Name: 家畜接合体におけるレーザーアシスト細胞質マイクロインジェクション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: 学ぶレーザーアシスト細胞質マイクロインジェクション法で家畜接合体に溶液を導入する技術。鈍端針とレーザーを用いてCRISPR Cas9などのゲノム編集ツールを効率的に送達し、遺伝子機能研究やトランスジェニック動物作出を支援します。

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この技術に関連する作業は、NIH/NICHD RO1 HD070044およびUSDA/NIFA HatchプロジェクトW-3171およびW-2112によってサポートされています。

1.マイクロピペット生産<ol><li>インジェクションマイクロピペット<ol><li>ホウケイ酸ガラスキャピラリー（：1.0ミリメートル、内径（ID）：外径（OD）0.75ミリメートル）を配置（左右キャピラリーホルダーの中央に）マイクロピペットプラーでは、それをロックします。 </li><li>それは長いタッパーと細い先端になるようにガラスキャピラリーを引っ張って適切なプログラムを使用してください。 （例：熱：825;プル：30;速度：120;時間：200;圧力：500）。 </li><li>慎重にデバイスからプルピペットを削除して、水平位置にマイクロフォージの上に置きます。 </li><li>焦点にそのガラスビーズと引っ張らピペットおよびマイクロフォージヒーターフィラメントを持参してください。所望の厚さを測定し、ヒーターフィラメントが目標内径（5ミクロン）まで水平にピペットを移動するために接眼レンズのレチクルを使用してください。 </li><li>約45％に熱を調整し、それがフィラメントに触れるようにそっとピペットをもたらします。簡単にヒーターをアクティブにします。このワット病気少しそれがフィラメントに付着するように、ピペットを溶融し、冷却時に、ピペットは、ストレートカットを生成する接触点で壊れます。 注：適切な温度を設定すると、ピペット曲げを行いますので、ストレートカットができなくなりますし、温度が低すぎるピペット（ 図1A）を溶融するのに十分ではない、あまりにも高温以来、この段階で鍵となります。 </li><li>ヒーターフィラメントから約10μm離れて、それを配置することにより、ピペットチップの近くに約30°の角度を作ります。 60％まで温度を設定し、ヒーターを作動させます。 注：これはフィラメントの上にピペットを曲げます。この角度は、インジェクタ（ 図1B）に取り付けられたときに、針の先端が注入板の面と平行になるように求められています。 </li><li>彼らは非常に鋭く、壊れやすいよう慎重にマイクロインジェクションピペットを扱います。 </li></ol></li><li>ホールディングマイクロピペット<ol><li> borosilicを配置（左右のキャピラリーホルダーの中央に）マイクロピペットプラーで、それをロックガラスキャピラリー（0.75ミリメートル：1.0ミリメートル、ID OD）を食べました。 </li><li> （200;プル815：20;速度：140;：：;時間圧力175：ヒート例）、それは長くても先細りと平行な壁の薄い先端になるようにガラスキャピラリーを引っ張って適切なプログラムを使用してください。 </li><li>慎重プラー装置から引き出さピペットを削除して、水平位置にマイクロフォージホルダーの上に置きます。ヒーターフィラメントとピペットにフォーカスを調整します。 </li><li>ピペットの直径を測定し、フィラメントの上に、その直径は180μmでになるまでピペットを移動するために接眼レンズのレチクルを使用してください。 </li><li>指示されたサイズで、ダイヤモンドチップペンでガラスキャピラリーをマークしてから、そっとガラスを破るために引っ張っ先端に押してください。これは、ストレートカット（ 図1C）をもたらすはずです。 </li><li>フィラメントに近いその先端が垂直位置にピペットを移動します。温度を設定<html> 60％のマイクロフォージの。 </li><li>ファイアーポリッシュそれが40μmのIDに到達するまでの標準的な技術7を使用してピペットの先端。 ID（ 図1D）を確認するために接眼レンズのレチクルを使用してください。 </li><li>ピペットの角度を作ります。 <ol><li>約10μm離れたフィラメントと離れてその先端から5mmから戻って水平位置にピペットを持参してください。約60％に温度を設定し、フィラメントの上にピペットを曲げるためにヒーターを作動させます。 （約30 Oの）所望の角度に達するまで加熱を続けます。視覚角度（ 図1E）を確認してください。 注：ピペットは、通常、注射皿の底部に対して60 Oのおおよその角度でマイクロインジェクターに取り付けられています。それは、その中間面における胚の正確な注入に必要な皿の底に平行になるようにピペットの先端が折り曲げられています。 </li></ol></li></ol></li></ol>ル &quot;&gt; 2。マイクロマニピュレータのセットアップ<ol><li> microinjectorsが完全に油がロードされていることを、システム内に気泡が存在しないこと（マイクロインジェクター内の気泡が注射の細かな制御を防ぐ）を確認してください。 </li><li>マイクロマニピュレーターは、中心位置にあることを確認してください。これは、ピペットの動きの広い範囲を可能にします。 </li><li>右顕微ホルダーに左マイクロマニピュレーターホルダーとインジェクションピペットにホールディングピペットを挿入します。 </li><li>油が毛細管現象によりピペットに入ると、システムはマイクロインジェクターのコントロールを使用してピペットの内側に上下に油を移動させることにより、正常に動作していることを確認することができます。 注意：針内のオイルの動きがない場合は、詰まりがあるかもしれません。この場合、新しい針を使用しています。 </li><li>ビューの顕微鏡の視野の中心にピペットをもたらすためにマイクロマニピュレーターコントロールを使用します。 4Xの倍率を使用して、マイクロピペットの先端が正しい角度（Pであることを確認してください皿の底にarallel）。 注意：針の正しいセットアップが成功した注射のため、結果の一貫性のためのキーです。 </li><li>メーカーのキャリブレーション・マニュアルに従ってレーザーシステムのキャリブレーションを行います。 </li></ol>注射皿の調製（図2） <ol><li> 100ミリメートルのペトリ皿の蓋の中央に20％ウシ胎児血清（FBS）を補充温め（37℃）SOF-HEPES（材料セクションの詳細構成）の50μlのドロップを置きます。噴射ドロップの近くに注入される溶液2μlのドロップ - 1を配置します。胚はRT下に冷却しないことを確認してください。 注：このプロトコルでは、注射部位を可視化し、後でそれを追跡することができるように注入溶液にデキストラン - レッド染料を追加します。 </li><li>鉱物油の約10 mlで用いて射出プレートの低下をカバーします。 </li><li>倒立顕微鏡のステージ上に注入皿を置き、ピップをもたらします注射ドロップにettes。針がドロップ内部焦点になっていることを確認してください。マイクロマニピュレーターコントロールを使用して、必要に応じてその高さを調整します。 </li><li>噴射ドロップの上側に - （20時間後に受精（HPF）17）30接合体 - マイクロディスペンサーを用いて、約20をロードします。注射降下の胚の数は、人はそれらを注入することができる速度によって決定されるように室温で注入を実行します。 30分で注入することができるものよりも多くの胚をロードしないでください。 <ol><li>マイクロディスペンサへの胚をロードするには、完全にプランジャーを押し下げると胚を含む溶液に先端を浸します。胚が（一度に1つずつ）ガラスキャピラリーの先端でピックアップされるタッチすると、ゆっくりと各胚がキャピラリーに入るように、プランジャーを解放します。すべての胚がピックアップされているか、マイクロディスペンサの容量がいっぱいになるまでこれを繰り返します。 </li><li> 、ロードされた胚を解放し、ボリューム全体の共同まで静かにプランジャーを押し下げるために、胚をntainingは毛細血管から解放されます。 </li></ol></li></ol> 4.マイクロインジェクション<ol><li> 4X対物レンズを使用して、負圧（吸引）を適用することによって、注入ピペット内に注入される溶液を読み込みます。 3接合体 - 2を注入するのに十分なソリューションをロードします。そして、射出ドロップに移動します。 </li><li>先端が受精卵に近づくように、注射ドロップ内では、保持ピペットを移動します。接合体は、保持ピペットに固定され、20X対物レンズに変更されますので、保持マイクロインジェクターで負圧（吸引）を適用します。 </li><li>受精卵をホールディングピペットに装着された後、静かにそれを取り外すことなく、周りの胚を移動するために注入ピペットを用いてその品質を確認してください。良質な受精卵は2極体（時には唯一の1が見られますが）、均質な細胞質を持っている必要があります。異常な接合体（ 図3A）を注入しないでください。 </li><li>必要であれば、適切な注射用の胚を再配置ロケーション。良いポジショニングとは、ZPとPMの間にいくつかのスペースがあるので、PMは、レーザーによって損傷されないということでしょう。 </li><li>インジェクションピペットを穏やかに注射部位に受精卵をタッチすることにより、胚のミッドプレーン上に配置されていることを確認してください。それは、その中央平面上にない場合、針が胚ではなく、穿刺回転させる傾向があります。必要に応じてインジェクションピペットの高さを調整します。 </li><li>レーザー（ 図3B）を使用して、ZPに穴を作ります。 <ol><li>レーザーのソフトウェア場所穴（胚は、ホールディングピペットに装着されている場所の反対側に）行われますZPにおけるレーザーレチクルを使用。発射ボタン上のレーザ制御ウィンドウのクリックを使用しました。穴の大きさはPM損傷させずに通過する針のためのZPに開口部を作成するのに十分な大きさであることを確認します（例：0.662ミリ秒パルス幅/ 6.9μmの穴の大きさ）。 </li></ol></li><li>注射針を渡しますZPの穴に通し、PMと接触します。針は胚（ 図3C）への道の3/4になるまで前方にピペットを押し続けます。 </li><li>これは一貫して注入量を制御するために使用されるように、溶液を油相間でのメニスカスの位置を観察します。 </li><li> PMと細胞質が注射針に吸引されることになりインジェクションピペット、上の負圧（吸引）を適用します。針への質の動きが加速または注射液と取り違え、細胞質の内容を見ることができるときまで継続します。これらは、PM（ 図3D）の破損を示します。 </li><li>ソリューション油相間でのメニスカスが出発点過去1受精卵の直径相当を進んでいるまで、正圧（注入）を適用することにより、接合体の細胞質への溶液、続いて細胞質コンテンツをバック注入します。 注意：私たちの条件の下では、このrepresents注入した溶液（ 図3E）の約7 plの。 </li><li> 4X目的に変更し、噴射ドロップの下側に/ sの注入された胚を移動します。保持マイクロインジェクターに正の圧力を加えることによって胚をリリース。注入/非注入胚を追跡し、効率的に作業を助けるために、上側の非注入胚とドロップの下側に注入されたものを保管してください。 </li></ol> 5.胚の回復と注入結果<ol><li>予熱したSOF-HEPESで新しい皿に約200μlの3滴を加えます。 （上記のように）マイクロディスペンサーを用いて注入された胚を収集します。 SOF-HEPESが低下3を介してそれらを移動することにより、注入された胚を洗います。 </li><li>マイクロインジェクション中に溶解した胚をカウントし、それらを捨てます。 第1は、全体ZPを記入し、半透明表示されますので、溶解した接合体が無傷の1から容易に区別することができる、そしてそれは通常、細胞質を持っています注意してください胚の外部に漏れるコンテンツ。 </li><li>必要に応じて、蛍光顕微鏡を用いて、マイクロインジェクション効率を確認してください。紫外線曝露がその後の発展に影響を与えることができる胚の損傷を引き起こすことがあるので注意してください。 </li><li> 38.5℃で鉱物油の下で4 mg / mlウシ血清アルブミン（BSA）を補充したカリウムシンプレックス最適化培地の50μlの液滴（KSOM）25注入胚の培養基、飽和5％の空気中のCO 2、湿度。 </li><li> 2日目の注射後、5％FBSを含む培地を補います。 </li><li>注射の7日後に胚盤胞（BL）料金をチェック。胚盤胞の胚/そのドロップで培養した胚の合計数の総数としてBL率を計算します。 </li></ol>

<ol><li>McEvoy, T., Coull, G., Broadbent, P., Hutchinson, J., Speake, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+composition+of+lipids+in+immature+cattle%2C+pig+and+sheep+oocytes+with+intact+zona+pellucida%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Fertil%22%5BJournal%5D)">Fatty acid composition of lipids in immature cattle, pig and sheep oocytes with intact zona pellucida.</a> J Reprod Fertil. 118 (1), 163-170 (2000).</li>
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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

接合体のマイクロインジェクションは、哺乳動物の胚にソリューションを導入するための十分に確立された方法です。種および実験の目的に応じていくつかのバリエーションでは、この技術は、広く使用することができます。私たちは、平滑末端マイクロピペットの入り口を支援するためにレーザーを使用して細胞質内マイクロインジェクションを実行する方法を示しています。 （例えばウシ、ヒツジ、およびブタなど）いくつかの家畜種の接合体は、胚の内部に一度注入ピペットの可視化を妨げ、暗い細胞質を持っています。また、それらの形質膜は、非常に弾性で達成することは難しい（通常はげっ歯類の接合体を注入するために使用）面取りスパイク針で自分の浸透を作ります。これらの制限を克服するために、我々は、原形質膜および胚の細胞質内の溶液の放出の破損を確実にするために、透明帯と細胞質の内容の後続の吸引を介して平滑末端針の通過を可能にするためにレーザを使用します。また、injectiによって針の入り口の反対側のサイトでngの（約3/4胚の内部）我々はPNを置換し、従って、それらの吸引/注入を回避することを目指しています。さらに、このは、このように低い溶解速度が得られ、癒すために壊れた膜のための接触...

1細胞胚の細胞質マイクロインジェクションは非常に強力な手法です。これは、例えば、遺伝子機能を研究するために、または遺伝子編集動物を生成するために遺伝子ノックアウトを生成するために胚に任意の溶液を送達するために使用することができます。ほとんどの農学関連の農場の動物の接合体は、それらの細胞質が不透明と1ダークになり、非常に高い脂肪酸組成を有します。彼らはまた、かなり弾性原形質膜（PM）を有します。これらの特性は、挑戦的で、しばしば不正確なげっ歯類で使用されるような従来の前核/細胞質の注入を使用して、マイクロインジェクションを行います。 実行が容易であり、また、より高い生存率を2で、その結果、注入された胚にはあまりダメージを引き起こすため、細胞質マイクロインジェクションは、前核マイクロインジェクションを超える利点を有しています。このプロトコルの全体的な目標は、農場の動物の接合体の細胞質にソリューションを提供するための成功した方法を実証することです。実行できるようにするには家畜の胚に高い効率で細胞質マイクロインジェクション、レーザは透明帯（ZP）に穴を生成するために使用され、その後、平滑末端ガラス針をマイクロインジェクションのために使用されます。この戦略は、注入中の胚に刻印機械的損傷を軽減することを目指しています。その後、注射針の内側の細胞質内容物の吸引は、溶液は、胚の細胞質に送達されることを確実にPMを効率的かつ自信を持って破損することができます。 この技術はすでに正常接合体の細胞質3,4へのsiRNAを送達するようにし、クラスタ化された定期的interspaced短いパリンドローム反復（CRISPR）/ CRISPR関連するシステム9（Cas9）システム5を用いて、突然変異を生成するために、ウシの胚で使用されてきました。また、ウシ卵丘に囲まれた卵母細胞6を注入する（若干修正済み）が適しています。ここでは、色素を提供我々の注入プロトコルを説明し、それは任意のDESの注入に適用することができますIRED接合子への溶液、およびこの技術を使用して最小限の溶解を引き起こし、初期胚の発育に影響を及ぼさないことを示しています。

<table><tbody><tr><td>マイクロピペットプーラー</td><td>サッターインスツルメント</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>ガラスキャピラリー</td><td>サッターインスツルメント</td><td>B100-75-10</td><td>これらのキャピラリーは、ピペットの保持と注入に使用されます。フィラメントのない厚肉/標準壁のホウケイ酸チューブであれば、どれでも使用できます。</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-9</td><td>10倍倍レンズ搭載。</td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>ニコン/成重</td><td>NT88-V3</td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>TE2000-U</td><td>4倍、20倍、レーザーシステムを搭載。</td></tr><tr><td>レーザー</td><td>研究機器</td><td>7-47-500</td><td>土星5号 アクティブレーザー。</td></tr><tr><td>マイクロディスペンサー</td><td>ドラモンド</td><td>3-000-105</td><td>マイクロディスペンサーは、胚を移動させるために使用されます。p10ピペットも使用できますが、負荷はできるだけ少なくなります。</td></tr><tr><td>100 x 15 mm 培養皿</td><td>ファルコン</td><td>351029</td><td>皿の蓋を使用して注入プレートを作ると、壁が低くなり、マイクロマニピュレーターの位置決めと移動が容易になります。60mmの培養皿の蓋も使用できます。</td></tr><tr><td>35 mm培養皿</td><td>コーニング</td><td>430165</td><td>これらの皿は、50 &mu;l滴は鉱物油で覆われています。あるいは、4ウェルディッシュも使用できます。胚を培養するために選択した皿に関係なく、胚を培養する前に、常にインキュベーター内で少なくとも4時間平衡化する必要があります。</td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>三洋電</td>機<td>MCO-19AIC</td><td>38.5°Cに設定できるインキュベーター。C、5%CO2条件が使用可能です。</td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>SMZ800</td><td>培養液滴中の胚の可視化や洗浄に使用されます。倍率10倍の実体顕微鏡であれば、どれでも使用できます。</td></tr><tr><td>コントロールユニットHT</td><td>ミニチューブ</td><td>12055/0400</td><td>実体顕微鏡に取り付けられた加熱システム。</td></tr><tr><td>加熱顕微鏡ステージ</td><td>ミニチューブ</td><td>12055/0003</td><td>実体顕微鏡に取り付けられた加熱システム。</td></tr><tr><td>デキストランレッド</td><td>Thermo Scientific</td><td>D1828</td><td>滅菌済みの10 mg/ml溶液を使用して注入します。</td></tr><tr><td>ミネラルオイル</td><td>シグマ</td><td>M8410</td><td>ミネラルオイルを室温に保ち、ホイル紙を使用して光から保護します。</td></tr><tr><td>KSOMaa Evolve Bovine</td><td>Zenit</td><td>ZEBV-100</td> 4 <td>mg/ml BSAを添加。胚培養用のKSOMプレートは、使用前に少なくとも4時間インキュベーターで平衡化する必要があります。</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gemini-Bio</td><td>100-525</td><td>幹細胞認定のFBSを使用してください。</td></tr><tr><td>受精卵</td><td></td><td></td><td>受精卵は17〜20 hpfで注入され、in-vitro-またはin-vivo-誘導することができます。</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td>最終濃度:107.7 mMSOF-HEPES培地の成分。</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>最終濃度:7.16 mMSOF-HEPES培地の成分。</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>最終濃度:1.19 mM。SOF-HEPES培地の成分。</td></tr><tr><td>MgCl2 6H2O</td><td>Sigma</td><td>M2393</td><td>最終濃度:0.49 mM。SOF-HEPES培地の成分。</td></tr><tr><td>DL-乳酸ナトリウム</td><td>Σ</td><td>L4263</td><td>最終濃度:5.3 mM。SOF-HEPES培地の成分。</td></tr><tr><td>CaCl<サブ>2</サブ>-2H<サブ>2</サブ>O&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>C7902</td><td>最終濃度:1.71 mMSOF-HEPES培地の成分。</td></tr><tr><td>D-(&マイナス;)-フルクトース&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>F3510</td><td>最終濃度:0.5 mM。SOF-HEPES培地の成分。</td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>H4034</td><td>最終濃度:21 mM。SOF-HEPES培地の成分。</td></tr><tr><td>MEM-NEAA</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>最終濃度:1x. SOF-HEPES培地の成分。</td></tr><tr><td>BME-EAA</td><td>Sigma</td><td>B6766</td><td>最終濃度:1x. SOF-HEPES媒体の成分。</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>最終濃度:4 mMSOF-HEPES培地の成分。</td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>Σ</td><td>P4562</td><td>最終濃度:0.33 mM。SOF-HEPES培地の成分。</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050</td><td>最終濃度:1 mM。SOF-HEPES培地の成分。</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A-3311</td><td>最終濃度:1 mg/ml. SOF-HEPES培地の成分。</td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td>Sigma</td><td>G-1397</td><td>最終濃度: 5 &mu;g / mlです。SOF-HEPES培地の成分。</td></tr><tr><td>胚移植用水</td><td>Sigma</td><td>W1503</td><td>SOF-HEPES培地の成分。</td></tr><tr><td>SOF-HEPES培地</td><td>ラボ</td><td></td>で製造 <td>pH 7.3 - 7.4, 280 &plusmn; 10 mOs.フィルターは22&mu;を介して滅菌されました。mフィルターは冷蔵庫に4°Cで保管できます。Cは1ヶ月間。37°Cで暖かい。使用前のCウォーターバス。</td></tr></tbody></table>

家畜接合体におけるレーザーアシスト細胞質マイクロインジェクション

Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

細胞質マイクロインジェクションは、非常に強力な技術です。一例として、成体生物のすべての細胞に存在する遺伝子改変を作成できるゲノム編集ツールの提供が可能になります。また、siRNA、mRNA、またはブロッキング抗体の送達にも使用でき、着床前胚の遺伝子機能を研究することができます。従来のげっ歯類の胚へのマイクロインジェクション技術は、非常に細いマイクロピペットを用いており、胚に進入すると原形質膜に直接浸透します。この手法を家畜に適用すると、通常は効率が低下します。これは主に、マウスやラットとは対照的に、ウシ、ヒツジ、ブタの受精卵は非常に暗い細胞質と非常に弾力性のある原形質膜を持っているため、注射中の可視化や原形質膜の浸透が困難であるためです。このプロトコルでは、ヒツジおよびブタの胚に対しても成功することが証明されている、ウシの接合子の細胞質への溶液の送達に適したマイクロインジェクション法について説明します。まず、レーザーを使用して透明帯に穴を開けます。次に、鈍い端のガラスマイクロピペットを穴から導入し、針の先端が胚の約3/4に達するまで進めます。次に、針の内側の細胞質内容物の吸引により、原形質膜が破壊されます。最後に、吸引された細胞質内容物に続いて目的の溶液が胚の細胞質に戻されます。このプロトコルは、ウシおよびヒツジの受精卵にさまざまな溶液を100%の効率で、溶解を最小限に抑え、正常な胚盤胞の発生速度で成功裏に使用されています。

レーザーアシスト細胞質マイクロインジェクションは、家畜の接合体の細胞質にソリューションを提供する、強力で信頼性の高いプロトコルである。 図3は、接合体の概要前と注射後だけでなく、技術の全体的な概要を示しています。デキストラン赤注射および注入効率と精度の追跡サイトを可能にするために溶液を注入するように使用されます。溶液の成功した送達は、色素が均一細胞質に分布している最近注入胚を示す。図4に示されています。この技術を用いて胚の100％が、それらの細胞質に注入されます。 このプロトコルは、ウシやヒツジ接合体で最小の溶解速度を有することが示されました。注入された胚の唯一の15.6±5および5.8±3.9％は、マイクロインジェクションの結果として、それぞれ、牛や羊に溶解しました<strオング&gt;（図5）。 図6に示すように、また、ウシ（32.8±6.6％制御...

このプロトコルは、家畜の受精卵における細胞質マイクロインジェクションの方法を示しています。この技術は、ノックアウト動物を生成するためのゲノム編集ツールなど、あらゆる溶液を1細胞胚に導入するために使用できます。

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

この手順の全体的な目的は、レーザーを用いて鈍端針を用いて家畜受精卵の細胞質内に溶液を効率的に導入することです。この手法は研究および動物のトランスジェネシス分野で使用されており、CRISPR Cas9システムなどのゲノム編集ツールと組み合わせることで、遺伝子機能を研究するための新しい牛やトランスジェニック動物を非常にシンプルかつ確実な方法で作成できます。この技術の主な利点は、大型動物の受精卵の細胞質内にあらゆる溶液を導入できることです。熟練した操作による注入効率の向上により、動物肝臓のロモチル率を最小限に抑えることができます。まず、ホウケイ酸ガラスキャピラリーをマイクロピペットプラーにセットし、固定して注入用マイクロピペットを準備します。適切なプログラムを用いてキャピラリーを延伸し、長いテーパーを持つ細いチップを作成します。次に、引き出したピペットを装置から慎重に取り出し、マイクロフォージの上に水平に置きます。引き出したピペットと、ガラスビーズを備えたマイクロフォージのヒーターフィラメントに焦点を合わせます。接眼レンズのレチクルを使用して希望の太さを測定し、ヒーターフィラメントが目標の内径である 5 µm に達するまで、ピペットを水平に移動させます。加熱温度を約45%に調整し、ピペットをゆっくりと下ろし、フィラメントに接触させます。次に、ヒーターを短時間作動させます。これによりピペットがわずかに溶けてフィラメントに付着し、冷却時に接触点でピペットが折れることで、直線的な切断面が形成されます。このステップでは、適切な温度設定が重要です。温度が高すぎるとピペットが曲がり、低すぎるとピペットを切断するのに十分な熱が得られません。次に、ピペットの先端をヒーターフィラメントから約10 µm離して配置し、先端付近に約30度の角度をつけます。温度を60%に設定し、ヒーターを作動させて、ピペットがフィラメントに向けて目的の角度に曲がるようにします。ここに示す設定を用いてガラスキャピラリーを引き、先端が細く、テーパーが長く均一で、壁面が平行なマイクロピペットを作製します。引き出したピペットをプルヤー装置から慎重に取り出し、マイクロフォージのホルダーに水平に配置します。接眼レンズのレティクルを使用してピペットの直径を測定し、フィラメント上の直径が180 micrometersになるまでピペットを移動させます。ダイヤモンドペンでガラスキャピラリーに印を付け、その後、引き伸ばした先端を軽く押してガラスを破断させます。これにより、直線的な切断が得られます。次に、ピペットを垂直に立て、先端をフィラメントに近づけます。マイクロフォージの温度を60%に設定し、標準的な手法を用いて、内径が目標サイズになるまでピペットの先端を火炎研磨します。ピペットの内径を測定し、40 micrometersであることを確認してください。前述と同じ手順で、チップを30度の角度に曲げます。保持用ピペットを左側のマイクロマニピュレーターホルダーに、注入用ピペットを右側のマイクロマニピュレーターホルダーに挿入します。その後、注入用ピペットにオイルを満たします。マイクロマニピュレーターのコントローラーを使用して、ピペットを顕微鏡の視野の中心まで移動させます。4倍の倍率で、マイクロピペッティングチップがディッシュの底面と平行になるよう、適切な角度にあることを確認してください。100 mmペトリディッシュの蓋の中央に、20% FBSを添加した37 °CのSOF-HEPES溶液を50 µL滴下します。次に、注入する溶液を1〜2 µL、注入用ドロップの近くに滴下します。続いて、ドロップと注入プレートを約10 mLのミネラルオイルで覆います。プレートを顕微鏡ステージに設置し、マイクロディスペンサーを用いて、注入用ドロップの上側に20〜30個の接合子をロードします。4X対物レンズを使用し、マイクロインジェクターで陰圧をかけて、注入用ピペットに注入溶液を充填します。受精卵2〜3個分を注入するのに十分な量の溶液を充填した後、注入ドロップへ移動します。注入ドロップ内で、ホールディングピペットを動かし、先端を受精卵に近づけます。ホールド用マイクロインジェクターで陰圧をかけ、接合子をホールドピペットに固定します。接合子が固定されたら、20倍の対物レンズに切り替えます。注入部位で接合子に軽く触れ、注入用ピペットが胚の中央平面に位置していることを確認してください。針が中間平面上にない場合、穿刺ではなく胚が回転する傾向があります。次に、ソフトウェアを使用して、孔を作成する透明帯の垂直位置にレーザーを配置します。正しく配置されたら、レーザー制御ウィンドウのFIREボタンをクリックします。針が細胞膜を損傷させることなく通過できるよう、透明帯に十分な大きさの穴が開いていることを確認してください。注入針を透明帯の穴に通し、細胞膜に接触させます。針が胚の3/4まで到達するまで、ピペットを押し進めてください。溶液とオイルの界面におけるメニスカスの位置を確認します。これにより、注入量を一定に制御することが可能になります。注入用ピペットに陰圧をかけ、プラズマ膜と細胞質を注入針の中に吸引します。針の中の細胞質の移動が加速するか、注入液と混ざり合った細胞質の内容物が確認できるまで継続します。これらは形質膜の破断を示しています。溶液とオイルの界面にあるメニスカスが、開始点から受精卵1個分の直径相当まで前進するまで陽圧をかけ、細胞質の内容物を押し戻した後、溶液を受精卵の細胞質に注入します。次に、対物レンズを4倍に変更し、注入した胚を注入液滴の下側に移動させます。ホールディングマイクロインジェクターに正圧をかけて胚を放出します。その後、マイクロディスペンサーを用いて注入済みの胚を回収します。付属のテキストプロトコルに記載されている通り、注入した胚を3滴のSOF-HEPES中で移動させて洗浄し、培養します。溶液が正常に導入されたかは蛍光画像で確認でき、ここでは注入部位、注入効率、および正確性を追跡するためにdexion redが使用されています。この画像では、本手法を用いた際に典型的であるように、染料が細胞質に均一に分布しています。本プロトコルでは、ウシおよびヒツジの受精卵における溶血率が最小限に抑えられています。マイクロインジェクションの結果、溶血したウシまたはヒツジの注入胚はほとんどありませんでした。また、ウシおよびヒツジの両胚において、対照群と注入群の間で胚盤胞の発達率に統計的な有意差は認められませんでした。この技術を習得すれば、1分間に2個の胚を処理することが可能です。熟練した操作による注入効率の向上は、動物の胚盤胞率の低下を最小限に抑えます。このビデオを視聴することで、家畜接合子におけるレーザー支援細胞質内微量注入法（laser-assisted intracytoplasmic micro-injection）の実施方法を理解することができます。また、効率的なデリバリーを実現するために、正および負の吸引圧を用いて血漿膜の破裂を確実にさせる方法についても説明します。

laser-assisted-cytoplasmic-microinjection-in-livestock-zygotes

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

マイクロインジェクションは受精ゼブラフィッシュの胚への外来物質を導入するための十分に確立し、効果的な方法です。ここで、我々は、ゼブラフィッシュでのmRNAの過剰発現、およびモルフォリノオリゴヌクレオチドの遺伝子のノックダウンの研究を行うための堅牢なマイクロインジェクション法を示しています。...

ゼブラフィッシュ胚におけるmRNAおよびモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドのマイクロインジェクション。

このビデオは、モルホリノまたはmRNAが、その後の開発中に特定の遺伝子産物のレベルを増減して1細胞段階でゼブラフィッシュ胚に注入する方法を示しています。...

遺伝子機能を解析するためにゼブラフィッシュ胚のマイクロインジェクション

このビデオでは、ゼブラフィッシュの卵黄嚢に化合物を送達するための胚マイクロインジェクションの技術について説明しています。...

胚マイクロインジェクション:ゼブラフィッシュの卵黄に化合物を送達する技術

このビデオでは、レンチウイルス遺伝子の送達を促進するためのマウス受精卵の透明帯の保護層のレーザー支援透過を示しています。レンチウイルスは、目的の遺伝子がゲノムに安定して組み込まれたトランスジェニック動物の作製を可能にします。...

レーザー支援レンチウイルス遺伝子導入:レンチウイルス遺伝子導入を促進するためにマウス受精卵を透過化する技術

マイクロインジェクションは、卵、胚、および種々の種の細胞にDNA構築物、mRNAは、モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは他の治療法を送達するために使用される一般的な技術である。...

ウニ​​接合体のハイスループットマイクロインジェクション

モルファント胚を生産する方法は、発生メカニズムや遺伝子制御ネットワークを研究するために不可欠である。海の星Patiria miniataはこれらの研究のための新たなモデル系である。ここでは、胚の培養液を生産、配偶子を取得するためのプロトコルを提示しており、この種から接合体の急速なマイクロインジェクション。...

のマイクロインジェクション法 Patiria minata接合体

地中海のショウジョウバエ(メドフライ)Ceratitis...

世界的な農業害虫昆虫における胚のマイクロインジェクションを介して、核酸の送達、<em&gt;チチュウカイミバエ</em

Zebrafish の胚・仔魚のマイクロインジェクションは多くのゼブラフィッシュ モデルで重要だが、挑戦的な手口です。ここでは、安定化を支援するためにマイクロ...

最適化されたマイクロインジェクションおよびゼブラフィッシュ幼虫の画像処理用微細構造デバイス

マウスの受精卵および初期胚は透明帯、遺伝子導入に対する障壁を形成する糖タンパク質マトリックスによって保護されています。この資料では、ヘッジホッグ レンチウイルスベクターを持つ胚細胞、トランスジェニック...

マウスへのレーザ レンチ ウイルス遺伝子導入受精卵

本プロトコルは、遺伝子カセットノックインおよびフロックスマウスを効率的に作製するためのCRISPR-Cas9およびドナーDNAの接合子マイクロインジェクションを記載する。...

マウスの遺伝子カセットノックインおよびフロックス対立遺伝子を作成するための接合子マイクロインジェクション

学ぶレーザーアシスト細胞質マイクロインジェクション法で家畜接合体に溶液を導入する技術。鈍端針とレーザーを用いてCRISPR Cas9などのゲノム編集ツールを効率的に送達し、遺伝子機能研究やトランスジェニック動物作出を支援します。

家畜接合体におけるレーザーアシスト細胞質マイクロインジェクション

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