細胞培養アプリケーションのためのヒドロゲルの光媒介形成とパターニング

この手順の全体的な目標は、合成ポリマーベースの細胞外マトリックス内で細胞を形成、パターン化、およびカプセル化することです。この方法は、不均一な微小環境内の細胞応答を調節する細胞外の手がかりの特定に関連する重要な生物学的問題に対処するために使用できます。この技術の主な利点は、プロトコールとアクセス可能な材料を使用して、細胞のカプセル化と培養のために堅牢な合成マトリックスが生成されることです。

この方法は、制御された細胞培養やin vitroでの細胞応答の研究に使用できます。これは、ドラッグデリバリーや組織工学などの他のシステムにも適用できます。テキストプロトコールに記載されているように、ヒドロゲル形成のための材料を準備します。

液体充填ライトガイドの端にコリメートレンズを取り付けて、すべてのサンプルで比較的均一な光強度を確保します。サンプルからのライトガイドの距離を調整して、目的のサンプルをカバーするスポットサイズを実現します。パターン化されていないハイドロゲルを作製するには、滅菌切断シリンジの先端に10〜20マイクロリットルのゲル前駆体溶液をピペッティングすることにより、シリンジチップで成形した厚いヒドロゲルを調製します。

シリンジごとに1つのゲルを作成し、容量とシリンジの直径に基づいて、厚さが約0.5〜1.5ミリメートルになるようにします。スライドガラスの型に薄いハイドロゲルを調製するには、コーティングされていないスライドガラスの端にゴム製のガスケットを配置します。次に、5〜10マイクロリットルのゲル前駆体溶液をコーティングされていないスライドガラスにピペットで移します。

そして、ゲル溶液の上に粘着防止剤をコーティングしたスライドガラスを置きます。スライドガラスを小さなバインダークリップで固定して安定させます。シリンジチップ型またはガラススライド型のゲル表面で10ミリワット/平方センチメートルを達成するようにランプ強度を設定します。

放射計を使用して強度を検出します。そして、型をランプの下に置きます。1〜5分間光を当てて、ゲルが完全に重合します。

ポリエチレングリコールテレフタレート含有量が高いゲルには、より短い重合時間を使用してください。また、含有量の少ないゲルが軟組織の範囲内で弾性率を持つ完全に重合したハイドロゲルを生成するのに時間がかかる。シリンジチップ型からのゲルを滅菌されていない未処理の48ウェルプレートに入れ、スライドガラスを滅菌皿に入れます。

パターン化されたハイドロゲルを調製するには、テキストプロトコールに記載されているように前駆体溶液を調製し、溶液を激しくピペットで動かして、溶液が均一に混合されるようにします。次に、ペントンペプチドを含ませた予め形成されたゲルをリン酸リチウム光開始剤溶液に覆い、摂氏37度で1時間インキュベートします。インキュベーション後、余分な溶液を取り除きます。

ゲルがシリンジチップで成形されている場合は、スパチュラを使用して、48ウェルプレートから滅菌ガラススライドに慎重に移し、パターニングを行います。希望のパターンのフォトマスクをシリンジとスライドガラス成形ゲルの上に直接置きます。最適なパターン忠実度を得るために、マスクの印刷部分がゲルに接触していることを確認してください。

サンプルをランプの下に置き、1分間放射します。パターニング後、シリンジ成形ゲルを滅菌済みの48ウェル非組織培養処理プレートに入れます。スライドガラスに接着したスライド成形ゲルを滅菌皿に入れます。

培養培地または計画された実験に基づく適切な緩衝液で3回、15分間すすぎます。フォトパターン化されたハイドロゲル中の遊離チオールの検出と定量を行うには、まず溶液を調製し、テキストプロトコルに記載されているように計算を実行します。以前と同様にパターニング用の薄いハイドロゲルを形成します。

具体的には、余分な遊離チオールを含むゲルを作成し、透明なカバースリップを使用してこれらのサンプルの半分をペントンペプチドでパターン化し、ゲル全体に光を完全に露光します。パターン化されたゲルとパターン化されていないゲルを48ウェルプレートのウェルに入れます。エルマン反応バッファーで15分間3回すすぎ、末端反応種がゲルから拡散し、平衡膨潤が起こるようにします。

リンスゲルにエルマン反応緩衝液を添加し、反応緩衝液を含む膨潤ゲル容積が20マイクロリットルの倍数になるようにします。例えば、膨潤したゲルの予測量が15マイクロリットルの場合、5マイクロリットルの反応バッファーを追加します。また、膨潤したゲルの予測量が30マイクロリットルの場合は、10マイクロリットルの反応バッファーを追加します。

システィーナ標準液を48ウェルプレートの個々のウェルに20マイクロリットルの倍数でピペットで入れます。前の手順で使用したボリュームによって異なります。例えば、前のステップでゲル量が膨潤し、さらに40マイクロリットルに等しい追加の反応バッファーがあった場合は、各標準試料の40マイクロリットルを個々の空のウェルに添加します。

次に、エルマン試薬と反応バッファーを希釈します。希釈したEllman's試薬を標準物質とサンプルを含むウェルに加えます。20マイクロリットルのサンプルの場合、各ウェルに183.6マイクロリットルの溶液を追加します。

エルマン試薬とゲルからの遊離チオールとの反応により生成される黄色の2-ニトロ-5-チオ安息香酸ジアニオンの十分な拡散を確保するために、1時間30分、または溶液の色が目視検査によってゲルの色と一致するまで、シェーカーでインキュベートまたは静置します。サンプルと標準液から100マイクロリットルの溶液を取り出し、96ウェルプレートのウェルに入れます。プレートリーダーで405ナノメートルの吸収性を読み取ります。

写真パターンを視覚化するには、ヒドロゲルの端をティッシュで優しく拭いて、余分な反応バッファーを取り除きます。エルマンの試薬をゲルの表面に直接ピペットで貼り付けます。すぐに10倍の光学顕微鏡またはカラーカメラ付きの実体顕微鏡で画像化します。

細胞を収集し、テキストプロトコルで説明されているようにカプセル化のためにそれらを準備します。PBSを吸引した直後に、ペレット化した細胞を前駆体溶液に懸濁し、最終濃度が1マイクロリットルあたり5,000細胞になるまでします。後でペントンペプチドと反応するために、適切な濃度の遊離チオールを残しておきます。

写真のパターン化が必要な場合。以前と同様に、ヒドロゲルを成形、重合、およびパターン化します。パターニング後、ゲルを増殖培地で10分間3回すすぎ、未反応の種と過剰なリン酸酸リチウム光開始剤を除去します。

ゲルを成長培地で摂氏37度、CO2濃度5%で、さらなる分析のために目的の時点までインキュベートします。培地は48時間ごと、またはアプリケーションによって決定された方法で補充します。カプセル化された細胞生存率を決定するには、まず増殖培地をゲルから取り出し、PBSで15分間3回すすぎ、ゲルから培地を拡散させます。

解凍した2ミリモルのエチジウムホモダイマー-1を2マイクロリットル、解凍した4ミリモルのカルシウムAN溶液を0.5マイクロリットルを1ミリリットルの滅菌PBSに加えます。完全な混合を確実にするためのボルテックス。48ウェルプレートの各シリンジモールドゲルに300マイクロリットルの定常溶液を追加するか、滅菌皿のスライドガラス上のゲルの表面を覆うのに十分な量を加えます。

そして45分間インキュベートします。余分なスタンディング溶液を取り除き、すすぎますことでゲルから余分な色素を取り除きます。共焦点顕微鏡で細胞を画像化します。

または、10倍の能力を持つ落射蛍光顕微鏡で。そして、488ナノメートルの励起と525ナノメートルの放射。エルマンで定量した非パターン化ヒドロゲルおよびパターン化ヒドロゲルの遊離チオール濃度は、最初に1分間高分子化したハイドロゲルと5分間の遊離チオール濃度が統計的に類似していることを実証し、迅速な反応と1分以内の完全なゲル化を示しています。

その後、ペントンペプチドとインキュベートしたゲルを30分間、および1時間30分間インキュベートしたゲルのバルクパターニングにより、遊離チオール濃度が60〜80%減少し、過剰なチオールが効率的に修飾されることが示されています。マスクで覆われたサンプルに光を当てて形成されるフォトパターンは、ここに線で印刷されていますが、エルマン試薬を塗布することで2次元で観察することができます。または、その後のイメージングに蛍光ペプチドを組み込むことで、3次元で。

ハイロゲル内にカプセル化された成体ヒト幹細胞を、生存率および水毒性染色剤で処理しました。そして、共焦点顕微鏡で画像化します。膜損傷のない生細胞は緑色で表示され、カプセル化後1日で細胞が生存していることを示します。

細胞は、カプセル化後6日でマトリックス内に広がり始めます。挿入図に示すように。この手順を試みる際には、汚染物質や機械的な薄片の導入によるカプセル化後の細胞への損傷を防ぐために、無菌で慎重な取り扱い手順を維持することを覚えておくことが重要です。

この手順に続いて、免疫染色、フローサイトメトリー、遺伝子発現などの他の方法を実行して、細胞外環境に応答した細胞機能と運命を研究することができます。この技術は、生物学、生物工学、医学の分野の研究者が、ユーザー定義の特性制御を使用して合成細胞外マトリックスの組織領域侵食または疾患の進行を研究し、新しい治療戦略の開発に向けて道を開くものです。このビデオを見れば、細胞をカプセル化する方法や、制御された細胞培養研究のためのソフトマトリックスのパターン化方法について十分に理解できるはずです。