Name: デジタルホログラフィック顕微鏡とマルチモーダル定量位相イメージングは、正確に腸の炎症および上皮創傷治癒を評価します (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 学ぶデジタルホログラフィック顕微鏡法を用いた腸管炎症と上皮創傷治癒の定量的評価法。Caco-2細胞培養とマルチモーダルイメージングにより、炎症性腸疾患の病態解析と創傷治癒メカニズムの解明に貢献します。

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原稿を校正してくださったFaekah Goharに感謝します。専門的な技術支援を提供してくださったSonja Dufentester氏とElke Weber氏に感謝します。

著者らは開示するものは何もない。

私たちは、DHMは、ex vivoでのマウス大腸炎モデルおよびヒトの結腸組織試料における組織学的損傷の正確な評価を提供することを実証している。また、我々は、DHMが連続的に同時に携帯の変化についてのマルチモーダル情報を提供しながら、上皮創傷治癒を監視することができます示します。 DHMでは、デジタルで撮影したホログラムの再構成が数値的に32に行われます。従って、明視野顕微鏡、ゼルニケ位相コントラストおよび微分干渉コントラスト顕微鏡法と比較して、DHMは、任意の後続の数値焦点補正（多焦点画像）27との定量的な位相差を提供します。定量位相イメージングは​​、光路長の変化の決意に基づいており、従って、使用測定器の高度に無関係です。これは、異なる機器で取得された測定データの比較が簡単になります。また、DHMはオブジェのための唯一の低光強度を必要としますCT照明。これは、未染色解剖組織の低侵襲性の分析を可能にし、生きた細胞の長期的タイムラプス観察の際に必要なサンプルの相互作用の量を最小限に抑えることができます。 ...

炎症性腸疾患（IBD）、 すなわち、潰瘍性大腸炎（UC）およびクローン病（CD）は、消化管1の特発性炎症性障害です。 IBDの根底にある病態生理および潜在的な新薬や新たな診断手法の評価の研究は、特に重要です。基礎研究およびIBD患者の臨床管理の両方で、腸粘膜が注目2,3の焦点となっています。粘膜は、共生細菌、上皮細胞および腸の免疫系の種々の細胞成分間の相互作用は、腸のホメオスタシス4,5を編成れる解剖学的境界を表します。しかし、IBD患者に、制御されていないと持続性の腸の炎症は最終的にそれ自体が局所の炎症6を悪化させる上皮バリア機能の崩壊に終わることができます潰瘍や狭窄などの検出可能な損傷を、粘膜につながります。 <pクラスは、= &quot;jove_content&quot;&gt;上皮は、創傷治癒、炎症ので下記上皮再生のために重要であるだけでなく、消化管手術7後の消化管潰瘍や縫合不全の治癒のためのコア要件です。上皮は治癒がアッセイ治癒インビトロ創傷でシミュレートし、腸の炎症8,9のマウスモデルにすることができます巻か。両方のin vitroおよびin vivoでのアプローチは実験的評価の精度を制限する欠点を持っている。in vitroアッセイを、古典的なスクラッチアッセイのように、蛍光発色団と長引く染色手順またはトランスフェクションを必要とします。彼らは多くの場合、10を自動化することができない細胞増殖および遊走のそれらの不連続な監視によって制限されている。例えば、デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）誘発性大腸炎などのin vivoモデルを、頻繁に起因見られる大きな変化に一部、堅牢な読み取りアウトを欠いています実験室でのマーカーで、ミリアンペア不適切な王このようなマーカーは、大腸炎の重症度11,12を評価しました 。炎症を起こした粘膜の組織学的分析は、まだ現在大腸炎の重症度を決定するための最も有効な手法であるが、これは、in vitroでの上皮創傷治癒アッセイのように、染色を必要とし、研究者の専門知識13に依存しています。 最近、デジタルホログラフィック顕微鏡（DHM）、定量的位相顕微鏡14の変異体は、 インビトロおよびインビボ 15 における上皮の創傷治癒の評価のための有用なツールとして同定された。DHMは、（OPD）の光路長遅延を測定することにより、組織密度の評価を可能にします、その見通し新たな癌の診断16-18と炎症関連組織の変化19の定量化。また、DHMは、セルの厚さ、セル覆われた表面領域および細胞内（タンパク質）コンテンツ量を決定することにより、細胞形態動態のモニタリングを可能にします<sup&gt; 15,20。 in vitroアッセイでは、DHMはまた、細胞体積と厚さ21,22の変化を評価することによって、 例えば、携帯透水性、生理学的プロセスの分析を可能にします。また、DHM測定は、研究者に関連したサンプルバイアスを防止する自動化することができます。 ここでは、腸の炎症のマウスモデルにおけるDHMの使用を実証し、また、ラベルフリーのin vitroアッセイとして、創傷治癒の定量的モニタリングのためのヒト組織試料の分析にDHMを適用します。まず、我々は、IBDを有するヒトから大腸炎マウスおよび組織切片における異なる結腸壁層の炎症性変化を評価します。 DHM定量位相画像化手順を説明した後、我々は、詳細な顕微鏡部品を使用するための指示、組織切片を調製し、また、取得した定量的な位相画像の評価を記述を提供します。 次に、我々は、DHMはUTIできることを示していますin vitroでの上皮創傷治癒の連続マルチモーダル監視のためlized、および細胞層の厚さ、乾燥質量と細胞容積のような細胞の特性の分析を記述し、薬物誘導し、生理的な細胞の変化への洞察を与えます。

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azoxymethane (AOM)</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany</td><td>A5486</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Flask</td><td>Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany</td><td>658170</td><td></td></tr><tr><td>Costar Stripette</td><td>Corning Inc., New York, USA</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>デキストラン硫酸ナトリウム (DSS)</td><td>TdB 領事館,ウプサラ、スウェーデン</td><td>DB001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/Ham's F12</td><td>PAA Laboratories - Pasching - オーストリア</td><td>E15-813</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma - Aldrich、Deisenhofen、ドイツ</td><td>SPR3196</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)</td><td>Sigma - Aldrich、Deisenhofen、ドイツ</td><td>E 9884</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tube 50 ml</td><td>BD Biosciences、Erembodegem、ベルギー</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>イソペンタン (2-メチルブタン)</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany</td><td>M32631-1L</td><td></td></tr><tr><td>Methylene blue</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>1159430025</td><td></td></tr><tr><td>Mitomycin C</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany</td><td>M4287</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>G. Menzel, Braunschweig, Germany</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T.ティッシュテックコンパウンド&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>Sakura, Zoeterwonde, Netherlands</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep/Amphotericin B</td><td>Lonza, Verviers, Belgium</td><td>1558</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline, PBS</td><td>Lonza, Verviers, Belgium</td><td>4629</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza, Verviers, Belgium</td><td>3626</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride 0.9%</td><td>Braun, Melsungen, Germany</td><td>0411</td><td></td></tr><tr><td>/05/12211095標準食</td><td>Altromin, Lage, Germany</td><td>1320</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>Sakura, Leiden, Netherlands</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA</td><td>Lonza, Verviers, Belgium</td><td>7815</td><td></td></tr><tr><td>Vitro &ndash;Clud</td><td>R. Langenbrinck, Teningen, Germany</td><td>04-0002&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&micro;-Dish 35 mm with Culture-Insert, high</td><td>ibidi GmbH, Munich, Germany</td><td>81176</td><td></td></tr><tr><td>DIC Lid for &micro;-Dishes, with a glass insert</td><td>ibidi GmbH, ミュンヘン, ドイツ</td><td>80050</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MICROM HM550</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, USA</td><td>46320</td><td></td></tr><tr><td>デジタルホログラフィック顕微鏡</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>コンポーネント</td><td>Model</td><td>Company</td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>iMIC</td><td>Till Photonics, Graefelfing, Germany</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Laser Compass 315M</td><td>Coherent GmbH, リューベック, ドイツ</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡レンズ</td><td>Zeiss EC Plan Neofluar 10x/0.3</td><td>Zeiss, Goettingen, Germany</td><td></td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>DMK 41BF02</td><td>The Imaging Source, ブレーメン, ドイツ</td><td></td></tr></tbody></table>

デジタルホログラフィック顕微鏡とマルチモーダル定量位相イメージングは​​、正確に腸の炎症および上皮創傷治癒を評価します

Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing

炎症性腸疾患の発生率、 すなわち、クローン病および潰瘍性大腸炎は、大幅に過去10年間で増加しています。 IBDの病因は不明のままであり、現在の治療戦略は、免疫系の非特異的抑制に基づいています。具体的に有意にIBDの管理を改善することができ、腸の炎症および上皮創傷治癒を標的とする治療法の開発は、しかし、これは、炎症性の変化を正確に検出する必要があります。現在、潜在的な薬物候補は、通常、 インビボまたはインビトロでの細胞培養に基づく技術を用いて、動物モデルを用いて評価されます。組織学的検査は、通常、サンプルの特性を変えることができ、さらに、調査結果の解釈は研究者の専門知識によって変えることができ、目的の細胞または組織染色することが必要です。デジタルホログラフィック顕微鏡（DHM）は、光路長遅延の検出に基づいて、可能汚れのない定量的位相コントラストイメージング。この結果は、直接絶対生物物理学的パラメータと相関させることを可能にします。私たちは、屈折率測定に基づいて、DHMと組織密度の変化の測定は、大腸炎マウスとヒトの結腸組織標本の異なる層に、染色することなく、炎症性の変化を定量化する方法を示しています。さらに、当社は、創傷領域の簡単な自動化された決意と、そのような移行細胞の乾燥質量と層の厚さなどの形態学的パラメータの同時決意を通じてDHMを使用して可能in vitroでの上皮創傷治癒、の連続マルチモーダルラベルフリーの監視を実証します。結論として、DHMは貴重な、新規かつ定量的なツールの可能なパラメータの絶対値を持つ腸の炎症を評価するための、in vitroでの上皮創傷治癒の簡素化定量化を表し、したがって、翻訳診断uのための高い可能性を秘めていますSE。

デジタルホログラフィック顕微鏡用DHMイメージングのための典型的なセットアップ（DHM） 図 1Bに示すように、明視野イメージングおよび定量DHM位相コントラスト撮影を行うために、我々は、倒立顕微鏡を適用しました。 25前述したように、システムは、DHMモジュールを取り付けることによって修正されました。マッハツェンダー構成（ 図 1 A）におけるYAGレーザλ= 532nm）をディジタルホログラムを照明することにより、周波数倍増Ndを光で試料を作製しました。解剖組織をガラスキャリアスライド上にエクスビボで分析しました。 図 1...

炎症効果の正確な評価は、炎症性腸疾患の治療のための潜在的な新薬の評価にとって最も重要です。デジタルホログラフィック顕微鏡は、マウスおよびヒトの結腸組織サンプルの炎症の評価を提供するだけでなく、in vitroでの上皮創傷治癒の自動マルチモーダル評価を提供します。

The incidence of inflammatory bowel disease, i.e., Crohn&#39;s disease and Ulcerative colitis, has significantly increased over the last decade. The ...

この研究の全体的な目標は、デジタル ホログラフィック顕微鏡または DHM を使用して、腸の炎症結腸組織サンプルの自動無染色定量的位相コントラスト イメージングを提供し、in vitro での上皮創傷治癒をマルチモーダル評価することです。この方法は、胃腸の炎症と創傷治癒の分野で重要な質問に答えるのに役立ちます 病気の活動性 炎症を起こした人間と海洋 この技術の主な利点は、汚れのない客観的な方法で物理的パラメータによって細胞と組織の検出と定量化を可能にすることです。手順のデモンストレーションは、Biomedical Technology Centerの技術者であるFittest Ketelhut氏です。細胞培養を設定し、第五に4回10をインキュベートし、Caco 2細胞あたりセンチメートル平方センチメートル35ミリメートルのペトリ皿に高培養インサートを装備し、95%の湿度と5%の二酸化炭素で摂氏37度でFBSと抗生物質を補充した。2日後、目的の薬剤で細胞を処理し、培養物をさらに24時間インキュベーターに戻します。翌日、上清を吸引し、ピンセットを使用してインサートを取り外します。1ミリリットルのHEPES緩衝細胞培養培地で培養物を1〜2回洗浄し、創傷領域から死んだ細胞と残っている細胞成分を取り除きます。次に、2ミリリットルの新鮮なHEPESバッファードメディウムを追加し、皿を閉じます。次に、ペトリ皿をデジタルホログラフィック顕微鏡に置き、10 x対物レンズを選択します。画像取得ソフトウェアを開き、明視野イメージングモードを選択します。加熱チャンバーを摂氏37度に設定し、培養物を加熱チャンバーに入れます。次に、単一の巨大な細胞層と両側にまっすぐな境界線があり、死んだ細胞や血清がない適切な創傷がライブモニタリングウィンドウで視覚化できるようになるまで、視野を動かします。最初の創傷領域の白色光画像を撮影します。次に、白色光照明をオフにして、デジタルホログラフィック顕微鏡モードを選択します。レーザー照明をオンにし、ホログラム記録の露光時間を3ミリ秒未満に選択します。ホログラフィックのオフアクセス干渉縞が適切なコントラストで現れる場合は、サンプルホログラムをキャプチャし、再構成ソフトウェアで定量的な位相像を再構築して画質を確認します。次に、創傷のタイムラプスDHM観察を開始し、適切なエンドポイントで記録を停止し、白色光照明下でサンプルの最終画像を取得します。急性デキストラン硫酸ナトリウム、またはDSS大腸炎誘発の場合、100ミリリットルのオートクレーブ水に溶解した3グラムのDSSをマウスablibidimに供給します。.7日後、対照動物および処理動物から厚さ7マイクロメートルのスイス圧延結腸サンプルを採取します。各切片を50〜100マイクロリットルのPBSに浸し、サンプルを個々のガラスカバースリップで覆います。スライドの底にほこりやその他の汚れがないことを確認してください。次に、最初のスライドを顕微鏡ステージに置き、関心のある組織領域が見えるまで視野を調整します。サンプルにピントを合わせ、画像取得ソフトウェアで明視野画像をキャプチャします。次に、DHMイメージングモードを選択し、レーザー光照明に切り替えます。露光時間を 3 ミリ秒未満に設定し、ホログラフィック オフ アクセス干渉縞がライブ イメージング ウィンドウに適切なコントラストで表示されることを確認します。次に、組織のデジタルホログラムをキャプチャします。内視鏡的には、中等度から重度の大腸炎の証拠には、結腸壁の肥厚、血管パターンの変化、線維の髄質化、および粘膜表面の粒度が含まれます。結腸切片の従来の組織学的評価では、主に粘膜下組織に位置する対照動物と比較して、治療されたDSSの結腸壁に顕著な浮腫が明らかになります。対応する定量的なDHM位相差画像と関連する屈折率マップも、上皮性月経腫の密度に目に見える違いがないこれらの組織の変化が、天然の未染色組織サンプルで特に明らかであることを示しています。大腸炎マウスの上皮、粘膜下組織、間質では、健康な対照群と比較して屈折率が有意に低下しており、実験動物の体重の相対的な減少と屈折率との間には有意な相関関係があります。ここでは、デジタルホログラフィック顕微鏡による創傷治癒アッセイの代表的な連続モニタリングを45時間にわたって示しています。治癒過程における細胞被覆表面積、平均細胞厚さ、および細胞乾燥質量の計算を可能にします。DHMは、サイトカイン誘発性細胞の変化に関するバイオコア情報を提供すると同時に、上皮創傷治癒の継続的なモニタリングを可能にすることを示しました。さらに、屈折率変化の測定を通じて、DHMによる大腸炎モデルおよびヒト結腸組織サンプルの組織学的損傷の正確な評価を実証します。DHMは光路長遅延の検出に基づいているため、組織密度、乾燥質量、細胞の厚さなどの絶対的な生物物理学的パラメータを、染色のない定量的位相コントラストイメージングで分析できます。一般的な研究用顕微鏡を使用したDHMの集大成と、この技術の堅牢性は、細胞生物学およびデジタルパソロジーにおけるこの方法の日常的な応用への道を開きます。このビデオを見れば、生物医学実験室環境で生細胞培養の組織を分析するためのデジタルホログラフィック顕微鏡の使用方法を十分に理解できるはずです。結論として、DHMは、炎症の絶対パラメータの評価、およびトランスレーショナル診断の使用の可能性が高い上皮自発的なin vitroの簡略化された定量化のための、貴重で新規かつ定量的なツールを作成します。

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Medicine

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弱散乱物体の三次元位置が一意的に標準的な顕微鏡に軽微な改変を伴うデジタルインラインホログラフィック顕微鏡法（DIHM）を用いて同定することができる。当社のソフトウェアは、微細な位相物体の3次元位置と形状を得るためにレイリー·ゾンマーフェルトバックプロパゲーションと相まって、簡単な画像処理、ヒューリスティックを使用しています。...

弱散乱被験者のデジタルインラインホログラフィ顕微鏡（DIHM）

私たちは、明視野と微分干渉コントラスト画像の組み合わせを通じて、細胞の質量、体積、密度の定量的測定を行うための標準的な光学顕微鏡の使用について説明します。...

定量的な光学顕微鏡：細胞生物物理の測定は、標準的な光学顕微鏡で特徴

小動物イメージング技術は、シリアル診断検査およびインビボでの治療介入を行うことができる。最近では、適用範囲が大幅に拡大している、現在は大腸腫瘍発生の評価、創傷治癒および炎症の監視が含まれています。このプロトコルは、マウス内視鏡検査のこれらの多様な潜在的な用途を示している。...

マウス内視鏡検査のためインビボ発がんと腸の評価のマルチモーダルイメージング創傷治癒および炎症

ターゲット特定プローブなど各種疾患 (例えば炎症、感染、腫瘍) におけるタンパク質発現の分子機構を解析するための革新的なツールを表します。本研究では F4/80...

検出とマクロファージによるマウス腸管炎症の定量化のための蛍光を介したトモグラフィー

逆紡糸円盤共焦点顕微鏡によるマウス小腸のインビタルイメージングを用いてGFP標識γΔ...

マウス小腸における上皮内リンパ球の分体イメージング

生体内顕微鏡を利用して、ここで提示される方法は、生きている動物の腸上皮細胞脱落のリアルタイム視覚化を可能にする。従って、麻酔化マウスの局所染色された腸粘膜(アクリフラビン及びローダミンB-デキストラン)は、共焦点顕微鏡を用いて単細胞分解能まで画像化される。...

腸透過性と上皮細胞流れ性能を評価する生体内顕微鏡ベースのアプローチ

無料のコンピュータ支援システムを用いた腸内炎症の系統的採点は、潰瘍および炎症性変化の存在を特徴とする大腸炎モデルにおける組織病理学的変化を定量的に比較する強力なツールである。組織学的大腸炎スコア評価は臨床観察を強化し、データ解釈を促進する。...

プリンデキストラン硫酸ナトリウムによる大腸炎モデルにおける腸内炎症の系統的採点解析

ここでは、レーザー誘導創傷時の腸の画像を取得する方法を紹介します。マウスの腸を多光子レーザーにさらすことによって、単一または複数の陰窩の喪失が局所的に誘発される。損傷領域を数か月にわたって繰り返しイメージングすることにより、腸の回復のリアルタイムのダイナミクスがキャプチャされます。...

腸のリモデリングを研究するためのレーザーアブレーションと生体内顕微鏡

低コヒーレンスホロトモグラフィーを使用したオルガノイドの高解像度、ラベルフリー、3次元イメージングのための段階的なプロトコルを提示します。このプロトコルは、オルガノイド培養の調製、画像取得、および計算画像解析を詳細に説明し、生きたオルガノイドの構造ダイナミクスと薬物応答のリアルタイムの視覚化を可能にします。...

低コヒーレンスホロトモグラフィーによる腸管オルガノイドのラベルフリー、高解像度3Dイメージングおよび機械学習解析

この研究では、全マウント腸組織と多光子顕微鏡を使用して分泌された粘液を定量化し、塩化カルバモイルコリンなどの刺激に応答した粘液動態の正確な体積分析と視覚化を可能にする 3D...

ホールマウント組織イメージングを用いた腸粘液の三次元定量化

学ぶデジタルホログラフィック顕微鏡法を用いた腸管炎症と上皮創傷治癒の定量的評価法。Caco-2細胞培養とマルチモーダルイメージングにより、炎症性腸疾患の病態解析と創傷治癒メカニズムの解明に貢献します。

デジタルホログラフィック顕微鏡とマルチモーダル定量位相イメージングは​​、正確に腸の炎症および上皮創傷治癒を評価します

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