デジタルホログラフィック顕微鏡とマルチモーダル定量位相イメージングは​​、正確に腸の炎症および上皮創傷治癒を評価します

この研究の全体的な目標は、デジタル ホログラフィック顕微鏡または DHM を使用して、腸の炎症結腸組織サンプルの自動無染色定量的位相コントラスト イメージングを提供し、in vitro での上皮創傷治癒をマルチモーダル評価することです。この方法は、胃腸の炎症と創傷治癒の分野で重要な質問に答えるのに役立ちます 病気の活動性 炎症を起こした人間と海洋 この技術の主な利点は、汚れのない客観的な方法で物理的パラメータによって細胞と組織の検出と定量化を可能にすることです。手順のデモンストレーションは、Biomedical Technology Centerの技術者であるFittest Ketelhut氏です。

細胞培養を設定し、第五に4回10をインキュベートし、Caco 2細胞あたりセンチメートル平方センチメートル35ミリメートルのペトリ皿に高培養インサートを装備し、95%の湿度と5%の二酸化炭素で摂氏37度でFBSと抗生物質を補充した。2日後、目的の薬剤で細胞を処理し、培養物をさらに24時間インキュベーターに戻します。翌日、上清を吸引し、ピンセットを使用してインサートを取り外します。

1ミリリットルのHEPES緩衝細胞培養培地で培養物を1〜2回洗浄し、創傷領域から死んだ細胞と残っている細胞成分を取り除きます。次に、2ミリリットルの新鮮なHEPESバッファードメディウムを追加し、皿を閉じます。次に、ペトリ皿をデジタルホログラフィック顕微鏡に置き、10 x対物レンズを選択します。

画像取得ソフトウェアを開き、明視野イメージングモードを選択します。加熱チャンバーを摂氏37度に設定し、培養物を加熱チャンバーに入れます。次に、単一の巨大な細胞層と両側にまっすぐな境界線があり、死んだ細胞や血清がない適切な創傷がライブモニタリングウィンドウで視覚化できるようになるまで、視野を動かします。

最初の創傷領域の白色光画像を撮影します。次に、白色光照明をオフにして、デジタルホログラフィック顕微鏡モードを選択します。レーザー照明をオンにし、ホログラム記録の露光時間を3ミリ秒未満に選択します。

ホログラフィックのオフアクセス干渉縞が適切なコントラストで現れる場合は、サンプルホログラムをキャプチャし、再構成ソフトウェアで定量的な位相像を再構築して画質を確認します。次に、創傷のタイムラプスDHM観察を開始し、適切なエンドポイントで記録を停止し、白色光照明下でサンプルの最終画像を取得します。急性デキストラン硫酸ナトリウム、またはDSS大腸炎誘発の場合、100ミリリットルのオートクレーブ水に溶解した3グラムのDSSをマウスablibidimに供給します。.

7日後、対照動物および処理動物から厚さ7マイクロメートルのスイス圧延結腸サンプルを採取します。各切片を50〜100マイクロリットルのPBSに浸し、サンプルを個々のガラスカバースリップで覆います。スライドの底にほこりやその他の汚れがないことを確認してください。

次に、最初のスライドを顕微鏡ステージに置き、関心のある組織領域が見えるまで視野を調整します。サンプルにピントを合わせ、画像取得ソフトウェアで明視野画像をキャプチャします。次に、DHMイメージングモードを選択し、レーザー光照明に切り替えます。

露光時間を 3 ミリ秒未満に設定し、ホログラフィック オフ アクセス干渉縞がライブ イメージング ウィンドウに適切なコントラストで表示されることを確認します。次に、組織のデジタルホログラムをキャプチャします。内視鏡的には、中等度から重度の大腸炎の証拠には、結腸壁の肥厚、血管パターンの変化、線維の髄質化、および粘膜表面の粒度が含まれます。

結腸切片の従来の組織学的評価では、主に粘膜下組織に位置する対照動物と比較して、治療されたDSSの結腸壁に顕著な浮腫が明らかになります。対応する定量的なDHM位相差画像と関連する屈折率マップも、上皮性月経腫の密度に目に見える違いがないこれらの組織の変化が、天然の未染色組織サンプルで特に明らかであることを示しています。大腸炎マウスの上皮、粘膜下組織、間質では、健康な対照群と比較して屈折率が有意に低下しており、実験動物の体重の相対的な減少と屈折率との間には有意な相関関係があります。

ここでは、デジタルホログラフィック顕微鏡による創傷治癒アッセイの代表的な連続モニタリングを45時間にわたって示しています。治癒過程における細胞被覆表面積、平均細胞厚さ、および細胞乾燥質量の計算を可能にします。DHMは、サイトカイン誘発性細胞の変化に関するバイオコア情報を提供すると同時に、上皮創傷治癒の継続的なモニタリングを可能にすることを示しました。

さらに、屈折率変化の測定を通じて、DHMによる大腸炎モデルおよびヒト結腸組織サンプルの組織学的損傷の正確な評価を実証します。DHMは光路長遅延の検出に基づいているため、組織密度、乾燥質量、細胞の厚さなどの絶対的な生物物理学的パラメータを、染色のない定量的位相コントラストイメージングで分析できます。一般的な研究用顕微鏡を使用したDHMの集大成と、この技術の堅牢性は、細胞生物学およびデジタルパソロジーにおけるこの方法の日常的な応用への道を開きます。

このビデオを見れば、生物医学実験室環境で生細胞培養の組織を分析するためのデジタルホログラフィック顕微鏡の使用方法を十分に理解できるはずです。結論として、DHMは、炎症の絶対パラメータの評価、およびトランスレーショナル診断の使用の可能性が高い上皮自発的なin vitroの簡略化された定量化のための、貴重で新規かつ定量的なツールを作成します。