急速な手法による新規RNA結合タンパク質の単離

この手順の全体的な目的は、in vivoでRNAに関連付けられているタンパク質と共に、特定のRNAを効率的に単離することです。この手法は、特定の転写物に結合しているRNA結合タンパク質（RBP）の明確なセットは何かといった、RNAの代謝と調節における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本手法の主な利点は単離効率が高いため、新規のmRNA結合タンパク質の同定といった後続の解析が可能であることです。

この迅速な手法では、MS2タグ付きmRNAと、MS2結合タンパク質およびストレプタビジン結合タンパク質の融合タンパク質を共発現する酵母株を利用します。500 mLの酵母細胞を、合成デキストロースまたはSD選択培地を用いて30 °CでOD600が0.8から1.0になるまで培養します。細胞が準備できたら、室温で3000 ×gにて4分間遠心分離し、上清を捨てます。

細胞をPBSで洗浄し、再度遠心分離します。上清を捨て、メチオニンを含まないSD培地を等量加えて細胞を再懸濁します。30 °Cで45〜60分間インキュベートし、融合タンパク質の発現を誘導します。

45分から60分後、RNA抽出用に細胞を10 milliliters取り分けておき、残りの細胞を迅速精製に使用します。この手順を開始するには、RNA-タンパク質複合体を架橋するため、最終濃度が0.1%となるように37%ホルムアルデヒドを1.35 milliliters細胞に加えます。30 °Cでさらに10分間インキュベートします。

架橋反応を停止させるため、2.5 M glycineを26.5 mL加え、最終濃度を0.125 Mとして、30 °Cで3分間インキュベートします。ここからは、RNAの分解を最小限に抑えるため、すべてを氷上で保持し、迅速に操作してください。細胞を4 °C、3000 ×gで4分間遠心分離します。

上清を捨て、45 millilitersの冷PBSを加えて、再度遠心分離します。上清を除去し、高濃度のRnase阻害剤を含む5 millilitersの迅速溶解バッファーで細胞を再懸濁します。細胞懸濁液を500 microlitersずつネジキャップ付きマイクロフュージチューブに分注し、各分注量に約400 milligramsの冷却済みガラスビーズを加えます。

ビーズミルを用いて細胞を3分間溶解させます。溶解物を直ちに氷上に置きます。その後、溶解物を新しいマイクロ遠心チューブに移します。

5 mLシリンジの先端を切り取り、それを空の15 mLチューブに取り付けて、スクリューキャップチューブ用のアダプターとして使用します。熱した針を用いて各チューブの底に小さな穴を開け、アダプターを装着した15 mLチューブの上に設置します。これらのチューブアセンブリを4°Cで3000 ×g、1分間遠心分離し、ライセートを15 mLチューブに溶出させます。

各15 mLチューブのフロースルーを新しい1.5 mLチューブに移し、4°Cで10,000 ×gにて10分間遠心分離して細胞残渣を除去します。すべての1.5 mLチューブの上清を1本の15 mLチューブに回収します。ライセートの1/50量と1/100量を、それぞれRNAおよびタンパク質分離用に分取しておきます。

細胞溶解液に300 µgのAvidinを添加し、RNAタンパク質複合体の迅速分離手順を開始します。4 °Cで、絶えず回転させながら30分間インキュベートします。細胞溶解液をAvidinでインキュベートしている間に、ストレプトアビジンビーズを予備洗浄し、ストレプトアビジンビーズのスラリー約300 µLを1.5 mLマイクロ遠心チューブに移して遠心分離し、上清を除去して250 µLのビーズを回収します。

ビーズに1 milliliterの迅速溶解バッファーを加え、4 degrees Celsiusで660 times Gにて2分間遠心分離する。上清を除去し、再び迅速溶解バッファーで洗浄する。ビーズをブロッキングするため、0.5 millilitersの迅速溶解バッファー、0.5 millilitersのBSA、および10 microlitersの酵母TRNAを加え、4 degrees Celsiusで1時間、定速回転させながらインキュベートする。

ビーズを1 mLの迅速溶解バッファーで2回洗浄します。事前洗浄したストレプトアビジンビーズ250 µLをアビジン含有溶解液に加え、4 °Cで1時間、絶えず回転させながらインキュベートします。このインキュベーション時間は、十分な結合時間を確保することと、RNA分解の可能性を最小限に抑えることの妥協点となっています。

1時間後、660 ×gで2分間、4°Cで遠心分離し、ストレプトアビジンビーズを除去します。上清を15 mLチューブに移します。ライゼートの1/50量と1/100量を、それぞれRNA抽出およびタンパク質分離用に取り分けておきます。

ビーズに1 mLの迅速溶解バッファーを加えます。ピペッティングで混合し、新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに移し、4°Cで660 ×gで2分間遠心分離します。迅速溶解バッファーでさらに3回洗浄します。

rapid lysis bufferで最後に洗浄した後、上清を除去し、1 milliliterのrapid wash bufferを加えて4 degrees Celsiusで5分間回転混和させます。遠心分離を行い、rapid wash bufferでさらに2回洗浄します。ビーズを1 milliliterのPBSで洗浄し、同様に遠心分離します。

上清を除去し、ビーズに120 µLのPBSを加え、ローラーで5分間回転させる。前述と同様に遠心分離を行い、洗浄サンプルとしてRNAおよびタンパク質抽出用のすべての上清を回収する。RNAおよびRNA結合タンパク質を溶出させるため、ビーズに6 mMのビオチン含有PBSを120 µL加え、4 °Cで絶えず回転させながら45分間インキュベートする。

ビーズを遠心分離し、溶出物を新しい1.5 mLチューブに移します。溶出サンプルを再度スピンさせ、上層を新しい1.5 mLチューブに移すことで、ビーズの混入がないことを確認します。RNAまたはタンパク質抽出用のサンプルを採取します。

RNAの分離効率と品質を決定するため、キャスト細胞溶解液、迅速細胞溶解液、およびビオチンによる溶出後の2種類のタグ付きRNA（PMP1およびFPR1）を用いてノーザン解析を行った。リボソームRNAはエチジウムブロミド染色によって検出され、溶出サンプルにリボソームRNAが含まれていないことは、精製の厳密性を示している。

精製の厳密性と特異性は、溶出サンプルにおいてタグのないMRNAのシグナルが検出されないことでさらに証明されます。FPR1レーンに見られるACT1のサイズとは異なる明らかなシグナルは、以前にMS2Lプローブでハイブリダイゼーションを行った際の残りです。投入したRNAは、ホットフェノール法で精製したRNAに比べてある程度の分解が見られますが、溶出分画における強いシグナルが示す通り、十分な量のフルレングスのタグ付きRNAが特異的に単離されています。

タンパク質試料は、プロテオミクス解析の前にSDS-PAGEおよび銀染色によって分析することができます。矢印で示されたMS2-CP-GFP-SBP融合タンパク質は、タンパク質のロード量が等しいことを示しています。アステリスクは、強度が異なるバンドを示しており、これらは後に質量の分析（質量分析）のためにゲルから切り出されました。

この手順を実施する際は、手袋を着用し、作業エリアの清潔さを確保し、RNAフリーウォーターで溶液を調製し、プロトコルの時間を短縮するために迅速かつ効率的に作業することが重要です。フェノールやホルムアルデヒドなどの試薬を取り扱う際は非常に危険であるため、本手順の実施中は常に化学薬品用フード内で作業するなどの予防措置を講じてください。このビデオを視聴することで、fayn-tressとその関連組織のRNAを効率的かつ効果的に精製する方法について、十分に理解できるはずです。

この手順に続き、RNA-Seqなどの他の手法を実施することで、目的の転写物に結合するRNAを検出することができます。