「ファゴソーム閉鎖アッセイ」全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）を用いて、三次元的にファゴソーム形成を可視化します

このプロトコルの全体的な目標は、全反射蛍光法(TIRF Microscopy)を使用して、生きているマクロファージのファゴソーム形成とファゴソーム分裂の正確な部位を3Dで視覚化することです。この方法は、TIRF顕微鏡法と落射蛍光法を組み合わせて、偽足伸展およびチップ融合中の2つの異なる蛍光タンパク質の段階的な局在をモニターします。この手法は、臨界角を決定し、原形質膜の近くについて結論を出すために重要なTIRF信号を取得するための体系的な方法を提供します。

TIRF顕微鏡セッションの前日に、加熱チャンバーを摂氏37度にオンにして、顕微鏡ステージを均一に加熱できるようにします。翌朝、100マイクロリットルのPBSを使用し、0.1%BSAを補充して、35ミリメートルのガラス底皿あたり6番目の羊の赤血球またはSRBCに7x10を2回洗浄しました。2回目の遠心分離後、細胞を500マイクロリットルのウサギIGG抗SRBCsに再懸濁し、細胞5マイクロリットルあたり0.1%BSAを添加したPBSで、低凝集濃度で、細胞をゆっくりと回転させて30分間インキュベー

インキュベーションの終了時に、SRBCをPBSとBSAで2回洗浄し、皿ごとに2ミリリットルの摂氏37度の無血清顕微鏡培地に細胞を再懸濁します。次に、35mmのガラス底皿を2mlの0.1%poly-Lリジンで室温で30分間処理し、続いて2mmLのPBSで2回洗浄します。SRBCの非共有結合固定には、2ミリリットルのIGGオプソニン化細胞をポリリジンコーティングされた各皿に注ぎ、スイングローター遠心分離機でサンプルを遠心分離します。

上清を捨て、粒子を2ミリリットルのPBSと10%BSAで1回洗います。次に、粒子を2ミリリットルの新鮮なPBSと10%BSAで室温で30分間インキュベートし、続いて2ミリリットルのPBSで3回洗浄します。最後の洗浄後、PBSを2ミリリットルの摂氏37度の無血清顕微鏡培地と交換します。

SRBCコーティングされたディッシュを顕微鏡ステージに置きます。次に、トランスフェクションした目的の細胞を培養皿の底から掻き取り、細胞を数回ピペットで動かして単一細胞懸濁液にします。トランスフェクションした細胞をSRBCコーティングシャーレに加えます。

ライブ取得ソフトウェアを起動します。蛍光タグ付きタンパク質を発現する細胞を見つけ、目的の細胞がフィールドの中央に来るようにディッシュの位置を調整します。1つの励起波長で、0から5%までの異なる角度で0.01度刻みで500枚の画像を取得します。

入射光がガラス-媒質界面で完全に反射され、エバネッセント波を生成する臨界角を決定するには、適切なイメージングソフトウェアで画像シーケンスを開きます。均一な蛍光を持つ細胞内の関心領域を選択します。次に、[イメージ] タブで [スタック] を選択し、[Z 軸プロファイルをプロット] を選択します。

z軸プロファイルをプロットするには、x軸上の角度の関数を使用して、対象領域で測定された蛍光強度の平均。臨界角よりも優れたx軸上の任意の角度値を、顕微鏡セッション中に使用してTIRF信号を取得できます。次に、ライブ取得ソフトウェアで、プロトコルエディタを使用して取得のパラメータを設定します。

これには、ループ取得シーケンスの数、蛍光チャンネルとそのレーザー強度、TIRF角度、露光時間が含まれます。対物レンズのZ移動を落射蛍光モード面に到達するように設定します。次に、落射蛍光モードでTIRF角度を1に設定し、対物レンズのZ移動をTIRF平面に戻します。

次に、明るい光のLEDモードでセルの画像を取得します。次に、蛍光タグが付けられたタンパク質発現が中程度のレベルで、SRBCと食作用する目的の細胞を見つけ、その細胞をフィールドの中央に移動します。このような細胞は、粒子の周りの伸長した原形質膜によって識別できることに注意してください。

[ループ カウント] タブにフレーム数を入力して、500 から 1, 000 フレームのストリーミング集録を開始します。必要に応じて、レーザーの強度と露光時間を変更して、細胞内のさまざまなレベルの蛍光に適応します。2つのチャンネルに対応する2つの別々の画像シーケンスを生成するには、Imagineソフトウェアでシーケンスを開き、[Image]タブをクリックします。

「Hyperstacks」メニューで、「Stack to Hyperstack」を選択します。次に、ポップアップウィンドウで、[順序]にxyctz、[チャネル]に使用する蛍光色素の数、[z軸]のスライスの数、[フレーム]の下の画像の数をチャネル数で割った値、[表示モード]に[グレースケール]を入力します。次に、チャネルを分割します。

ここでは、IGGオプソニン化SRBCを巻き込んだ生の264.7マクロファージにおけるファゴソーム閉鎖アッセイの代表的な生細胞TIRF顕微鏡動画を示します。ガラスカバーと対向する疑似足の先端がSRBCの周りを覆うと、TIRF領域にF-アクチンリングが検出され、それが閉じるまで徐々に狭くなります。並行して、エピフルオレッセンスによって検出されたぼやけたF-アクチン信号は、TIRF領域の3ミクロン上にステージをシフトした後、食細胞カップの基部での解重合に対応します。

3分後、透過光イメージングによって確認されたように、SRBCは完全に内部化されます。この方法を用いると、食作用カップの基部におけるアクチンの細胞内コンパートメントの限局性エキソサイトーシスが起こり、実証できる。その取得後、細胞をさらに処理して相関電子顕微鏡にするか、全細胞集団を固定して凍結処理して古典的な免疫蛍光顕微鏡に加工することができます。

食作用は温度に非常に敏感であるため、加熱チャンバーと培養皿培地内の温度は、手順全体を通して摂氏37度に一定に維持する必要があることに留意することが重要です。このビデオを見れば、粒子のオプソナイズ方法、粒子でカバースリップをコーティングする方法、TIRF顕微鏡法の臨界角度を決定する方法、生細胞食作用中の対象タンパク質の局在化の画像化方法について十分に理解できるはずです。