新規蛍光プローブと形質膜におけるホスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸の単分子超解像イメージング
2016年10月15日
PI（4,5）P 2は、様々な細胞機能を調節するが、細胞の原形質膜でのナノスケール組織はあまり理解されています。標識PI（4,5）プレクストリン相同ドメインに融合された二重色蛍光プローブとP 2によって、我々はナノメートルスケールでの原形質膜中のP 2空間分布（4,5）PIを研究するための新規な方法を記載します。
この研究の全体的な目標は、単一分子蛍光局在化顕微鏡を使用して、細胞原形質膜中のホスファチジルイノシトール4、5-ビスリン酸のナノスケール分布を放出することです。この方法は、ホスホイノシチドシグナル伝達に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、細胞膜のシグナル伝達複合体の下でのホスホイノシチドのナノスケールの組織化はどのようなものなのでしょうか?
この技術の主な利点は、高い空間分解能と、リン脂質形態学的研究の主要な懸念事項である界面活性剤処理のバイパスです。このアプローチには、3つの主要なステップが含まれます。ステップ1:生細胞からの原形質膜シートの調製。
ステップ2:ホスホイノシチドの標識と単一分子蛍光イメージング。ステップ3:1分子の局在化とイメージングの再構築。実験当日、コートカバーは半分から1ミリリットルのPDLで滑ります。
1〜2時間後、カバースリップの端からティッシュペーパーで余分なPDLを吸収します。次に、カバースリップを4°Cの金属板に保管します。次に、カバースリップで増殖させたトランスペック済みINS-1細胞を、1ミリモルのEGTAを含む半から1ミリリットルの氷冷PBSで洗浄します。
この洗浄を3回繰り返し、余分なPBSを吸収します。次に、ピンセットを使用して、培養細胞の入ったカバースリップをPDLコーティングされたカバースリップに、細胞側を下にして置きます。冷やした金属板でこれを行います。
次に、プレートを摂氏4度に7〜10分間移し、細胞が付着する時間を与えます。次に、ピンセットを使用して、細胞負荷カバースリップをそっと剥がし、PDLコーティングされたカバースリップに細胞膜の薄い層を残します。次に、メンブレンシートを半から1ミリリットルの氷冷PBSでやさしく洗います。
次に、各メンブレンシートを約150マイクロリットルの氷冷4%PFAと0.2%グルタルアルデヒドのPBSに固定します。メンブレンを摂氏4度で15分間固定します。固定後、すぐにイメージングに進むか、調製物を氷冷PBSで覆い、摂氏4度で保存します。
pHプローブを使用している場合は、すぐにイメージングすることを強くお勧めします。この手順では、TIRF顕微鏡ベースのSMLMシステムが使用されます。メンブレンをイメージングする前に、1マイクロリットルの蛍光ビーズ溶液を10ミリリットルのPBSで50ミリモルの塩化マグネシウムで希釈します。
次に、サンプルをイメージングチャンバーにロードし、希釈した溶液を200マイクロリットル加えて10分間待ちます。次に、サンプルをPBSで3回洗浄します。次に、PALMイメージングシステムを起動します。
関連するイメージングソフトウェアで、iRFPチャネルボタンを選択します。次に、iRFPチャネルでpHプローブを発現する細胞膜を見つけ、ドリフト補正に蛍光ビーズを使用します。通常の TIRF 角度を 2140 に設定します。これは TIRF の臨界角度よりも 1.5 深く、デフォルトの角度にする必要があります。
次に、キャプチャボタンを使用して、iRFPチャネル内の従来のTIRF画像を参照として収集します。次に、[RFP channel] ボタンをクリックして PAm-Cherry1 チャネルに切り替えます。次に、AOTFパッドのスクロールバーを右端まで調整して完全に照らし、レーザーを約10〜20秒間適用して、背景の膜蛍光を漂白します。
次に、[フォーマット]タブの最適なカメラ設定を[2×2ビニング]に設定します。次に、[ND Sequence Acquisition]タブの高速取得プロトコルを20ヘルツで30,000画像に設定します。次に、画像取得中に405ナノメートルレーザーに0.1〜1パーセントの出力を印加して、各フレーム内の空間的に孤立した点を簡単に識別できるようにします。
次に、[Run Now] ボタンをクリックして PAm-Cherry1 画像を取得します。活性化できる分子の数は、取得中に徐々に減少します。それに応じて、405ナノメートルレーザーの強度を徐々に増やして、信号の最適な密度を維持します。
すべての PAm-Cherry1 信号がアクティブになるまで画像を取得します。後で画像処理と再構成を行う際には、各フレームから個々の分子イベントを特定し、位置を特定します。フィルタリング強度のしきい値をウェーブレットのしきい値数で設定します。
詳細については、テキストプロトコルで提供されています。PIP2の空間分布は、本文に記載されている適切な固定により、さまざまな固定に敏感であり、PIP2プローブは、PIP2抗体または特定のpHドメインで標識した場合、一貫した分布を示しました。これに対し、EGFPタグ付きpHドメインで標識された生細胞は、イメージにあまり違いはありません。
すべてのサンプルは、プローブの均一な分布を示しました。対照的に、最適でない固定は、鋭く密集したPIP2クラスターとシグナル強度の低下をもたらしました。最適な固定条件下では、固定細胞内のPIP2の超解像画像は、細胞膜のかなりの部分にプローブが均一に分布しており、濃度勾配は限られていることを示しました。
PIP2プローブが豊富な一部のメンブレンパッチは、まばらに分布し、さまざまなサイズを持っていました。生細胞のPALM画像は、固定細胞と同様の空間分布を示しました。PIP2シグナルの詳細な解析により、そのダイナミクスは局所的には速いことが明らかになりましたが、これは全体的な存在量に大きな変化をもたらしませんでした。
この手法は、リン脂質の分野の研究者が、生理学的条件下で他のホスホイノシチドサブタイプの分布と活性を調査するための新しい方法を導入します。
概要
本研究では、単分子蛍光局在化顕微鏡を用いて、細胞形質膜におけるホスファチジルイノシトール 4,5-二リン酸 (PI(4,5)P2) のナノスケールでの分布を調査します。この手法により、ホスホイノシトール・シグナリングおよび細胞膜におけるホスホイノシトールの組織化に関する知見が得られます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 細胞生物学
- 神経科学
- 蛍光顕微鏡法
背景
- PI(4,5)P2は、さまざまな細胞機能において重要な役割を果たしています。
- 細胞膜におけるPI(4,5)P2のナノスケールでの組織化については、十分に解明されていません。
- 既存の手法では界面活性剤処理が行われることが多く、これがリン脂質の形態に影響を及ぼす可能性があります。
- 本研究では、新しいイメージングアプローチを用いてこれらの制限を克服することを目的としています。
研究目的
- 細胞膜におけるPI(4,5)P2のナノスケール分布を解明すること。
- ホスホイノシチドシグナリングのダイナミクスを探索すること。
- より優れた形態学的研究を実現するため、界面活性剤処理を回避する方法を開発すること。
使用した手法
- 生細胞からの細胞膜シートの作製。
- ホスホイノシチドの標識および単一分子蛍光顕微鏡を用いたイメージング。
- 個々の分子イベントを局在化させるための画像取得および処理。
- PI(4,5)P2 分布への影響を評価するための固定法の比較。
主な結果
- 最適な固定条件により、細胞膜におけるPI(4,5)P2の均一な分布が明らかになった。
- 不適切な固定では、高密度のクラスター形成と信号強度の低下が認められた。
- 生細胞イメージングでは、固定細胞と同様の空間分布パターンが示された。
- PI(4,5)P2のダイナミクスは局所領域で速かったが、全体の量に有意な変化は見られなかった。
結論
- 本研究では、ホスホイノシチド分布を探索するための新しい手法を導入します。
- 得られた知見により、生理的条件下におけるホスホイノシチドシグナリングの理解が深まります。
- この技術は、他のホスホイノシチドサブタイプを調査するためにも適用可能です。
よくある質問
業界における実用性
PI(4,5)P2などのホスホイノシチドのナノスケールでの組織化を理解することは、シグナル伝達経路におけるターゲットバリデーションのリスクを低減させるために極めて重要です。本手法により、界面活性剤に起因するアーティファクトを排除した膜脂質ダイナミクスのメカニズム的な洞察が可能となり、早期探索における予測の信頼性が向上します。これは、細胞膜における薬物-ターゲット相互作用に関連する空間的組織化を明らかにすることで、ターゲットバリデーションにおける重要な転換点に対応するものです。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： イオンチャネルおよびシグナリング複合体の主要な調節因子であるPI(4,5)P2の空間的組織化を明らかにすることで、治療仮説を検証します。
- 運用的価値： 生体に近似した膜環境における脂質ナノドメイン組織を直接可視化することにより、生物学的なリスク低減を可能にします。
- 予測的価値： 生理的条件下でのホスホイノシチド依存性ターゲットに関するメカニズム的な明確さを提供し、ポートフォリオの優先順位付けを支援します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値：ホスホイノシトール修飾化合物を標的としたダウンストリームのスクリーニングアッセイに向けて、検証済みの生物学的システム（固定膜シートおよび生細胞）を調製します。
- 運用上の価値：定量的で超解像度の空間的リードアウトを提供し、アッセイの標準化と再現性を向上させます。
- 拡張性：ホスホイノシトールのサブタイプ間でプラットフォームの再利用を容易にし、創薬パイプラインにおける一貫した化合物評価を可能にします。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- トランスレーショナルな連続性：生細胞イメージングにおいてPI(4,5)P2の分布を維持することで、疾患に関連するシステムの忠実性を保持し、前臨床モデルへの外挿を可能にします。
- メカニズム的なリスク低減：観察されたシグナル伝達効果が、脂質の量的な変化ではなく脂質の再編成に起因するものかどうかを明確にし、ターゲットへの信頼性を高めます。
- 予測の信頼性：ナノスケールの脂質ダイナミクスを病態生理学的コンテキストにおける機能的アウトカムに結びつけることで、リスク調整に基づいた進展判断を可能にします。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、ターゲット仮説の検証からアッセイ開発、そして前臨床段階でのメカニズム検証に至る創薬の連続的なプロセスに統合されており、特にホスホイノシチドシグナル伝達に関与するターゲットに有用です。
- 探索生物学：形質膜マイクロドメインにおけるPI(4,5)P2のナノスケール組織化を解明することで、仮説検証およびパスウェイの明確化を支援します。
- スクリーニング：脂質調節ターゲットに対する信頼性の高い化合物スクリーニングに不可欠な、アッセイに即した再現性のある定量的空間データを提供します。
- 分析：単一分子局在化および再構築出力を提供し、さまざまな実験条件下での脂質分布の比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：生理的条件下での固定細胞の分布パターンを反映した生細胞イメージングを通じて、探索から前臨床への連続性を構築します。
- エンタープライズ再利用：複数のホスホイノシトールサブタイプを探索するための再利用可能なイメージング機能を確立し、プロジェクト間での冗長な手法開発を削減します。
運用およびエンタープライズへの影響
- 科学的価値：ホスホイノシチド介在性シグナル伝達経路におけるメカニズム的な曖昧さを解消することで、予測の信頼性を向上させます。
- 運用上の価値：固定化を最適化したプロトコルとドリフト補正済みの単分子イメージングにより、標準化と再現性を確保します。
- 戦略的価値：脂質依存的なメカニズムを明確にすることで、Go/No-Go判断を改善し、ターゲット推進における後期の生物学的リスクを低減します。
- ポートフォリオへの影響：主要な膜シグナル伝達脂質の検証済み空間組織に基づき、リスク調整後のターゲット優先順位付けを可能にします。
実施上の検討事項
- 単分子局在化顕微鏡法および細胞膜シート調製に関する専門知識が必要です。
- レーザー活性化および蛍光ビーズを用いたドリフト補正機能を備えたTIRFベースのSMLMシステムが必要です。
- PI(4,5)P2シグナルのアーティファクトによるクラスター化を避けるため、固定化プロトコルのチーム間での標準化が求められます。
- 他のホスホイノシトールサブタイプや疾患関連の細胞モデルへ展開する場合、適応に関する検討が必要です。
- 実用上の制限：生細胞データで示されているように、シグナルの解釈においては、脂質全体の量に影響を与えない高速な局所ダイナミクスを考慮する必要があります。
