急速な手法による新規RNA結合タンパク質の単離

RNA-タンパク質相互作用は、多くの細胞プロセスの中心にあります。ここでは、特定のRNAを単離し、それに関連する新規タンパク質を同定するin vivo法について説明します。これにより、細胞内でRNAがどのように制御されているかに新たな光が当てられる可能性があります。

この手順の全体的な目標は、in vivoでRNAに関連するタンパク質と特定のRNAを効率的に単離することです。この方法は、特定の転写産物に結合したファウビーピーの明確なセットは何かなど、RNAの代謝と調節における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、単離の効率が高いことであり、これにより、高貴なmRNA関連タンパク質のフォローアップ同定が可能になります。

迅速な方法論は、MS2タグ付きMRNAを共発現する酵母株と、MS2結合タンパク質とストレプタバジン結合タンパク質の融合タンパク質を利用します。500ミリリットルの酵母細胞を、合成デキストロースまたはSD選択培地で摂氏30度で0.8〜1.0のOD600まで成長させます。細胞の準備ができたら、室温で3000倍のGで4分間遠心分離し、上清を捨てます。

PBSで細胞を洗浄し、再度遠心分離します。上清を捨て、メチオニンを含まない等量のSDに細胞を再懸濁します。摂氏30度で45〜60分間インキュベートして、融合タンパク質の発現を誘導します。

45〜60分後、RNA抽出用に10ミリリットルの細胞を確保し、残りの細胞を迅速な精製に使用します。この手順を開始するには、1.35ミリリットルの37%ホルムアルデヒドを細胞に加え、最終濃度を0.1%にしてRNAタンパク質複合体を架橋します。摂氏30度で10分間インキュベートを続けます。

架橋を停止するには、26.5ミリリットルの2.5モルグリシンを最終濃度0.125モルまで追加し、摂氏30度で3分間インキュベートします。これからは、すべてを氷上に保ち、RNAの分解を最小限に抑えるために迅速に作業します。細胞をGの3000倍で4°Cで4分間遠心分離します。

上清を捨て、45ミリリットルの冷たいPBSを加え、再度遠心分離します。上清を除去し、高濃度のRnase阻害剤を含む5ミリリットルの迅速溶解緩衝液に細胞を再懸濁します。細胞懸濁液をスクリューキャップ付きマイクロチューブで500マイクロリットルのアリコートに分割し、各アリコートに約400ミリグラムの冷却ガラスビーズを追加します。

ビーズビーターで細胞を3分間溶解します。すぐにライセートを氷の上に置きます。ライセートを新しいマイクロチューブに移します。

5ミリリットルの注射器の上部を切り取り、空の15ミリリットルのチューブに置いて、スクリューキャップチューブのアダプターとして機能します。ホットニードルを使用して各チューブの底に小さな穴を開け、適合した15ミリリットルのチューブの上に置きます。浴槽アセンブリをGの3000倍で摂氏4度で1分間遠心分離し、ライセートを15ミリリットルのチューブに溶出します。

各15ミリリットルチューブから新しい1.5ミリリットルチューブにフロースルーを移し、摂氏4度で10,000倍Gで10分間遠心分離して細胞の破片を取り除きます。すべての1.5ミリリットルチューブから上清を1つの15ミリリットルチューブにプールします。ライセートの1/50および1/100の容量をそれぞれRNAおよびタンパク質の単離のために取っておきます。

RNAタンパク質複合体の迅速な単離手順を開始するには、細胞溶解物に300μgのアビジンを添加します。一定のローリング下で摂氏4度で30分間インキュベートします。細胞溶解物をアビジンとインキュベートしている間に、ストレプタビジンビーズを予備洗浄し、約300マイクロリットルのストレプタバジンビーズスラリーを1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移し、調製物を遠心分離し、次いで上部上清を除去すると、250マイクロリットルのビーズが得られます。

1ミリリットルの迅速溶解バッファーをビーズに加え、Gの660倍で摂氏4度で2分間遠心分離します。上清を取り除き、急速溶解バッファーで再度洗浄します。ビーズをブロックするには、0.5ミリリットルの迅速溶解バッファー、0.5ミリリットルのBSA、および10マイクロリットルの酵母TRNAを添加し、摂氏4度で一定回転で1時間インキュベートします。

ビーズを1ミリリットルの迅速溶解バッファーで2回洗浄します。250マイクロリットルの洗浄済みストレプトアビジンビーズを溶解物を含むアビジンに加え、摂氏4度で1時間一定回転させてインキュベートします。このインキュベーション時間は、十分な結合時間を提供することと、RNA分解の可能性を最小限に抑えることとの間の妥協点です。

1時間後、Gの660倍で摂氏4度で2分間遠心分離し、ストレプトアビジンビーズを除去します。上清を15ミリリットルのチューブに移します。ライセートの1/50および1/100の容量をそれぞれRNAおよびタンパク質の単離のために取っておきます。

1ミリリットルの迅速溶解バッファーをビーズに加えます。ピペッティングで混合し、新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移し、摂氏4度で2分間Gの660倍で遠心分離します。迅速溶解バッファーでさらに3回洗浄します。

急速溶解バッファーでの最終洗浄後、上清を除去し、1ミリリットルの急速洗浄バッファーを加え、摂氏4度で5分間回転させます。遠心分離し、急速洗浄バッファーでさらに2回洗浄します。ビーズを1ミリリットルのPBSで洗い、前と同じように遠心分離します。

上清を取り除き、ビーズに120マイクロリットルのPBSを加え、ローラー内で5分間回転させます。前と同じように遠心分離し、RNAおよびタンパク質抽出用のすべての上清を洗浄サンプルとして収集します。RNAおよびRNA関連タンパク質を溶出するには、PBS中の6ミリモルビオチン120マイクロリットルをビーズに加え、摂氏4度で一定の回転で45分間インキュベートします。

ビーズを遠心分離し、逃れた材料を新しい1.5ミリリットルチューブに移します。溶出したサンプルを再度回転させ、上相を新しい1.5ミリリットルチューブに移して、ビーズのキャリーオーバーがないことを確認します。RNAまたはタンパク質抽出用のサンプルを採取します。

RNAの単離効率と品質を決定するために、2つのタグ付きRNAに対してノーザン分析を実施しました。PMP1およびFPR1は、キャスト細胞溶解、迅速細胞溶解、およびビオチンによる溶出後から得られます。リボソームRNAはエチジウムブロマイド染色によって検出され、溶出サンプル中にリボソームRNAが欠如していることは、精製の厳密性を示しています。

精製の厳密性と特異性は、溶出サンプルにタグなしMRNAのシグナルがないことによってさらに実証されます。FPR1レーンの見かけの信号は、ACT1のサイズではありませんが、MS2Lプローブとの以前のハイブリダイゼーションの名残です。インプットRNAは、Hot Phenolプロトコルで精製されたRNAと比較してやや分解されていますが、溶出画分の強いシグナルによって明らかなように、かなりの量の完全長タグ付きRNAが特異的に単離されます。

タンパク質サンプルは、プロテオミクス分析の前にSDS-PAGEおよび銀染色で分析できます。矢印で示されているMS2-CP-GFP-SBP 融合タンパク質は、同等のタンパク質負荷を示しています。アスタリスクは、強度の異なるバンドを示しており、後で質量分析のためにゲルから切り出されました。

この手順を試みる際には、手袋を着用し、作業エリアを清潔に保ち、RNAを含まない水で溶液を調製し、迅速かつ効率的に作業してプロトコール時間を短縮することが重要です。フェノールやホルムアルデヒドなどの試薬の取り扱いは非常に危険である可能性があるため、この手順を実行する際には、ケミカルフードでの作業などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。このビデオを見れば、fayn-tressとその関連体のRNAを効率的かつ効果的に精製する方法を十分に理解できるはずです。

この手順に続いて、目的の転写産物に結合するRNAを検出するために、RNA-Seqなどの他の方法を実行できます。