を満たすためにブレードを用いて両端をトリム（約約500μmの外径のフランジと300μmの外径OD）は、 図1に示す。これは、プルの各側面から2つの対称的なカテーテルを提供します。 </li><li>薄い端の開口部にフランジを溶融するために、簡単に炎の中にチューブの切断端を指します。 </li><li> PBSで12ミリリットル注射器を記入し、注射器に3方活栓を配置することによって、カテーテルを組み立てます。コックに22 G×1針を追加し、隔壁を通して針を駆動します。針（ 図1）上に描かれたPEチューブカテーテルをスライドさせます。 </li><li>すべての気泡が除去されたことを保証する、PBSとの組立部品を洗浄。 </li><li> 7-0縫合糸の1タイで大動脈弁とライゲート過ぎて伸びるない、孤立した心臓の大動脈に、上記で概説したように調製し、カテーテルを挿入します。トンのフランジを休ま彼はタイトなシールを作り、カテーテルから外れるの心を防ぐ、タイに対して近位カテーテル。 </li><li>優しくPBSを含む注射器を用いて心臓を灌流しながら、倍率の下でカテーテル法を守ってください。漏れがシステムに存在しないことを確認し、潜在血液が除去されるように組織が均一に白く。 </li><li>入口アダプタの首に隔膜を配置し、ガラスの上側面を折り畳むことによってそれを封印。 </li><li> 図 20に示すようmmHgで圧力を発生させる列を生成するのに十分な長さのラインを介して蒸留水（のdH 2 O）中の1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を60mlを充填したリザーバーを取り付けます。 1。1ミリメートル水銀の関係に基づいて、液柱の高さからの圧力を計算すると1.3595センチメートルのH 2 Oに等しいです。 注意：SDSは、刺激性の特性を有する非常に綿状粉末です。接触は避けるべきです。適切な防護服を使用した粉末を処理します。 </li><li> 14時間、1％SDSで心臓を灌流。心臓が観察されない残りの組織と外観に半透明になります。 </li><li>残りのSDS溶液のコックにシステムをフラッシュし、10ミリリットルのdH 2 Oでそれを置き換えます1×ペニシリンストレプトマイシン（ペニシリン-ストレプトマイシン）を含有する60ミリリットルのPBS、続いて10ミリリットルのdH 2 Oに続いて（蒸留水で希釈した）10ミリリットル、1％トリトンX-100との心を、灌流します。 </li><li> 4℃で1×ペニシリン - ストレプトマイシンを含むPBS中で心を保管してください。意図された後の脱細胞化アプリケーションが灌流を必要とする場合は、大動脈内カテーテルは、そうでなければ、縫合ネクタイをカットし、カテーテルを取り外し、維持されるべきです。 </li></ol> 3. DNAの決意<ol><li> 50のKCl、2.5mMのMgCl 2を、10 mMトリス（pHは8.3）で0.45％のTween 20中に200μg/ mlのプロテイナーゼKを使用して、脱細胞化ECMまたはコントロール心のダイジェストを準備します。 </li><li>組織が溶解するまで、攪拌しながら55℃で組織をインキュベート通常、4-5時間。 </li><li>アッセイ4,11を結合DNAとホモジネートのDNA含有量を定量します。 </li></ol> 4.固定および組織のセクショニング<ol><li>室温で30分間、PBS中の4％パラホルムアルデヒド中で脱細胞化し、再細胞化または制御P3心を修正しました。 </li><li> PBS 3倍で組織を洗います。 </li><li>それが沈むまで4℃で0.1 Mリン酸緩衝液中の7.5％スクロースの溶液中で組織を置きます。 </li><li>それは沈むまで、再度、4℃で0.1 Mリン酸緩衝液中15％スクロース溶液を変更します。 </li><li> 37°Cに組織を加温し、15％スクロースおよび0.1Mリン酸緩衝液中のゼラチン溶液で容量の半分を交換し、一晩平衡化。ゼラチンの濃度は、1％、2.5％、5％を介して段階的に増加し、最終的に7.5％倍されます。 </li><li>新鮮な7.5％のゼラチンを使用してcryomoldsでサンプルを置きます。脱細胞化サンプルの形状を復元するには、液体のゼラチンは、tとの室に灌流することができます彼の心臓は、成形されています。液体窒素でcryomoldsを浮遊させることによって凍結。 -80℃で保管してください。 </li><li>クライオスタットで切断し（厚さ10μm）のセクション。セクションの表面に近いスライドを持参し、セクションが原因で静電処理したスライド上の電荷を表面にナイフからオフに移動を観察。一晩スライドを乾燥させ、将来の分析のために-80℃で保存します。 </li><li>冷凍庫からスライドを外し、室温に平衡化した後、ゼラチンを溶解させ、37℃で20分間、PBSを含むコプリンジャーに配置します。 </li><li>ヘマトキシリンおよびエオシンでステップ4.7から切断面を染色します。コプリンジャーにスライドを置きます。 1.5分間剤を青味、1分間水道水を、3分間バッファー、1.5分間水道水を、45秒間ヘマトキシリンにステップ4.8で水和スライドを公開し、80％エタノールで1分間、アルコールエオシンY 8秒間、 1分間の3×1分、1分2×100％エタノール、エージェントをクリアする（キシレン代替物）80％エタノール、樹脂とカバーガラスベースの取り付けメディア。顕微鏡でスライドを調べます。 </li><li>加湿チャンバー内での水和スライドを配置することによって、このようなコラーゲンIVなどのECMの構造タンパク質のための心臓ECM、汚れのECMタンパク質の反応性の保持を確認し、0.1％トリトンを含むリン酸緩衝生理食塩水で10％正常ロバ血清（NDS）で処理するには室温（RT）で1時間-X100（PBST）。組織切片をカバーするのに十分な量を使用してください。 </li><li> 5％NDS / PBST中で経験的に決定された希釈での選択の一次抗体を含む溶液を交換してください。 150：例えば、コラーゲンIV抗体は1で希釈しました。 4℃で一晩インキュベートします。 </li><li> PBST 3倍でスライドを洗浄し、蛍光色素と結合した任意の二次抗体を適用します。経験的に決定された量によって抗体を希釈します。 RTで1時間インキュベートします。 PBS 3回洗浄します。 </li><li> mountiを含むDAPIを用いて細胞核が存在しないことを確認するために、例えば、DAPIなどのDNA結合色素とのスライドを染色カバースライドを滑る際にメディアをngの。 </li><li> 400Xの50での蛍光顕微鏡でスライドを調べます。 </li></ol>再細胞化のため5. P1新生児マウス心室心筋細胞<ol><li> 70％エタノールで各子犬をスプレーし、単回使用の刃で首を切ります。 </li><li>胸郭が胸腔を露出するように、小さな滅菌ハサミで正中線で分割されている間、親指と人差し指の間の各子犬を保持します。それは、主要な血管および唯一の心室組織を残して心房の自由切断されながら心臓が胸から自由に突出することを可能にするために圧力を適用します。 </li><li> 20 mlの氷冷カルシウム、全ての心が収集されるまで、20mMの4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（CBFHH）と重炭酸フリーハンクス緩衝生理食塩溶液を含む50mlチューブに直接心を置き。 </li><li> CBFHHを吸引し、チューブに新鮮なCBFHH（氷冷）10〜15ミリリットル追加。トンで組織を旋回することによって、組織を洗います彼はチューブを数回。 </li><li> 60ミリメートルのプラスチックペトリ皿に心を含む溶液をデカント。 </li><li>春のはさみで心から離れてトリミングすることにより、氷上で倍率で心からの任意の潜在心房組織を解剖。均一なサイズの小さな断片に心室をみじん切りに。 ＃5ピンセットで皿からの分離された非心室組織を削除します。 </li><li>ピペットで滅菌マイクロ撹拌棒が含まれている小型の滅菌バイアル中に組織片を転送するために必要とされるようCBFHHソリューションの多くを。 </li><li>組織がバイアルの底に沈殿し、CBFHH溶液を除去することができます。 </li><li> CBFHH中の酵素液1.75 mg / mlでトリプシン、20 / mlのDNアーゼIIの50ミリリットルを構成しています。ピペットで5この酵素溶液のmlおよび磁気撹拌機でミンチ心室組織と場所を含むチューブに追加します。 8分間室温で一定速度（340 rpm）で攪拌します。 注：攪拌作用が穏やかな、まだ許可する必要がありますスラリーの懸濁のため。 </li><li>撹拌プレートからバイアルを取り外し、スラリーを3分間沈降することを可能にします。ピペットと、それは主に血液細胞および組織破片が含まれて、最初のダイジェスト上清を廃棄します。 </li><li>ピペット第5ミリリットルの酵素溶液のアリコートと消化心室に追加します。 8分間撹拌し、それが他の3分間沈降することを可能にします。ダイジェストを開始する前に、2 50mlチューブ（1を標識し、2）をそれぞれ含む12ミリリットルの氷冷ウシ胎児血清（FBS）を準備します。各チューブの上に40μmのセルストレーナーを配置します。ピペットでチューブ1上のフィルターを通してこの上清。 </li><li> FBSを含む2つのチューブの間ダイジェスト上清の配置を交互に、消化プロセスをさらに8回繰り返します。各チューブに等しい体積を確保するため、チューブ1と2の間で均等に最後の上清を分割します。 注：各コレクションチューブは現在、細胞懸濁液の32.5ミリリットル総容量が含まれています。 </li><li>遠心管が含まれています4℃で6分間、上澄み150 XGをる。 </li><li>消化アリコートを収集しながら、（10％FBS、1×ペニシリン - ストレプトマイシン、1×L-グルタミンを含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM））メディアの6ミリリットルで5 100ミリメートル組織培養プレートを準備プレート当たり。培地を平衡化するために30分間、37℃、5％CO 2で、これらのアリコートをインキュベートします。 </li><li>両方のコレクションチューブからの細胞を組み合わせ、CBFHH酵素混合物を吸引し、上記で調製した培地を30mlに細胞を再懸濁。 </li><li> 100mMのプレートの各細胞懸濁液を6mlを戻し、37℃で45分間インキュベートします。 </li><li>インキュベーションの終わりに、5つの新しい皿に非接着細胞を転送し（線維芽細胞画分は、皿に付着し始めているであろうと、所望であれば別々に成長させることができる）45分間再度インキュベートします。 </li><li>めっき前の第二ラウンドの終了時に、皿から培地および非接着細胞を収集し、150で媒体を回転6分間XG。 </li><li> （灌流液100μlのコンストラクトあたり4.0×10 5細胞）を、おおよその所望の濃度に細胞をもたらすために余分なメディアをオフに描画します。計数およびまたは生存能力試験の14のためのアリコートを削除します。 </li></ol> P3ハートマトリックスの6バイオリアクター再細胞化<ol><li>一晩細胞を添加する前に、培養培地（ステップ5.15参照）で単離された心臓マトリックスを前処理。 </li><li> 図に示すようにランゲンドルフシステムの要素を組み立てます。 2。ガラス部品とエチレンオキシドをオートクレーブ滅菌性を保証するために、プラスチック部品を滅菌します。システムの種々のサブユニットは、支持台上に載置される前に、層流フード内で組み立てることができます。循環水浴加熱水流路は、明確にするために省略されています。 </li><li> （ステップ5.15参照）を組織培養培地120mlで組み立てシステムを埋めます。 </li><li> 60ミリメートルのCULのステップ2.14からカテーテルを挿入し、心臓の行列を配置トゥーレ倍率下皿とカテーテルへのステップ5.20から細胞懸濁液をロード×1針22 Gで1 mlシリンジを接続します。このアセンブリは、心臓塞栓避けるために気泡がないことを確認してください。 </li><li>穏やかに冠状動脈を介して心臓マトリックスに100μlの細胞懸濁液を灌流。完了すると、注射器/針の組み合わせを切り離します。 注：約の遅い灌流。毎分20μlのは、心臓を通過、静脈から流出するから細胞を防止するために必要とされます。 </li><li>バイオリアクター心臓瓶のふたの下側のルアーフィッティングに固定さ22グラム鈍いスタブと、スタブ上にカテーテルを押してください。 </li><li>蠕動ポンプを起動し、 図2に概説されるように進むことを確認します。貯水池からの移行をステップ2.5で大動脈内に配置されたカテーテル（ 図2の赤いパス）に気泡トラップを介して、ポンプを介して。静脈から心臓循環の流れを観察します頂点からsおよびドリップ、メディアリザーバーに再循環。 注：灌流流量は、このような構築物の血管抵抗、および心臓の大きさのような個々の要因に依存するが、50μL/分〜100の割合は、良い出発点です。中間の時点で、機能的な評価を行うことができます。新生児の再細胞化心臓のサイズスケールを行うことができますが、我々は、光学ベースのシステムは、彼らが大人のラット心臓で使用されてきたと同じように行動を破って定量化するために使用することができることを決定した評価を、制限されています。4構築物は、拡張のために灌流することができます（23時間まで）期間。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

心の繰り返し灌流にこの技術の依存性は、塞栓症の回避成功した結果の重要な要素になります。ステップ2.2から2.6での心臓の初期カテーテル法からは、ステップ2.8から2.14の間の溶液の変化に、心筋に灌流液の流れを損なう気泡の導入を可能にすることができる操作があります。新生児心臓の小柄なサイズに、血管系であっても微小な気泡は、このように不完全な脱細胞化をレンダリング、技術的な梗塞を引き起こす可能性があります。さらに、後の洗浄工程において、不完全な灌流は、洗剤残留物に悪影響を与える生体適合性をもたらすことができます。これはまた、気泡形成の源とすることができるように変更して溶液からガス移動を溶解したときさらに、このようなステップ2.14において示唆されるように4℃の貯蔵からマトリックスを除去するときのように急激な温度変化は、注意して接近されるべきです温度インチW再細胞化に鶏進む細胞懸濁液を注射器を準備する際、追加のケアは、注入が無気泡（ステップ6.4）であることを確認するために、適用されるべきです。 他の組織タイプに対応するために、このプロトコルの詳細を操作する必要があるかもしれません。ガ...

心不全は一般的で致命的です。これは、臓器への血流を阻害し、身体満たされていないの代謝要求を残す心臓の収縮低下をもたらす進行性疾患です。 570万人のアメリカ人が心不全を有し、それは米国9における入院の主要な原因であると推定されます。米国における心不全の患者を治療するための集団的コストは年間9-10につき$ 300億ドルを超えました。末期の心不全のための唯一の決定的な治療法は、同所心臓移植です。毎年、10万人以上のドナーの心臓は、米国1-2で心臓移植の手続きのために必要とされていると推定されています。ドナーの限られた数に、わずか約2400移植は、米国2で毎年行われています。明らかに、この臓器不足は、他の戦略がtransplantaための付加的な臓器を産生するために必要とされるように対処する必要があります拒絶反応や生涯免疫抑制に関連する合併症を回避するようションとは、理想的には、これらの器官は、自己のだろう。 哺乳類の成体の心筋細胞は、損傷時に限られた再生能力を実証するが、最近の証拠は、哺乳動物の新生児の心がけが5-8以下の驚くべき再生能力を維持することを示唆しています。具体的には、部分的な外科的切除後、再生ウィンドウが誕生し、生後7日目、この回生期間は線維性瘢痕の欠如によって特徴づけられる、血管新生の形成、心外膜からの血管新生因子の放出、および心筋細胞の増殖5-8との間で発見されました、11。この時間の回生ウィンドウには、バイオ人工心臓の開発のための材料の新規供給源としての新生児の心臓を使用しての可能性を提供します。 細胞外マトリックスはcardiomyocytを促進する重要な手がかりを提供することが知られていますEの増殖と成長。新生児と成人の行列12および再生を促進する能力において分子の利用可能性の明確な違いは、13を検討されています。脱細胞化された成人のマトリックスは、細胞の再増殖およびバイオ人工心臓の発生のためのECMの足場を提供するために、いくつかの研究で使用されてきました。これらの研究、および幹細胞技術の新たな発見は、急速に進展しているが、いくつかのハードルが満たされていません。例えば、マトリックスの天然構造、マトリックス壁への細胞の統合、およびすべての制限このアプローチの成功増殖と成長をサポートする能力を維持するには限界。優れた再生属性は新生児心臓に帰されてきたが、そのような組織を使用して実用的な側面は、その探索を制限しています。 新生児の心臓の実証された再生能力に基づいて、我々は、開発することによって、新たな行列を開発しましたP3のマウスの心臓のための脱細胞化の手法。以前は6に決定するが、心臓が収穫、脱細胞化および再細胞化に十分な大きさであるとして、それは心臓再生のウィンドウ内にあるようP3の心はこれらの研究のために選択しました。本研究の目的は、新生児マウスの心臓から行列を作成することの実現可能性を実証することです。我々の研究は、ECMの構造とタンパク質性の整合性を維持しながら、分、新生児の心臓を脱細胞化の実現可能性のための証拠を提供します。また、mCherryを発現する心筋細胞でこの心臓ECMを再細胞化する能力を示す、我々は再細胞化後の種々の心臓マーカーの発現のために、これらの心筋細胞を検討しました。この技術は、バイオ人工心臓の開発のための新生児の行列の優位性のテストのためにできるようになります。

<table><tbody><tr><td colspan="4">1.マウス心臓分離</td></tr><tr><td>P1マウスの子犬のための材料(図のように;B6;D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J)</td><td>Jackson Laboratories</td><td>21577</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>60 mm 培養皿</td><td>BD Falcon</td><td>353004</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 pH 7.4 (滅菌)</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>シングルユースブレード</td><td>Stanley</td><td>28-510</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>標準ハサミ</td><td>Moria Bonn (Fine Science Tools)</td><td>14381-43</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>春のはさみ10 cm</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>15024-10</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>ヴァンナススプリングはさみ-3 mmカッティングエッジ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>15000-00</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>#5鉗子</td><td>ダムノット(ファインサイエンスツール)</td><td>11295-00</td><td>または同等の</td></tr><tr><td colspan="4">2。脱細胞化のための材料</ストロング></td></tr><tr><td>インレットアダプター</td><td>ケムグラス</td><td>CG-1013</td><td>オートクレーブ可能</td></tr><tr><td>セプタム</td><td>ケムグラス</td><td>CG-3022-99</td><td>オートクレーブ可能</td></tr><tr><td>1/8 インチID x 3/8 OD C-Flex チューブ</td><td>コールパーマー</td><td>EW-06422-10</td><td>オートクレーブ可能</td></tr><tr><td>オス ルアー 1/8" ホース バーブ アダプター</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K33</td><td>オートクレーブ可能</td></tr><tr><td>メス ルアー 1/8" ホース バーブ アダプター</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K26</td><td>オートクレーブ</td></tr><tr><td>Prolene 7-0 外科用縫合糸&nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>8648G</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>リングスタンド</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47807</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>Clamp</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-769-6Q</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>Clampレギュラーホルダー</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-754Q</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>60 ccシリンジ&nbsp;</td><td>Coviden</td><td>1186000777T</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>ビーカー</td><td>キンブル</td><td>14000250</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>22 G x 1シリンジニードル</td><td>BD</td><td>305155</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>12 ccシリンジ</td><td>Coviden</td><td>8881512878</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>3ウェイストップコック</td><td>スミスメディカル</td><td>MX5311L</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>PE50チューブ</td><td>BDクレイアダムスイントラメディック</td><td>427411</td><td>熱による成形可能であること。ポリエチレンをお勧めします。</td></tr><tr><td>1% SDS</td><td>Invitrogen</td><td>15525-017</td><td>Ultrapure グレードを推奨します。新鮮な溶液を作り、使用前に滅菌をろ過します。</td></tr><tr><td>1% トリトン X-100&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>10%ストックから新鮮な溶液を作り、使用前にフィルター滅菌します。&nbsp;</td></tr><tr><td>滅菌dH2O</td><td>Hyclone</td><td>SH30538.02</td><td>またはMilliQシステム精製水。</td></tr><tr><td>1 x Pen/Strep</td><td>Corning CellGro</td><td>30-001-Cl</td><td>または同等品 &nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">3.DNA定量用材料</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Fisher</td><td>BP1700</td><td>>30 U/mg activity</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333または</td><td>同等の</td></tr><tr><td>MgCl2&#183;6H2O</td><td>Mallinckrodt</td><td>5958-04</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>Tween 20&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>トリス塩基/塩酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503/T5941</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>Pico-Green dsDNA assay kit</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>P7589</td>では、<td>蛍光計が</td></tr><tr>colspan="4">4<tdを読み取る必要があります。豚</td></tr><tr>の皮膚<td>Sigma-Aldrich</td><td>G2500</td>からの組織</ストロング>パラホルムアルデヒドSigma-Aldrich P6148または同等の<td>ゼラチンタイプA</td>の固定および切片化の方法は、<td>300ブルーム以上である必要があります</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">5。組織組織学の方法</td></tr><tr><td>Cryomolds 10 x 10 x 5 mm</td><td>Tissue-Tek</td><td>4565</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Hacker/Bright</td><td>Model OTF</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>顕微鏡スライド&nbsp; 25 x 75 x 1 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-19</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>Hematoxylin 560&nbsp;</td><td>Surgipath/ライカセレクテック&nbsp;</td><td>3801570</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>Define</td><td>Surgipath/Leica Selectech&nbsp;</td><td>3803590</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>青色バッファ&nbsp;</td><td>Surgipath/ライカセレクテック&nbsp;</td><td>3802915</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>アルコール性エオシンY 515&nbsp;</td><td>Surgipath/ライカセレクテック&nbsp;</td><td>3801615</td>または<td>同等の</td></tr><tr><td>フォーミュラ83キシレン代替品&nbsp;</td><td>CBGバイオテクノロジー&nbsp;</td><td>CH0104B</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>Permountマウントマウントメディア&nbsp;</td><td>フィッシャーケミカル&nbsp;</td><td>SP15-500</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>コラーゲン IV 抗体</td><td>Rockland</td><td>600-401-106.1</td><td>または同等</td></tr><tr><td>品の &-アクチニン抗体</td><td>Abcam</td><td>AB9465</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>mCherry 抗体</td><td>Abcam</td><td>AB205402</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>NKX2.5 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-8697</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>Donkey 抗マウス AF488抗体</td><td>Life Technology</td><td>A21202</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>ロバ 抗チキン AF594 抗体</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>703-585-155&nbsp;</td><td>または同等のもの</td></tr><tr><td>ロバ抗ヤギCY5抗体</td><td>Jackson Immunoresearch&nbsp;</td><td>705-175-147</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-587-003</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade Mountant with DAPI</td><td>ThermoFisher</td><td>P36930</td><td>または同等の</td> <</tr><tr>td colspan="4">6.プレプレーティング</td></tr><tr><td>HBSS(Ca、Mgフリー)</td><td>Hyclone</td><td>SH30031.02</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>HEPES(1 M)</td><td>Corning CellGro</td><td>25-060-Cl</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>Cell Strainer</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>50 mlチューブ</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>Primeria 100 mmを使用した新生児心室心筋細胞の分離プレート</td><td>Corning</td><td>353803</td><td>Primeria 表面は線維芽細胞の付着を強化し、筋細胞の純度を高めます</td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>Difco</td><td>215240</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>DNase II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8764</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>DMEM (Delbecco's Minimal Essential Media)</td> <td>Hyclone</td><td>SH30022.01</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>ビタミン B12&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V6629</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>フィブロネクチンコーティングプレート&nbsp;</td><td>BD Bioscience</td><td>354501</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30910.03</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>心臓バイオリアクターガラス製品</td><td>Radnoti Glass Technology</td><td>120101BEZ</td><td>オートクレーブまたはガスによる滅菌可能でなければなりません。</td></tr></tbody></table>

新生児心臓足場：再生研究のための新しい行列

Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies

末期の心不全に対する唯一の決定的な治療法は、同所性心移植です。 毎年、米国では心臓移植手術に100,000万個以上のドナー心臓が必要であると推定されています1-2。 ドナーの数が限られているため、米国では毎年約2,400件の移植しか行われていません2。 細胞療法の研究から機械的補助装置の埋め込みまで、心臓が自己修復したり、機能不全の心臓を休ませたりするために、単独または組み合わせて数多くのアプローチが実施されてきました3。これらの努力にもかかわらず、補助人工心臓は依然として移植への橋渡しを目的として主に使用されており、細胞療法の有用性は、治癒効果が期待されているものの、まだ臨床試験に限定されています。 さらに、直接異種移植が試みられていますが、免疫拒絶反応のために成功は限られています。 明らかに、移植用の追加の臓器を製造するには別の戦略が必要であり、理想的には、拒絶反応や生涯免疫抑制に関連する合併症を避けるために、これらの臓器は自家であるべきです。脱細胞化とは、組織から常在する細胞を取り除き、天然の細胞外マトリックス(ECM)またはスキャフォールドを露出させるプロセスです。灌流脱細胞化は、組織の機械的特性の大部分をそのまま残しながら、組織の三次元構造を完全に保存する4。これらの足場は、健康な細胞で再増殖するために利用し、研究モデルを生成し、場合によっては移植に必要な臓器を生成することができます。 私たちは、顕著な心臓再生能力を保持することが知られている新生児マウス(P3)5-8の足場を界面活性剤を介した脱細胞化に曝露し、これらの足場にマウスの心臓細胞を再移植しました。これらの研究は、新生児の心臓構造を設計することの実現可能性を支持しています。 さらに、出生後早期の心臓のECMが、再細胞化戦略の改善につながる手がかりを秘めているかどうかについての調査が可能になります。

脱細胞化 平均して、このプロトコルを使用して、P3の心臓の脱細胞化までの時間は約14時間です。 P3の新生児用23mgの平均心重量与えられました。 Acellularity 図3aは、完全に無傷でP3新生児の心臓（全体のマウント）を示している。 図3bは、脱細胞化以下同じ心を示している。 図4aおよび図4bショー無傷で脱細胞化心臓のヘマトキシリンおよびエオシン染色を、それぞれ。ヘマトキシリン陽性核の不在と脱細胞化心臓における好酸球構造の減少に注意してください。また、脱細胞化心臓のDNA含有量を大幅に無傷の心臓（n = 6）が脱細胞化心臓における4.73±2.27μgのにで68.08±2.25μgのから減少した（n = 5）。 <p class="jove_content" fo:ke...

これらの研究では、我々は、回生の研究で使用するための新規、新生児マウスの心臓足場のための方法論を提供します。

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation.  Each year, it is estimated that more than 100,000 donor ...

本手法の全体的な目的は、再生研究での利用に向けて、新生児ミリアンの心臓組織から新しいスキャホールドを作製することです。この手法は、再生循環器学における重要な疑問への解答に寄与します。また、細胞外マトリックスが増殖能を持つ心臓組織に由来しているため、細胞とマトリックスの相互作用を研究するための新しいモデルを提供します。本手法の主な利点は、新生児細胞外マトリックスの新規性を発見できることです。ここからは、私の研究室の技術員であるStefan Krenが手順を実演します。手順を開始する前に、PE 50チューブの4 cmのセクションを小さなアルコールランプの炎で熱し、より細いカテーテルを作成してください。POの両側から2本の対称なカテーテルが得られるよう、端を適切な寸法にトリミングし、チューブの切断端を短時間火に当てて、細い方の端の開口部に1つのフランジを溶着させます。次に、12 mLシリンジにPBSを満たし、シリンジに3方活栓を取り付けます。22Gの針を活栓に装着し、針をセプタムに刺入します。次に、PEチューブカテーテルを針に沿わせて差し込み、アセンブリをPBSで洗浄します。カテーテルアセンブリの準備が整ったら、新生児の胸部を70% ethanolでスワブします。その後、5番ピンセットで組織を外側に牽引しながら、標準的な鋏を用いて胸部の皮膚を切除します。次に、胸骨の直下で腹壁に穿孔し、鉗子で剣状突起を把持します。胸部の両側の肋骨を切断しながら、胸骨を体から吻側へ牽引し、肋骨籠を上方に反転させます。心臓が見えたら、胸腺を側方に引いて2つの主葉を分離し、大動脈弓、大静脈、および肺静脈を露出させます。10 cmのスプリング鋏を用いて、大動脈弓からの主要動脈および大動脈自体を切断します。切断した血管の端を掴んで心臓を前方に反転させ、気管および食道から分離させます。肺と心臓の間、および心臓の両側を切断して、肺血管およびその他の主要静脈を切断します。その後、主要血管の切断端を掴んで心臓を縦隔から取り出し、滅菌PBSを入れた60 mm培養皿に心臓を移します。心臓を脱細胞化するために、培養皿を実体顕微鏡の下に置き、カテーテルアセンブリの針を大動脈弁まで挿入します。ただし、弁を越えて挿入しないようにしてください。7-0縫合糸で1回結んで針を固定し、カテーテルのフランジを結紮部に近位側から密着させて密閉し、PBSで心臓を緩徐に灌流します。漏れがなければ、潜在的な血液が除去されるにつれて、組織が均一に白濁します。セプタムをインレットアダプターのネックに配置し、セプタムの両端をガラス部分に折り返して固定します。次に、蒸留水で調製した1% Sodium dodecyl sulfate 60 millilitersを充填したリザーバーを、20 millimeters of mercuryの圧力を生成するのに十分な長さのラインで接続し、心臓をSDSで14時間灌流します。灌流終了後、心臓は半透明になり、組織の残存は観察されなくなります。残りのSDS溶液を用いてストップコックまでシステム内を洗浄し、リザーバーに10 millilitersの脱イオン水を満たします。次に、1% Triton X-100を10 milliliters、脱イオン水を10 milliliters、そしてペニシリンおよびストレプトマイシンを含むPBSを60 millilitersの順に心臓へ連続的に灌流させて洗浄します。最後の灌流後、心臓をPBSおよび抗生物質中で4 degrees Celsiusにて保存します。組織を再細胞化するために、解剖顕微鏡下でカテーテルを挿入した心臓マトリックスを60 millimeterの培養皿に移し、目的の細胞を充填した22 gauge針付きの1 milliliterシリンジをカテーテルに接続します。器具内に気泡がないことを確認し、冠動脈を介して心臓マトリックス内に細胞懸濁液を毎分20 microlitersずつ緩やかに灌流させます。100 microlitersの細胞を注入した後、シリンジを取り外し、バイオリアクター用心臓ジャー蓋の底部にあるルアーフィッティングに固定された22 gaugeの鈍端スタブにカテーテルを押し込みます。次に、ペリスタルティックポンプを始動させ、リザーバーからポンプ、バブルトラップを経てカテーテルへと流れが進んでいること、および心循環が静脈から流出し、心尖部から滴下して培地リザーバーへと再循環していることを確認します。これらの画像では、無処置および脱細胞化された心臓のヘマトキシリン・エオジン染色の結果を示しています。脱細胞化された心臓において、ヘマトキシリン陽性の核が消失し、好酸性構造が減少していることに注目してください。完全な新生児心臓および脱細胞化した新生児心臓における新生児細胞外マトリックスの含有量を評価するため、免疫染色を行ったところ、コラーゲンIVは完全な心臓と脱細胞化した心臓の両方で強力に発現しており、細胞除去後もこのタンパク質の局在が維持されている一方で、DAPI陽性の核は効果的に除去されていることが示された。また、界面活性剤を用いた脱細胞化後の新生児心臓ではDNA含有量が減少しており、これは他の組織で界面活性剤ベースの脱細胞化を用いた報告と一致している。これらの画像では、左心室壁に遊走した再細胞化心筋細胞が観察できる。灌流後最大23日までに、これらの遊走細胞は心臓前駆細胞マーカー、mCherry、分化した心筋細胞マーカー、またはDAPIに対して陽性となる可能性があり、大部分の細胞がこれら4つのマーカーすべてを発現します。この手法に習熟し、適切に実施すれば、34時間で完了させることができます。本手順を行う際は、灌流装置を介して空気が混入し、心臓に塞栓が生じないように十分注意することが重要です。この手順に従い、ゲルの作製と3Dプリンティングを用いることで、増殖性グラフトや、さらにはin vitroでの3D心臓を作製することが可能です。この技術は、研究者が心筋再生を促進するための道を切り開く可能性があります。このビデオを視聴することで、新生マウス心臓の脱細胞化および再細胞化の方法について十分に理解できるはずです。ドデシル硫酸ナトリウムの取り扱いは危険を伴う可能性があるため、粉末状の試薬を扱う際は、常にN-95マスクの着用やドラフトチャンバーの使用などの予防措置を講じてください。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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学ぶ新生児マウス心臓由来足場の作製法。細胞外基質の脱細胞化と再細胞化により、再生循環器研究における細胞・基質相互作用の新たなモデルを提供し、心臓再生治療への応用可能性を示します。

新生児心臓足場：再生研究のための新しい行列

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