Name: 細胞培養アプリケーションのためのヒドロゲルの光媒介形成とパターニング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 学ぶ、光媒介によるヒドロゲルの形成とパターニング法を用いた三次元細胞培養技術。シトコンパチブルな光クリック化学により、細胞封入と生体材料パターニングを制御可能にし、組織工学や創薬研究に応用できます。

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この作品は、創薬および国立衛生研究所で将軍医科学研究所（P20GM104316とP30のGM110758-01、それぞれ）から組織開発賞、ピュー慈善財団が資金を提供高度な生体材料にデラウェアCOBREプログラムによってサポートされていました（00026178）、全米科学財団のキャリア賞（DMR-1253906）、バローズウェルカム基金（1006787）、およびデラウェア大学の国立科学財団IGERT SBE2プログラム（L. Sawickiにフェローシップ）。著者らは、寛大に、骨髄、教授クリストファー・Jから単離されたhMSCを提供するために、ビデオ撮影時の支援のために、共焦点顕微鏡、さんキャサリンワイリーに氏マシュー・レーマンを訓練し、アクセスのためのデラウェア大学のデラウェアバイオテクノロジー研究所バイオイメージングセンターに感謝します自動プレートリーダーを使用するため。Kloxin氏とスティーブン馬寛大にフォトマスクを提供するための、および教授ウィルフレッド・チェン。 </p&gt;

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここで紹介する手順は、チオール - エンクリックケミストリーによって形成されたヒドロゲル内のセルをphotoencapsulateする技術を実証し、その後、生化学的手がかりを有するゲルをphotopattern。最初にヒドロゲルを形成するための光の使用は、重合に先立って、ポリマー溶液内で均一に混合し、細胞の懸濁液を可能にします。急速な重合 &#39;ロック&#39;が定義されて金型の形状におけるゲルおよびハイドロゲルネットワーク内で懸濁した細胞をカプセル化します。ゲルはまた、所望の最終用途に応じて多数の異なる形状（ 例えば 、ガラススライドまたはシリンジ先端）に成形することができます。光減衰は、薄い試料に制限されるように、例えば、ガラススライドに取り付けられたヒドロゲルで3D培養のためにカプセル化された細胞が撮像用途のために特に有用です。シリンジ型をスライドガラスに比べて（サンプルの多くを短時間で製造することを可能にする、細胞の急速なカプセル化のために使用することができます複数の）そのようなフローサイトメトリーまたはqPCRのような多数の細胞を必要とする実験のために使用することができます。その後、これらのゲルは、その後、分化または浸潤のような所望の細胞応答を誘発するために、生化学的手がかりを用いてパターニングすることができる。30,31 生存率および代謝活性のためのアッセイは、提示された資料システムとパターニングの条件のための細胞の生存率を示しています。代謝活性が細胞機能に対する重合及びパターニング条件の初期効果を評価するために、非分解性ゲル（RGKGRKペプチド架橋）で3日目までモニターしたことに注意してください。また、分解性ペプチドの架橋（GPQGIWGQ）を用いて製剤化ゲル中のポストカプセル化は、細胞が生存し、培養液中で1週間で広がって残ることをサポートしている1と6日目のhMSCの膜完全性アッセイ（生/死生存性/細胞毒性染色）。追加の細胞株の生存率と同様の条件32を光パターンについて報告されていますここで使用され、生/死染色および代謝活性アッセイを用いて説明したヒドロゲル系について評価することができます。我々は、この材料系と関連する手順（4.2および4.3）を使用して、細胞生存率の問題は観察されなかったが、いくつかの細胞種は、フリーラジカルおよび/または露光に敏感であってもよいです。この場合、ユーザーは、アジド-アルキン、12 FXIII、31またはディールス・アルダーベースのヒドロゲル形成の化学的性質などの非光開始材料系を使用して検討すること。33 ゲル内の生化学的手がかりのパターンを検出し、定量化する容易な技術はまた、（3.1と3.2）を提示されています。試薬は市販されており、余分な合成処理工程以上の高価な試薬（ 例えば 、蛍光標識ペプチド）が必要とされないので、エルマンアッセイは、特に重要です。エルマンアッセイが正確にdiffere下生化学的手がかりと遊離チオールの変更を決定することができますntの条件を光パターンだけでなく、急速にパターンを可視化します。パターニングの前と後のペプチドの取込み、チオール官能基の濃度を定量するために、ペプチドの取り込みの定量的尺度として、直接エルマンアッセイにより評価されます。定量化のこのタイプは、蛍光標識されたペプチドを用いて行うことができるが、34撮像系の定量は、より多くの時間がかかるハンドリング及び分析手順（ 例えば 、ペプチド濃度に蛍光を関連付ける較正曲線の蛍光標識ペプチドおよび生成の合成を必要とします）画像解析を使用して。撮像ペプチドの取り込みのために、エルマン試薬を直接試料に適用し、即座に視覚化することができます。パターンの可視化のためのxおよびy平面に制限しながら、この技術は、遊離チオール基を含有するマトリックスがパターニングされているかどうかを決定するために、単純なルーチンの方法として使用することができます。エルマンアッセイをcではないことに注意することが重要ですそれはphotopatternsを観察し、定量化するために使用することができるが、それは細胞の存在下で行うことができないので、細胞適合性onsidered。三次元で、細胞の存在下でのパターニングを撮像するため、ヒドロゲルマトリックス内の蛍光性ペプチドの結合は強力で広く使用されるアプローチのままです。パターンの解像度は、y軸、x軸に評価することができ、Z平面共焦点顕微鏡を使用して、パターニング領域または非パターン領域内の細胞を同定することができるように、この方法は、細胞適合性です。まとめると、エルマンアッセイおよびイメージングベースの技術は、研究者は材料系内の両方の定量的および定性的生化学的手がかりの光パターンを評価するための補完的なツールです。 Photoclick、またはより広く光開始は、細胞の存在下でヒドロゲルの形成と修正のための化学物質は多数あります。ここに提示成形、カプセル化、およびパターニング技術は、LIMではありません説明材料系へitedとは、チオール-アルキン、35アジド-アルキン、4および他のチオール-エン化学的性質（ 例えば 、チオール-ノルボルネン）、10,13と同様のように代替光ベースの化学薬品に適用することができますこのようなイルガキュア2959、エオシンY、およびカンファーキノンなどの異なる光開始剤、。 、ユーザーがプロシージャのパラメータを調整する必要があります（ 例えば 、インキュベーション時間、重合時間、細胞密度は）条件が、これらの他のシステムのための細胞適合性のままであることを確認します。パターニング工程は、ヒドロゲル（2.2.3-2.2.5）にALLOC修飾ペプチドの拡散を必要とするので、この方法は、インテグリン結合部分（ 例えば 、ペプチドまたは細胞外マトリックスタンパク質の添加のために最も有用であろうネットワークへのリガンドの結合は、細胞と完全なインテグリン活性化による牽引力の生成に必要とされるヒドロゲル、にフラグメント）。36注意、生体分子のためのものかもしれません溶液中または固定化（ 例えば 、成長因子またはサイトカイン）の際にも同様にアクティブで、ヒドロゲルへの部分拡散（〜1時間）のためのインキュベーション工程は、パターニング結果を畳み込むシグナル伝達事象につながる可能性があります。他の方法は、そのパターニングのための成長因子の固定化やローカル隔離のために確立されている。37-39はさらに、パターン解像度は、露光量の制御によって決定されます。ここでは、フォトマスクは、ゲルの深さを通って、x軸とy平面内でパターンを作成できます。しかしながら、ゲル内の生化学的手がかりのパターニングをより空間的制御は、x方向におけるパターン、y軸、およびZ-面を生成するために二光子共焦点顕微鏡を使用するように照射する別の方法で達成することができる。34,40最後に、この手順内で利用される材料システムのみ最初に生化学的合図で修飾されている間、直交photoclick化学は、アルテを可能にするために使用することができることに注目することが重要です時間をかけて行列のプロパティで配給。12ここで紹介する手順および技術は、明確に定義されたと時空間制御特性を有する合成行列を作成するための現在のアプローチに多様性を追加します。特に、この手順内で使用される試薬および材料の商業的利用可能性は、制御された細胞培養液中のアプリケーションのためのハイドロゲルベースの生体材料の使用に興味を持つ研究者の広い範囲に有用であろう。

化学的性質がますます薬物送達、組織工学、および制御された細胞培養、それらの選択のために、効率的で、多くの場合、細胞適合性反応性を含む多くの生物医学的用途のための材料の設計に使用されている。光を利用1-3 Photoclick化学をトリガするためにクリックしますか、反応（ 例えば 、アジド、アルキン、4チオール-エン、5及びテトラゾール-アルケン6）生体材料の形成または改変するために特に重要である開始します。温和な条件といつ、どこで、彼らは光で場所を取るの制御下に急速な速度の細胞の存在下での生体材料特性のユーザー主導の制御のためのこれらの反応はよく適合させる。具体的には7,8-、チオール-エンphotoclick化学物質が使用されてきましたない堅牢な機械的性質5,9とを含むが、細胞型の多様なカプセル化のためのヒドロゲル系生体材料を生成しますまた、これらの化学物質は、の重要な局面を模倣するために、生化学的手がかりの空間的なパターニングのために使用されているT細胞培養および送達のための約束で、ヒト間葉系幹細胞（hMSC）、線維芽細胞、軟骨細胞、および膵臓細胞に制限。10,11天然の細胞の微小環境との密着性、分化、および浸潤などの適切な細胞-マトリックス相互作用を促進。3,12 光とのチオール-エンヒドロゲルの構築のために、システイン（チオール）を含むペプチドは、一般的に細胞適合性の条件下で迅速な、光開始重合のためのアクリレート又はノルボルネン（ &#39;エン&#39;）で官能化ポリマーと反応させる。13このツールボックスを展開する、我々が確立することを求めて最小限の合成処理を必要または合成細胞外マトリックスとしての幅広い使用に向けて市販されていた新しい多機能でアクセス可能なビルディング・ブロックとヒドロゲル形成のための方法。[非分解性または細胞分解性架橋のためKを（細胞接着[K（アロケーション）GWGRGDS = Pep1Alloc]または2を促進するためのペンダントのための1、インテグリン結合グループ：14具体的には、ペプチドは、（のAlloc）アリルオキシカルボニルで変更されたがリジンを-保護しましたALLOC）RGKGRKGK（アロケーション）GまたはKK（ALLOC）GGPQGIWGQGK（アロケーション）K = Pep2Alloc、それぞれ]。これらの配列を用いて、条件が長波長UV光（365 nmでの10ミリワット/ cm 2）での細胞適合性の用量を使用して、4つのアームチオール変性ポリ（エチレングリコール）（PEG4SH）と急速反応（1~5分）のために確立されたと光開始剤、リチウムフェニル-2,4,6- trimethylbenzoylphosphinate（LAP）。得られたヒドロゲルは、週間の細胞培養条件下で安定でした。電池駆動型の分解と再構築を有効にするには、酵素的に切断可能なペプチドは、ゲルの架橋（ すなわち 、GPQGIWGQ）、15モデルの一次細胞、ヒト間葉系幹細胞（hMSC）内に組み込まれた、ドゥリンカプセル化と後に非常に実行可能なままでしたこれらのマトリックス内グラム文化。さらに、ペプチドは、空間的に、これらの材料の中にパターン化されており、およびhMSCのは、光パターニングの条件の下で生存可能で代謝的に活性なままです。 （ 例えば 、IKVAV、YIGSR、GFOGER）ここには示されていない代替のペンダントペプチド配列もまた、周囲の微小環境との追加の細胞相互作用を調べるためにマトリックス内に組み込まれてもよいです。これらの結果は、種々の細胞型のために研究するための三次元（3D）細胞培養および送達のためのこれらのヒドロゲル系材料の適用及び直接細胞 - マトリックス相互作用のために有望です。 ここで、方法は、細胞をphotoencapsulateし、提案されたヒドロゲル系内その後photopattern生化学的手がかり（ 図1）に提示されています。これらphotopatternsを観察し、定量化するための技術も実証されています。特に、i）は modificaを決定するために、エルマンアッセイの定量的および定性的使用パターニングされた基板と、蛍光性ペプチド（AF488Pep1Alloc）のii）の相補的な定性的な使用中の遊離チオールの化は、3次元でこれらのパターンを観察しました。さらに、アッセイは、生存率（生/死生存率/細胞毒性染色）および代謝活性を決定するために（MTS; 3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-5-（3-カルボキシメトキシフェニル）-2-（4-スルホフェニル） -2H-テトラゾリウム）ユーザはヒドロゲルマトリックス内の異なる細胞株について光封入及び光パターニング条件の細胞適合性を決定することができるように提示されています。プロトコルが容易な光ベースphotoclickヒドロゲルシステムについて示されているが、この技術は、細胞の存在下で光封入し、光パターンのための多数の他のラジカル開始ヒドロゲルシステムに適用することができます。

<table><tbody><tr><td>カスタムペプチド</td><td>さまざまなベンダー</td><td>----</td><td>ペプチドは、ChemImpexやChemPepなどのベンダーの材料を使用して、標準的なSPPS技術で合成することもできます。</td></tr><tr><td>4アームPEG Thiol, MW 20k</td><td>JenKem USA</td><td>4ARM-SH</td> マルチ<td>アームホモファンクショナルPEGsの下にリストされています。PEG4SHは、前述のように合成することもできる。</td></tr><tr><td>リチウムフェニル-2,4,6-トリメチルベンゾイルホスフィン酸</td><td>コロラドフォトポリマー溶液</td><td>Li-TPO</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルフェニルホスフォナイト</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>149470</td><td>注意、重度の皮膚火傷や目の損傷を引き起こします。保護手袋、衣服、目の保護具を着用してください。</td></tr><tr><td>2,4,6-塩化トリメチルベンゾイル</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>682519</td><td>注意、重度の皮膚火傷や目の損傷を引き起こします。保護手袋、衣服、目の保護具を着用してください。</td></tr><tr><td>臭化リチウム</td>シ<td>グマアルドリッチ</td><td>213225</td><td></td></tr><tr><td>2-ブタノン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>360473</td><td></td></tr><tr><td>フラスコ、丸底、100&nbsp;ml</td><td>Chemglass</td><td>CG-1506-05</td><td></td></tr><tr><td>80 ml フィルター漏斗、ブフナー、ミディアムフリット</td><td>ケムグラス</td><td>CG-1402-L-02</td><td>必要に応じて、通常のガラス漏斗内の濾紙を使用できます。</td></tr><tr><td>マグネティックスターバー</td><td>各種ベンダー</td><td>----</td><td></td></tr><tr><td>マグネティックスターリング&ホットプレート</td><td>各種ベンダー----</td><td></td><td></td></tr><tr><td>真空デシケーター</td><td>各種ベンダー</td><td>----</td><td></td></tr><tr><td>酸化重水素</td><td>アクロス オーガニックス</td><td>16630</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン ストレプトマイシン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>ファンジゾン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA (0.5%)、フェノールレッドなし</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15400-054</td><td>細胞の種類に応じて、適切な培地とトリプシンを選択します。</td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ</td><td>様々なベンダー</td><td>----</td><td>1.5または2mlサイズ、滅菌済み。</td></tr><tr><td>スリップ(ルアー)チップ付きBDシリンジ(針なし)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-823-16H</td><td>ここに記載されている製品番号は1mlシリンジ(16H)用で、さまざまなサイズが利用可能です(14-823-XX)。</td></tr><tr><td>Fisherfinest プレミアム プレーン ガラス顕微鏡スライド</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>12-544-1</td><td></td></tr><tr><td>高純度シリコーン ゴム、厚さ 0.010"、厚さ 6" x 8" シート、55A デュロメーター (ガスケット)</td><td>McMaster Carr</td><td>87315K62</td><td></td></tr><tr><td>エタノール、200 プルーフ</td><td>デコン ラボ</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>RainX、オリジナル</td><td>アマゾン</td><td>800002243</td><td>他のベンダーから購入できます。</td></tr><tr><td>シグマコート</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>SL2</td><td></td></tr><tr><td>フォトマスク</td><td>アドバンス リプロデューティクス コーポレーション</td><td>----</td><td>フォトマスク事業部では、必要に応じて異なるデザインを印刷することができます。</td></tr><tr><td>DTNB;エルマン試薬;5,5-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)</td> <td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>PI-22582</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム 二塩基性</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム/ペレット/認定 ACS</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S318</td><td></td></tr><tr><td>オルトリン酸</td><td>アルファ エーザー</td><td>33266</td><td></td></tr><tr><td>システイン塩酸塩一水和物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7880</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 生存能力/細胞毒性キット、哺乳動物細胞用</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>L-3224</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter 96 水性ワンソリューションアッセイ</td><td>プロメガ</td><td>G3582</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離</td>機 <td>様々なベンダー</td><td>----</td><td>90-110 x gの速度が可能。</td></tr><tr><td>マルチウェルプレートリーダー</td><td>様々なベンダー</td><td>----</td><td>96ウェルプレートの405nmの吸光度を読み取ることができます。</td></tr><tr><td>エピ蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡</td><td>さまざまなベンダー</td><td>----</td><td>ハイドロゲル内のペプチドパターンと細胞を視覚化します。</td></tr><tr><td>Omnicure Exfo Series 2000</td><td>Excelitas Technologies</td><td></td><td>----Alternate light systemsを使用して、ハイドロゲルを重合することができます。</td></tr><tr><td>Zeiss Zen Lite Software</td><td>Zeiss</td><td>----</td><td>zeiss.com で入手可能、Zeiss顕微鏡で撮影した画像に対応</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>----</td><td>imagej.nih.gov で入手可能、一般的な画像解析に対応</td></tr></tbody></table>

細胞培養アプリケーションのためのヒドロゲルの光媒介形成とパターニング

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

クリック化学は、薬物送達、組織工学、細胞培養物を含む多くの生体材料用途において使用するために研究されてきました。特に、このような光開始チオール - エンおよびチオールYNE反応のような光媒介クリック反応は、材料特性以上の時空間的な制御を与えると、ユーザ指向特性制御度の高いシステムの設計を可能にします。光とこれらのチオール-Xのphotoclick化学反応によって提供される汎用性によってもたらされる精度を使用してハイドロゲルベースの生体材料の作製と修正は、特に明確に定義された、生体模倣微小環境内の細胞の培養のために、成長して注目されています。ここでは、細胞およびチオール - エンphotoclick反応により重合汎用性とモジュラービルディングブロックを使用して、ヒドロゲルマトリックス内の生化学的手がかりのその後の光パターニングの光封入するための方法を説明します。具体的には、アプローチは共同のために提示されていますアリルオキシカルボニルからnstructingヒドロゲル（のAlloc）-functionalizedペプチド架橋及びペンダントペプチド部分と迅速リチウムacylphosphinate光開始剤と長波長紫外線（UV）光の細胞適合性用量の存在下で重合チオール官能化ポリ（エチレングリコール）（PEG）。光パターンを視覚化し、追加のペプチドの濃度を定量するための簡便な技術が記載されています。さらに、方法は、細胞、特にヒト間葉系幹細胞をカプセル化するために確立され、そしてそれらの生存能力および活性を決定しています。チオールALLOCヒドロゲルの形成および初期のパターニングは、ここで示されているが、これらの技術は広く、パターン化基板を生成する他の光とラジカル開始材料系（ 例えば 、チオール-ノルボルネン、チオール-アクリレート）の数に適用されてもよいです。

セットアップ手順は、図1に示されている細胞およびカプセル化された細胞を含むその後photopatternゲルphotoencapsulateし、ストック溶液を調製するための例は、10重量％のゲルは、表1に提供されて形成する。 表1を用いて、単量体の量（PEG4SHをヒドロゲルを重合するのに必要なPep2Alloc、±Pep1Alloc）および光重合開始剤（LAP）を算出します。これらの計算に基づいて、PEG4SH、Pep1Alloc、Pep2Alloc、およびLAPの原液は、それぞれ、ゲルを形成し、フォトパターニングのためPep1Allocととせず（ 図1A）を用意し、混合されています。続いて、細胞をプレートから採取し、計数し、カプセル化（ 図1B）のために適切な量で遠心分離します。細胞ペレットは、ゲル形成溶液（PBS中のペプチド/ポリマー/ LAP）に再懸濁され、そして細胞/モノマー混合物は、ガラスまたはシリンジモルに転送されますDS。細胞は（10ミリワット/ 365nmのcm 2の1-5分）（ 図1C）、光の印加時にヒドロゲル内にカプセル化されています。 （ 図1D）をフォトパターニングするために、ゲルを重合マトリックス中にペプチドおよび開始剤の拡散を可能にする、1時間30分間、30分間Pep1Alloc及びLAPに浸漬されています。これらのペプチドを含んだゲルは、所望のパターンを有するフォトマスクで覆い、マトリックス内遊離チオールにペプチドを結合するために光の第2用量（1分）にさらされています。ペンダントテザーにのみ共有結合適切な細胞-マトリックス相互作用を促進し、in vitroで細胞機能と運命をプロービングに向けた天然の細胞の微小環境の重要な機械的および生化学的特性を模倣する、光に露出した領域にゲルにリンクされています。 エルマンアッセイはphotopatte内のゲル修正およびペプチドの取り込みを定量化するための容易かつ安価な方法を提供し、rned基板。パターン化および非パターンゲル（ペプチドの改変の有無にかかわらず、すなわち 、ゲル）をエルマン反応緩衝液後重合中に浸漬されています。次に、システイン標準バッファに浸したゲルは、48ウェルプレートに入れ、エルマン試薬（左図2A）とインキュベートします。 1時間30分後、試料のアリコートを、96ウェルプレートの個々のウェルに入れ、吸光度を405nmで記録されています。システイン標準の較正曲線（ 図2A、右）は（吸光度線形フィット、濃度対）にプロットされ、そしてゲル中の遊離チオールの量は、それらの希釈係数に基づいて決定することができます。 10重量％のゲルの種々の重合及び光パターン条件のために、これらの遊離チオール濃度は、 図2Bに示されています。 Pep1Allocなし1または5分間重合ゲル（青いバー、I = 1分およびII = 5分）トンを示す、統計的に同様の遊離チオール濃度を有します帽子急速な反応が起こり、ゲル化は1分（両側t検定、p&gt; 0.05）以内に完了する。このように、光（2-5分）への追加の暴露は、官能基の更なる変換にはなりません。 Pep1Allocなしで1分間重合ゲルは、30〜90分間（3 mg / mlで）およびLAP（2.2ミリモル）（緑色のバー、II = 30分とIV = 90分）Pep1Allocに浸漬し、光の第2の用量に曝露しました1分間。遊離チオールの減少（1分の条件に対して60から80パーセント）は、これらの条件下でペンダント手がかりとゲルの効率的な変更を示します。より高い変更が望まれる場合、Pep1Alloc溶液の濃度は、多くのペプチド溶液は、変換を制限し得る希釈中の遊離チオールへPep1Allocのアクセスとして使用することができる増加しました。例えば、我々は、20 mg / mlで遊離チオールのPep1Allocプロデュース&gt; 90％の変換までの濃度のことを見出しました。 ユニーク、ペプチドのパターンは、ヒドロゲル月に追加しました急速にエルマン試薬（5分下の図3A）で画像化します。しかし、パターンの可視化は、ゲルを通して黄色のTNB の2-ジアニオンの拡散に起因した時間（5分より大きい）の上に失われます。撮像分解能を向上させ、三次元（X軸、Y軸、Z面）に、細胞の存在下でパターンを観察するため、蛍光性ペプチドの付加（AF488Pep1Alloc）が利用されてもよいです。 図3Bの x軸では、共焦点顕微鏡で撮影した画像スタックのy軸およびz突起はパターン解像度（ミクロンスケール）を実証し、示されています。 約（94±2）％と（94±1）分解性ゲル内に封入されたhMSCの％は、（Pep2Alloc = GPQG↓WGQ）少数の死細胞（赤核に、それぞれ、生存したままで（緑色細胞体）1と6日封止後）（ 図4A）を観察しました。さらに、hMSCのは、拡散は（6日後のカプセル化で観察されます<st<html>栄&gt;図4A、挿入図）、細胞は改造とインテグリン結合RGDSで変性されたこれらのMMP-分解性マトリックスと相互作用することができることを示しています。非分解性ゲル（Pep2Alloc = RGKGRK）でカプセル化された細胞で実施代謝活性アッセイ1および3日後にカプセル化（ 図4B）細胞生存率の第二の手段を提供し、細胞を、試験した様々な光封入し、光パターンの条件のためのアクティブなままであることを実証エルマンアッセイ（ 図2B）。特に、Pep1Alloc + LAP（条件III及びIV）及び初期封入（条件I及びII）との30分および90分のインキュベーションの間の代謝活性に有意差は手順が光パターニングの用途において適していることを示す、存在しません封入された細胞（両側t検定、p&gt; 0.05）の存在。 2fig1.jpg &quot;/&gt; 図1：マクロマー及び光開始剤のヒドロゲル内のセルをカプセル化し、その後の生化学的手がかりと光パターンのセットアップ （A）ストック溶液を調製し、（PEG4SH =バックボーン、Pep2Alloc =架橋、Pep1Alloc =ペンダント接着部分（RGDS）、LAP =光開始剤混合）。 （B）細胞をカプセル化するために収集されます。 （C）細胞（それぞれ、PEG4SH / Pep2Alloc / LAPまたはPEG4SH / Pep2Alloc / Pep1Alloc / LAP）なしまたはインテグリン結合ペプチドとマクロマーソリューションと混合され、光への曝露時に封入されています。 ゲル形成の間に過剰なチオール基を含む（D）ゲル（ここで、2mMの過剰のチオールを用いて形成PEG4SH / Pep2Alloc / LAPが）、単一のAlloc基（Pep1Alloc、 例えば、で官能化ペプチドのその後の添加によって生化学的手がかりを用いてパターニングすることができますRGDS、IKVAV、 等 ）は、細胞接着を促進するためゲルの特定の領域内です。ここでは、蛍光標識されたRGDSを有するゲルのパターニングが示されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54462/54462fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54462/54462fig2.jpg" /> 図 2： 定量的なエルマンアッセイのセットアップとその結果をパターン化ハイドロゲルの変形を評価するための （A）ゲルおよびシステイン基準はエルマン試薬で48ウェルプレート中でインキュベートします。線形標準曲線は、ゲル試料中のシステイン濃度を決定するためにプロットされています。 II = 5分重合; III = 30分のインキュベーションPep1Allocと;（B）過剰遊離チオールは、ペンダントのalloc-ペプチド（I = 1分間の重合をパターニング時にゲル形成中のヒドロゲル内に組み込まれ、消費されたIV = 90分のインキュベーションのwi<html>第Pep1Alloc; IIIおよびIVの両方）を重合し、1分間光でパターン。示されたデータは、（n = 3）は標準誤差を示すエラーバーで平均値を示している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54462/54462fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54462/54462fig3.jpg" /> 図 3： エルマンアッセイおよび蛍光画像がフォトパターンヒドロゲルを可視化する （A）エルマン試薬は迅速にx方向におけるパターン（ライン）とy平面（黄色=パターン化されていない領域、スケールバー= 1 mm）を検出するために使用され得ます。 （B）蛍光ペプチドは、x軸、y軸、およびz平面（; 200ミクロンのスケールバー; 10X水浸漬対物; EX /エム525分の488 nmのグリーン=パターン領域）のパターンを観察するために使用されてもよいです。large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54462/54462fig4.jpg" /> 図4： 生存率と非分解光パターンヒドロゲル内の細胞の代謝活性 （A）は実施例の共焦点zスタック（Z-投影; 10X水浸漬対物レンズ）、生存の（緑; EX /エム525分の488 nm）を死にました。 hMSCは（赤; EX /エム580分の543 nm）は、ヒドロゲル内にカプセル化後24時間カプセル化（スケールバー= 200μm）で。 6日のカプセル化（挿入画像、スケールバー=50μm）をした後、これらのヒドロゲルの中に広がった細胞。 （; II = 5分重合I = 1分重合）とパターニング条件（III = Pep1Allocで30分間のインキュベーション（B）細胞は、1と3日（それぞれ明るさと暗さのバー、）種々の重合のためのポストカプセル化は、代謝的に活性であります; IV = 90分incubationはPep1Allocと。両方の）重合し、1分間光でパターン。示されたデータは、（n = 3）は標準誤差を示すエラーバーで平均値を示している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54462/54462fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="表1" src="/files/ftp_upload/54462/54462tbl1.jpg" /> 表1： ハイドロゲルを作製するためのストック溶液の体積を計算するための例のセットアップ青強調されているスプレッドシート内の細胞は、ユーザ定義のパラメータを示しています。他の量は、これらの設定に基づいて計算されます。ゲルを作るために、各ストック溶液の最終的なボリュームがオレンジ色で強調表示されます。白血球は、ユーザ定義のパラメータに基づいて最終的な体積を計算するために使用される数式を含みます。 2.2ミリモルのLAPの濃度が0.067重量％に相当することに注意してください。

私たちは、三次元細胞培養アプリケーションのための合成ハイドロゲルマトリックスの光媒介形成とその後の生化学的パターニングの連続的なプロセスについて説明します。細胞適合性フォトクリックケミストリーによるハイドロゲルの構築と修飾が実証されています。さらに、これらのハイドロゲル内のパターンを定量化および観察し、細胞生存率を決定するための容易な技術が紹介されています。

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

この手順の総合的な目的は、合成ポリマーベースの細胞外マトリックス内に細胞を形成、パターニングし、封入することです。この手法は、不均一な微小環境において細胞応答を調節する細胞外シグナルの同定に関する重要な生物学的課題を解決するために利用できます。本手法の主な利点は、標準的なプロトコルと入手可能な材料を用いて、細胞の封入および培養のための堅牢な合成マトリックスを生成できることです。この手法は、制御された細胞培養およびin vitroでの細胞応答の研究に使用できます。また、ドラッグデリバリーや組織工学を含む他のシステムにも適用可能です。テキストプロトコルに従って、ハイドロゲル形成のための材料を準備してください。すべてのサンプルにわたって比較的均一な光強度を確保するため、液体充填型ライトガイドの端にコリメートレンズを取り付けます。目的のサンプルをカバーするスポットサイズにするため、サンプルからライトガイドまでの距離を調整します。パターンのないハイドロゲルを作製するには、滅菌済みのカットシリンジのチップにゲル前駆体溶液を10から20 µLピペッティングし、シリンジチップ内で成形させた厚いハイドロゲルを準備します。体積とシリンジの直径に基づき、厚さが約0.5～1.5 mmになるように、シリンジ1本につき1つのゲルを作成します。コーティングされていないガラススライドの縁にゴムガスケットを配置し、ガラススライドモールドで薄いハイドロゲルを調製します。次に、ゲル前駆体溶液を5～10 µL、コーティングされていないガラススライド上にピペットで分注します。そして、非粘着コーティングを施したガラススライドをゲル溶液の上に置きます。小型のバインダークリップでガラススライドを固定し、安定させます。シリンジチップ型またはガラススライド型の場合、ゲルの表面で10 milliwatts per square centimeterになるようにランプ強度を設定します。ラジオメーターを用いて強度を測定します。その後、型をランプの下に配置します。ゲルを完全に重合させるため、1〜5分間光を照射します。ポリエチレングリコールテレフタレート含有量が高いゲルには、より短い重合時間を設定してください。また、含有量が低いゲルには、より長い時間を設定して、軟組織の範囲内の弾性率を持つ完全に重合したハイドロゲルを作製します。シリンジチップ型で成形したゲルを、滅菌済みの非処理48ウェルプレートに移し、ガラススライドを滅菌済みのディッシュに配置します。パターン化ハイドロゲルを調製するには、テキストプロトコルに従って前駆体溶液を調製し、溶液が均一に混合されるようにピペッティングを激しく行います。次に、あらかじめ形成したゲルをペントンペプチド含有リン酸リチウム光開始剤溶液で覆い、37 °Cで1時間インキュベートします。インキュベーション後、余剰な溶液を除去します。シリンジチップ内でゲルを成形した場合は、スパチュラを用いて48ウェルプレートから滅菌済みのガラススライドへ慎重に転写し、パターニングを行います。希望するパターンのフォトマスクを、シリンジおよびガラススライドで成形したゲルの直上に配置します。パターンの再現性を最適にするため、マスクの印刷面がゲルに接触していることを確認してください。サンプルをランプの下に置き、1分間照射します。パターニング後、シリンジで成形したゲルを、滅菌済みの48ウェル非組織培養処理プレートに移します。ガラススライドに付着したガラススライド成形ゲルは、滅菌ディッシュに移します。培養液または計画した実験に応じた適切なバッファーを用いて、15分間の洗浄を3回行います。フォトパターニングされたハイドロゲル中の遊離チオールの検出および定量を行うには、まずテキストプロトコルに記載されている通りに溶液を調製し、計算を行ってください。前述と同様に、パターニング用の薄いハイドロゲルを作製します。具体的には、過剰な遊離チオールを含むゲルを作製し、これらのサンプルの半分に、透明なカバーガラスを用いてゲル全体に光を完全に照射し、ペントンペプチドでパターニングを行います。パターニング済みおよび未パターニングのゲルを48ウェルプレートのウェルに配置します。末端反応種をゲル外に拡散させ、平衡膨潤を起こさせるため、Ellman's反応バッファーで15分間の洗浄を3回繰り返します。洗浄済みゲルの膨潤後の体積が20 µLの倍数になるように、Ellman's反応バッファーを追加します。例えば、予想されるゲルの膨潤体積が15 µLである場合は、5 µLの反応バッファーを追加します。また、予想されるゲルの膨潤体積が30 µLである場合は、10 µLの反応バッファーを追加してください。sistine標準液を48ウェルプレートの各ウェルに20 µLの倍数で分注します。前ステップで使用した量に応じて調整してください。例えば、前ステップでの膨潤ゲルの量に反応バッファーを加えた合計が40 µLであった場合は、各標準液40 µLを空の各ウェルに添加します。次に、エルマン試薬と反応バッファーを希釈します。希釈したエルマン試薬を、標準試料およびサンプルが入ったウェルに加えます。20 µLのサンプルの場合は、各ウェルに183.6 µLの溶液を加えます。ゲル由来の遊離チオールとエルマン試薬の反応によって生成される黄色い2-Nitro-5-thiobenzoic dianionが十分に拡散するように、1時間30分間、または目視で溶液の色がゲルの色と一致するまで、インキュベートするかシェーカーに置きます。サンプルおよび標準液から100 µLの溶液を分注し、96ウェルプレートのウェルに入れます。プレートリーダーを用いて、405 nmにおける吸光度を測定します。フォトパターンを可視化するため、ティッシュでハイドロゲルの縁を軽く拭き取り、過剰な反応バッファーを除去します。エルマン試薬をゲルの表面に直接ピペッティングします。直ちに、10倍の光学顕微鏡またはカラーカメラ付き実体顕微鏡で撮影してください。テキストプロトコルに従って細胞を回収し、カプセル化の準備を行います。PBSを吸引した後、直ちにペレット化した細胞を前駆体溶液に懸濁し、最終濃度を5,000 cells/µLに調整します。後のペントンペプチドとの反応のために、適切な濃度の遊離チオールを残しておいてください。光パターニングを行う場合は、前述と同様にハイドロゲルの成形、重合、およびパターニングを行います。パターニング後、未反応種および過剰なリチウムリン酸光開始剤を除去するため、成長培地で10分間の洗浄を3回繰り返します。ゲルを増殖培地に入れ、37 °C、5% CO2条件下で、さらなる解析のための所定の時間点までインキュベートします。培地は48時間ごと、またはアプリケーションで決定した間隔で補充してください。封入細胞の生存率を測定するには、まずゲルから増殖培地を除去し、PBSで15分間の洗浄を3回行い、ゲル内から培地を拡散・除去させます。解凍した2 mM ethidium homodimer-1を2 µL、および解凍した4 mM calcium AN溶液を0.5 µL、1 mLの滅菌PBSに加えます。ボルテックスミキサーで完全に混合させます。48ウェルプレート内の各シリンジモールドゲルに、調製した溶液を300 µLずつ、または滅菌ディッシュ内のガラススライド上のゲル表面が覆われる十分な量を加えます。その後、45分間インキュベートします。余分な溶液を除去し、ゲルから過剰な染料を取り除くために洗浄します。共焦点顕微鏡を用いて細胞をイメージングします。または、10倍の倍率、488 nanometerの励起波長、および525 nanometerの蛍光波長を備えた落射蛍光顕微鏡を用いて観察します。Ellman's法で定量した非パターニングおよびパターニング済みハイドロゲルの遊離チオール濃度から、1分間および5分間重合させたハイドロゲルの遊離チオール濃度に統計的な差がないことが示され、1分以内に迅速な反応と完全なゲル化が起こることが明らかになりました。ペントンペプチドで30分間および1時間30分間インキュベートしたゲルに対して、その後バルクパターニングを行ったところ、遊離チオール濃度が60〜80%減少しており、過剰なチオールが効率的に修飾されたことが示されました。マスク（ここでは線状にプリント）で覆ったサンプルに光を照射して形成されたフォトパターンは、エルマン試薬を用いることで二次元的に観察できます。また、その後のイメージングで蛍光ペプチドを導入することにより、三次元的な観察も可能です。ハイドロゲル内に封入された成人ヒト幹細胞に対し、生存率およびハイドロ毒性染色を行い、共焦点顕微鏡で撮像した。膜損傷のない生存細胞は緑色に標識されており、封入から1日後の細胞の生存を示している。カプセル化から6日後、細胞はマトリックス内で広がり始めます（挿入図に提示）。この手順を行う際は、汚染物質の混入や機械的なせん断によるカプセル化後の細胞への損傷を防ぐため、無菌状態を維持し、慎重に取り扱うことが重要です。本手順に続き、免疫染色、フローサイトメトリー、遺伝子発現解析などの他の手法を行うことで、細胞外環境に応答した細胞機能や運命を研究することができます。この技術は、生物学、バイオエンジニアリング、医学分野の研究者が、ユーザー定義の特性制御が可能な合成細胞外マトリックスを用いて組織領域の侵食や疾患の進行を研究することを可能にし、新たな治療戦略の開発への道を開くものです。このビデオを視聴することで、細胞の封入方法および制御された細胞培養研究のためのソフトマトリックスのパターニング方法について、十分に理解できるはずです。

light-mediated-formation-patterning-hydrogels-for-cell-culture

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

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機械的にダイナミックな細胞培養のための微細加工プラットフォーム

簡単なテクニックは、通常の細胞培養基板上への動的なマスク投影リソグラフィ用デジタルマイクロミラーデバイスを用いた微細加工神経培養システムの急速な生産のために説明されています。これらの培養系は、天然の生物学的なアーキテクチャのより代表的かもしれない、と説明された技法は数多くのアプリケーションに適応することができます。...

動的なマスク投影リソグラフィーを用いたニューラル培養システムのためのマイクロパターンハイドロゲルの作製

bioprinter、犠牲型に基づいてパターン化されたハイドロゲルを作成するために使用された。ポロキサマー型は第二のヒドロゲルで埋め戻した後、溶出し、第三のハイドロゲルを充填した空隙を残していた。この方法では、生体高分子から複雑なアーキテクチャを生成する高速溶出及びポロキサマーの良い印刷適性を使用しています。...

模様の作成3D細胞培養のための2つの成分​​のために温度応答性ハイドロゲルリバース金型の印刷

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マイクロパターンマクロスケール3D細胞構造のためのモジュラーヒドロゲルシートの構築

蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）画像化は、リアルタイム細胞生物学研究のための強力なツールです。ここで、従来の落射蛍光顕微鏡を用いて生理学的3次元（3D）ヒドロゲル微小環境におけるFRETイメージング細胞のための方法が提示されます。活性範囲にわたって線形比率をもたらすレシオメトリックFRETプローブの分析が記載されています。...

三次元ハイドロゲルでイメージングをFRET

これは、肺の細胞外マトリックスからの3次元細胞培養の足場を作成するための方法です。無傷の肺は、三次元での細胞の増殖を支持することができるヒドロゲルに加工されます。...

3D細胞培養のための肺細胞外マトリックスから調整可能なヒドロゲル

蛋白質ベースのヒドロゲルの三次元のアーキテクチャを操作するさまざまな方法は、材料特性に関してここで評価されます。マクロポーラス ネットワーク修飾が細胞接着ペプチドと細胞培養での実現性は、2...

細胞培養用ヒドロゲルの蛋白質ベースのアーキテクチャの簡単な操作

この方法は、光重合を用いてクリック化学の手法を提供するポリエチレング リコール (PEG) ゲルの表面にタンパク質やペプチドのパターンを作成する生体外での細胞の研究のため生体信号を固定化、.

生理活性タンパク質や生物学的応用の光化学ハイドロゲルのペプチドをパターニング

現在の二層文化モデルは模倣する生体内微小機能の in vitro研究できないようにします。ポリエチレング リコール、酸化亜鉛テンプレート...

デュアルのバイオミメティック基底膜として極薄 Porated 弾性ゲルの細胞培養

高分解光パタリングツールを利用して細菌細胞を単離するための光分解性ヒドロゲルの使用が報告されている。プロセスの基本的な実験手順、結果、および利点を検討します。この方法は、異種のコミュニティまたは集団からの稀またはユニークな機能を示す標的細菌の迅速かつ安価な分離を可能にする。...

細菌スクリーニング、選択、および分離のための光分解性ヒドロゲルインターフェース

学ぶ、光媒介によるヒドロゲルの形成とパターニング法を用いた三次元細胞培養技術。シトコンパチブルな光クリック化学により、細胞封入と生体材料パターニングを制御可能にし、組織工学や創薬研究に応用できます。

細胞培養アプリケーションのためのヒドロゲルの光媒介形成とパターニング

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