Name: 塩化第二鉄誘発性マウス血栓症モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: 学ぶマウス頸動脈血栓症モデルにおける塩化第二鉄誘導法と生体蛍光顕微鏡観察技術。この方法は抗凝固薬・抗血小板薬の効果評価や新規治療法開発に有用です。

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この作業は、国立衛生研究所の国立心肺血液研究所(NHLBI)によって、R01 HL121212 (PI: Sen Gupta)、R01 HL129179 (PI: Sen Gupta, Co-I: Li)、R01 HL098217 (PI: Nieman)の賞番号で支援されました。この出版物の内容は著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

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<li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vav+guanine+nucleotide+exchange+factors+link+hyperlipidemia+and+a+prothrombotic+state%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Vav guanine nucleotide exchange factors link hyperlipidemia and a prothrombotic state.</a> Blood. , (2011).</li>
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<li>Gupta, N., Li, W., Willard, B., Silverstein, R. L., McIntyre, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteasome+proteolysis+supports+stimulated+platelet+function+and+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Proteasome proteolysis supports stimulated platelet function and thrombosis.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, 160-168 (2014).</li>
<li>Srikanthan, S., Li, W., Silverstein, R. L., McIntyre, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+poly-ubiquitin+inhibits+platelet+activation%2C+downregulates+CD36+and+inhibits+pro-atherothombotic+cellular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Exosome poly-ubiquitin inhibits platelet activation, downregulates CD36 and inhibits pro-atherothombotic cellular functions.</a> J Thromb Haemost. 12, 1906-1917 (2014).</li>
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<li>Le Menn, R., Bara, L., Samama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+of+a+model+of+thrombogenesis+induced+by+mechanical+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Submicrosc+Cytol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure of a model of thrombogenesis induced by mechanical injury.</a> J Submicrosc Cytol. 13, 537-549 (1981).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD36+participates+in+a+signaling+pathway+that+regulates+ROS+formation+in+murine+VSMCs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">CD36 participates in a signaling pathway that regulates ROS formation in murine VSMCs.</a> J Clin Invest. 120, 3996-4006 (2010).</li>
<li>Re-examining Acute Eligibility for Thrombolysis Task Force. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%2C+historical+context%2C+and+clarifications+of+the+NINDS+rt-PA+stroke+trials+exclusion+criteria%3A+Part+1%3A+rapidly+improving+stroke+symptoms%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Review, historical context, and clarifications of the NINDS rt-PA stroke trials exclusion criteria: Part 1: rapidly improving stroke symptoms.</a> Stroke. 44, 2500-2505 (2013).</li>
<li>Mumaw, M. M., de la Fuente, M., Arachiche, A., Wahl, J. K. 3rd, Nieman, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+monoclonal+antibodies+against+Protease+Activated+Receptor+4+%28PAR4%29%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of monoclonal antibodies against Protease Activated Receptor 4 (PAR4).</a> Thromb Res. 135, 1165-1171 (2015).</li>
<li>Mumaw, M. M., de la Fuente, M., Noble, D. N., Nieman, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+anionic+region+of+human+protease-activated+receptor+4+inhibits+platelet+aggregation+and+thrombosis+without+interfering+with+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Targeting the anionic region of human protease-activated receptor 4 inhibits platelet aggregation and thrombosis without interfering with hemostasis.</a> J Thromb Haemost. 12, 1331-1341 (2014).</li>
<li>Modery-Pawlowski, C. L., Kuo, H. H., Baldwin, W. M., Sen Gupta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+platelet-inspired+paradigm+for+nanomedicine+targeted+to+multiple+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">A platelet-inspired paradigm for nanomedicine targeted to multiple diseases.</a> Nanomedicine (Lond). 8, 1709-1727 (2013).</li>
<li>Anselmo, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-like+nanoparticles%3A+mimicking+shape%2C+flexibility%2C+and+surface+biology+of+platelets+to+target+vascular+injuries%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Platelet-like nanoparticles: mimicking shape, flexibility, and surface biology of platelets to target vascular injuries.</a> ACS Nano. 8, 11243-11253 (2014).</li>
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<li>Woollard, K. J., Sturgeon, S., Chin-Dusting, J. P., Salem, H. H., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythrocyte+hemolysis+and+hemoglobin+oxidation+promote+ferric+chloride-induced+vascular+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Erythrocyte hemolysis and hemoglobin oxidation promote ferric chloride-induced vascular injury.</a> J Biol Chem. 284, 13110-13118 (2009).</li>
<li>Ciciliano, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+the+multifaceted+mechanisms+of+the+ferric+chloride+thrombosis+model+using+an+interdisciplinary+microfluidic+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Resolving the multifaceted mechanisms of the ferric chloride thrombosis model using an interdisciplinary microfluidic approach.</a> Blood. 126, 817-824 (2015).</li>
<li>Barr, J. D., Chauhan, A. K., Schaeffer, G. V., Hansen, J. K., Motto, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+blood+cells+mediate+the+onset+of+thrombosis+in+the+ferric+chloride+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Red blood cells mediate the onset of thrombosis in the ferric chloride murine model.</a> Blood. 121, 3733-3741 (2013).</li>
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<li>Versteeg, H. H., Heemskerk, J. W., Levi, M., Reitsma, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+fundamentals+in+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">New fundamentals in hemostasis.</a> Physiol Rev. 93, 327-358 (2013).</li>
<li>Yan, S. F., Mackman, N., Kisiel, W., Stern, D. M., Pinsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia%2FHypoxemia-Induced+activation+of+the+procoagulant+pathways+and+the+pathogenesis+of+ischemia-associated+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Hypoxia/Hypoxemia-Induced activation of the procoagulant pathways and the pathogenesis of ischemia-associated thrombosis.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 19, 2029-2035 (1999).</li>
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<li>Liu, J., Li, W., Chen, R., McIntyre, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+biologically+active+oxidized+phospholipids+show+on-going+and+increased+oxidative+stress+in+older+male+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Circulating biologically active oxidized phospholipids show on-going and increased oxidative stress in older male mice.</a> Redox Biol. 1, 110-114 (2013).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

FeCl 3 -誘発モデルは、血小板機能および血栓症7,8,16,19,31-33上の遺伝子改変に関する貴重な情報を提供することができるだけでなく、貴重なツールとなりうる最も広く使用されている血栓症モデルの一つであり、アテローム血栓性疾患11,17,34-37の治療および予防のための治療化合物および戦略を評価するため。ここでは、私たちの修正と、このモデルの改良を示し、抗凝固因子（tPA）および抗血小板薬（PAR4抗体）の効果を決定するのに十分に敏感であり、この技術の有用性の追加の証拠を示しています。血栓症の機序研究に加えて、モデルは、ナノテクノロジーベースの血栓標的薬物送達を研究するために利用することができます。また、蛍光ROSインジケータ21の注射による血管壁の反応性酸素種（ROS）形成の検出に使用することができます。 細部まで行き届きました技術は、これらのモデルを実行するために必要です。オペレータは十分な外科的なスキルだけでなく、血管や血液細胞生物学の深い理解を持っている必要があります。 ...

動脈血栓症（血の塊）は、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、肥満、癌および慢性自己免疫リウマチ性疾患などの慢性炎症に関連する多くの全身性疾患の一般的な合併症です。不適切な血小板活性化、凝集及びその後の凝固機構から動脈循環ステムで発生し、血栓は、心臓発作、脳卒中及び四肢の喪失に関与しています。血管壁は、血管壁内の血液細胞、ホルモンおよびサイトカイン、ならびに抗酸化タンパク質の発現を循環する、複数の細胞型を含み、剪断応力を含む外因性の要因の多くに影響される複雑なシステムである。 インビトロ実験は複製できませんこの複雑な環境、従って、動物モデルを用いたin vivo試験では、血栓性疾患に関与するメカニズムのより良い理解を可能にするために重要です。 マウスは、シムを有することが示されています血栓症、アテローム性動脈硬化症、炎症および糖尿病1,2の点でヒトへのILARメカニズム。さらに、トランスジェニックおよびノックアウトマウスは、複雑な生理学的または病理学的環境の特定の遺伝子産物の機能をテストするために作成することができます。このような研究は、ヒト病理を模倣し、新たな経路および治療法の発見に関連する重要な機構的情報を提供するだけでなく、血栓症に対する薬物の効果を特徴づける重要な詳細を提供することができます。 病的な動脈血栓は、内皮下マトリックス3,4への血流の層損傷または機能不全と露出を内皮に起因起こります。種々の血栓症モデルは、機械的損傷、光反応性化合物ローズベンガルベースの酸化損傷およびレーザー損傷5として内皮損傷を誘導するために開発されてきました。このスペクトルでは、塩化第二鉄（FeCl 3を）は、血管損傷は血栓症の広く使用されているモデルである誘発しました。この試薬とき容器の外側の側面に適用され、血小板および凝固カスケードの成分を循環から内皮細胞の保護の損失、血管細胞6-8の酸化的損傷を誘発します。 FeCl 3モデルは、単純かつ抗凝固剤および抗血小板薬の両方に対して敏感であり、マウス、ラット、モルモット及びウサギ6-15に頸動脈及び大腿動脈、頸静脈、および腸間膜および精巣挙筋細動脈と細静脈上で実行されています。 このモデルにおける一つの測定可能なパラメーターは、ドップラー流量計または生体顕微鏡の6,7,9と直接観察下血流停止として測定し、血管閉塞を完了するために損傷からの経過時間です。 5〜30分の間の時間の範囲は、FeCl 3を濃度が、麻酔、外科技術、マウスの年齢の種類、ゲノム背景、Bを測定する方法を示唆し、C57BL6マウス7-10,16異なる研究で報告されていますloodフロー、および他の環境変数は、このモデルにおいて有意な効果を有します。この広い可変性は、それが困難な異なる研究グループからの研究を比較することになり、微妙な差異の検出が困難になることができます。 このような変動性を最小化し、 生体内のモデル系で均一に再現性を確立するためのビジョンでは、我々は最小限の変動6-10,16-19と再現性の高いデータを作成するのFeCl 3 -誘発性頚動脈モデルに磨きをかけてきました。本稿では説明し、スキルを共有し、このモデルの恩恵を受けることができるいくつかの代表的な実験例を報告しています。

<table><tbody><tr><td>外科用ハサミ - Tungsten Carbide</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>14502-14</td><td>皮膚をカットして保持</td></tr>する <tr><td>Micro-Adson 鉗子 - 鋸歯状/ストレート/12 cm</td><td>ファイン サイエンス ツール&nbsp;</td><td>11018-12</td><td>カット アンド ホールド スキン</td></tr><tr><td>メッツェンバウム フィノ はさみ - タングステン カーバイド/カーブ/ブラント - ブラント - ブラント/14.5 cm</td><td>ファイン サイエンス ツール&nbsp;</td><td>14519-14&nbsp;&nbsp;</td><td>軟部組織を解剖し、分離する</td></tr><tr><td>ウルトラファイン止血 - スムース/カーブ/12.5cm</td><td>ファインサイエンスツール&nbsp;</td><td>13021-12</td><td>軟部組織</td></tr><tr><td>Graefe 鉗子 - 鋸歯状/ストレート/10 cm</td><td>ファイン サイエンス ツールを</td>解剖して分離する&nbsp;<td>11050-10</td><td>軟部組織を解剖して分離する</td></tr><tr><td>デュモン #5 ファイン フォーセプス - 生物学のヒント/ストレート/イノックス/11 cm</td><td>ファイン サイエンス ツール&nbsp;</td><td>11254-20&nbsp;</td><td>血管を周囲の組織から分離</td></tr><tr><td>デュモン #5XL 鉗子 - 標準チップ/ストレート/イノックス/15cm</td><td>ファインサイエンスツール&nbsp;</td><td>11253-10</td><td>周囲の組織から容器を隔離</td></tr>する <tr><td>ブラントフック - 12 cm/0.3 mm 先端径</td><td>ファイン サイエンス ツール&nbsp;</td><td>10062-12</td><td>周囲の組織から血管を隔離</td></tr>する <tr><td>Castroviejo Micro Needle Holders</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>12061-02</td><td>ニードルホルダー</td></tr><tr><td>縫合糸 4-0</td><td>ファインサイエンスツール&nbsp;</td><td>18020-40</td><td>切歯をプレートに固定するため</td></tr><tr><td>縫合糸 6-0</td><td>ファイン サイエンス ツール&nbsp;</td><td>18020-60</td>すべての<td>手術と結紮のために</td></tr><tr><td>カルト縫合針</td><td>ファインサイエンスツール&nbsp;</td><td>12050-03</td><td></td></tr><tr><td>ローダミン 6G&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>83697-1G</td><td>血小板</td></tr><tr><td>FeCl3 (無水)</td> <td>シグマ</td><td>12321</td><td>血管損傷を誘発する</td></tr><tr><td>塩酸パパベリン</td><td>シグマ</td><td>P3510</td><td>腸の蠕動運動を抑制します。</td></tr><tr><td>Medlineの外科器具の殺菌の蒸気のオートクレーブのテープMedline</td><td></td><td>111625</td><td>版にマウスを固定するために</td></tr><tr><td>Fisherbrand&trade;&nbsp;シリンジフィルター - 滅菌 0.22 &micro;m</td><td>フィッシャー</td><td>09-720-004</td><td>マウスに注入された溶液の滅菌用</td></tr><tr><td>フィッシャーブランド&トレード;&nbsp;シリンジフィルター - 滅菌 0.45 &micro;m</td><td>フィッシャー</td><td>09-719D</td><td>FeCl3溶液をろ過するには</td></tr><tr><td>滅菌アルコール準備パッド</td><td>フィッシャー</td><td>06-669-62</td><td>手術部位を滅菌するには</td></tr><tr><td>アガロース&nbsp;</td><td>BioExpress</td><td>E-3120-500</td><td>ゲルステージを作るには</td></tr><tr><td>ライカDMLFS蛍光顕微鏡</td><td>ライカ</td><td></td><td>イントラバイタル顕微鏡</td></tr><tr><td>ジブラルタルプラットフォームとX-Yステージシステム 加熱プレートが取り付けられています。</td><td>npi electronic GmbH</td><td></td><td>http://www.npielectronic.de/products/micropositioners/burleigh/gibraltar.html</td></tr><tr><td>Streampixバージョン3.17.2ソフトウェア</td><td>NorPix</td><td></td><td>https://www.norpix.com/</td></tr></tbody></table>

塩化第二鉄誘発性マウス血栓症モデル

Ferric Chloride-induced Murine Thrombosis Models

動脈血栓症(血栓)は、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、肥満、癌、慢性自己免疫性リウマチ性疾患など、慢性炎症に関連する多くの全身性疾患の一般的な合併症です。血栓は、ほとんどの心臓発作、脳卒中、四肢の喪失の原因であり、血栓症は非常に重要な公衆衛生問題となっています。これらの血栓は不適切な血小板の活性化とその後の凝固に由来するため、これらのシステムを治療的に標的とすることは、より安全な治療法を開発するための重要な臨床的意義を持っています。止血系が複雑なため、in vitro実験では血液と血管壁の相互作用を再現することはできません。したがって、血栓形成の病理学的メカニズムを理解するためには、in vivo研究が重要です。この目的のために、マウスでさまざまな血栓症モデルが開発されています。その中でも、塩化第二鉄 (FeCl3) 誘発性血管損傷は、無菌閉鎖血管系のコンテキストで血小板の活性化と凝集を報告する閉塞性血栓症の広く使用されているモデルです。このモデルは、酸化還元誘発性内皮細胞損傷に基づいており、抗凝固薬と抗血小板薬の両方に単純で敏感です。血流を閉塞する血栓の発生に必要な時間は、血栓性疾患に関連する血管損傷、血小板活性化、凝集の定量的な尺度を提供します。このFeCl3誘発血管血栓症モデルを大幅に改良したため、データの再現性が高く、ばらつきが最小限に抑えられています。ここでは、モデルについて説明し、血栓症研究におけるこのモデルの有用性を実証するいくつかの実験設定からの代表的なデータを示します。

頸動脈血栓症モデル C57BL6背景を持つマウスでは、我々は出発点として、1分間血管を治療するために、7.5％のFeCl 3を使用することをお勧めします。 7.5％のFeCl 3の治療の下で、負傷したエリアと通常の血管壁の境界を容易に内皮層が著しく破損していたことを示唆している、（ オンラインビデオ1を参照してください）顕微鏡下で識別されます。血栓は、FeCl 3を治療直後に形成され、1分損傷後のすべてのWT C57BL6マウスにおいて観察されます。最初に形成された血栓は不安定であり、それらの部品は、通常、血流によって洗い流さ、このように形成された血栓が2で小さくなっている - 損傷後3分。ろ紙を除去した後、4分およびこれらの後に形成された血栓は安定しており、通常は洗い流されていません - 血栓は3からすると拡大し始めます。平均閉塞時間は、ときに7.5％FのC57BL6マウス（n = 14）...

私たちは、塩化第二鉄（FeCl 3を）の洗練された手順は、頸動脈や腸間膜動脈ならびに静脈に血栓症モデルを誘発血栓形成を閉塞性までの時間を監視するために生体顕微鏡を用いて、効率的特徴を報告しています。

Arterial thrombosis (blood clot) is a common complication of many systemic diseases associated with chronic inflammation, including atherosclerosis, ...

本手順の全体的な目的は、マウス頸動脈モデルにおいて塩化鉄誘発血栓症を惹起し、生体内顕微鏡で解析可能な再現性の高い結果を得ることにあります。これらのマウスは、血小板活性化および閉鎖血管系の凝集に関連するさまざまな疾患や遺伝的障害に関する重要な疑問を解決するのに役立ちます。本手法の主な利点は、簡便であり、抗凝固薬および抗血小板薬の両方に対して感度が高いこと、そして他の手法と組み合わせることが可能であることです。この手法は、血栓症の病態生理に関する貴重な知見を得て、新たなメカニズムや治療法を発見し、標的ナノ医療を含む新規薬剤の血栓症に対する効果を評価するために使用できます。正確な血流停止時間を取得するための戦略を習得するには、この手法の視覚的な確認が不可欠です。足指へのピンチ刺激に対する反応がないことを確認した後、小型の電気バリカンを用いて、8〜12週齢のマウスの頸部および上胸部の被毛を除去します。動物の目に中性石油系眼軟膏を塗布し、15 cm組織培養プレートの蓋の上にマウスを仰向けに固定します。4-0縫合糸を切歯に巻き付け、首をまっすぐに保つために縫合糸の両端を蓋にテープで固定します。その後、動物を手術用光源の下に移動させ、アルコールパッドを用いて手術部位を滅菌します。次に、マイクロアドソン鉗子で皮膚をつかみ、外科用ハサミを用いて2〜3 mmの切開を加えます。鉗子で切開部を保持したまま、ハサミの刃を閉じた状態で挿入し、皮下で胸骨柄に向かってハサミを押し進めます。その後、刃を開いて皮膚を皮下組織から剥離させます。次に、胸骨柄から舌骨まで正中切開を行い、微細止血鉗子とグレーフェ鉗子を用いて、顎下腺間の薄い筋膜を鈍的に剥離します。気管が露出したら、鉗子で胸骨柄の右側の軟組織を保持し、止血鉗子を筋膜の下、2時方向に向けて挿入します。止血鉗子の顎を開き、周囲の組織から頸静脈を遊離させます。次に、右頸静脈が露出するまで、筋膜、軟部組織、および皮膚を通して2時方向に向けて切開を続けます。ここで、100 µLのローダミン6G溶液が入った1 mLシリンジに30ゲージの針を装着し、持針器を用いて針先の2〜3 mmを90度に曲げます。その後、片手でシリンジを持ち、もう一方の手でGraefe鑷子を用いて頸静脈の遠位側の軟部組織を保持しながら、針を血管内に挿入します。ピンセットで針を固定し、ローダミンを注入します。血小板標識溶液をすべて投与した後、止血鉗子を開き、ピンセットの下に器具を挿入して注入部位の血管壁をクランプし、出血を防ぎます。その後、6-0縫合糸を用いて注入部位を結紮します。左顎下腺周囲の軟部組織および筋膜を鈍的に剥離し、腺を7時の方向へ牽引して左胸鎖乳突筋を露出させます。次に、左胸鎖乳突筋と肩甲舌骨筋および胸骨舌骨筋との間の筋膜を、気管の左側まで鈍的に剥離します。筋膜が除かれたら、15 cmの6-0シルク縫合糸を通した針を胸鎖乳突筋の中央の下に通し、縫合糸の両端を10時の方向へ外側に牽引します。胸骨甲状筋と肩甲舌骨筋を鈍的に分離し、総頸動脈を露出させます。次に、止血鉗子を用いて、動脈に触れないように注意しながら、総頸動脈から軟部組織を分離します。微細ピンセットを使用し、迷走神経と動脈を避けながら、総頸動脈周囲の外側筋膜を持ち上げます。次に、別の精密ピンセットを使用して、頸動脈と迷走神経の間の筋膜に穴を開けます。続いて、鈍端フックをその穴に通して頸動脈をそっと持ち上げ、動脈の下に精密ピンセットを差し込みます。フックとピンセットを動脈に沿って反対方向に動かし、血管から周囲の組織を約5 mm分、外膜の軟組織ごと剥離します。次に、U字型のプラスチック片を生理食塩水で洗浄し、フックを使用して動脈を慎重に持ち上げ、プラスチック片を動脈の下に配置します。このプラスチック片が背景の蛍光を遮断し、塩化鉄(III)溶液が周囲の組織に拡散するのを防ぐことで、顕微鏡下で頸動脈のみが見えるようにします。直ちに頸動脈に生理食塩水を2〜3滴滴下して湿らせます。次に、マウスを蛍光顕微鏡ステージの10X水浸レンズ下に移動させ、レンズと動脈の間の空間を生理食塩水で満たします。ここで、デジタルビデオ録画ソフトウェアアプリケーションを起動し、正常な血管の画像を取得します。血管壁が統合されており損傷がないことを確認した後、マウスをGibraltarプラットフォームに移動させ、ペーパータオルの角を用いて、手術野の頸動脈周囲にある生理食塩水を、動脈に触れないように注意深く吸い取ります。次に、先端の細いピンセットを使用して、塩化第二鉄飽和フィルターペーパーを、露出させた頸動脈の遠位端に近い位置に直接載せます。後ほど損傷の後半段階で血流を観察するため、近位側に短いセグメントを残し、露出した頸動脈の遠位端の近くにフィルターペーパーを配置するようにしてください。1分後、フィルターペーパーを取り除き、少なくとも 2 mL の生理食塩水で動脈を洗浄します。マウスを顕微鏡ステージに戻し、血管の画像を撮影します。血栓の形成は、蛍光標識された血小板の集積によって確認できます。最初の10分間は1分ごとに10秒間、その後は実験終了まで2分ごとに10秒間、血管の撮影を継続します。塩化第二鉄による損傷の5分後に組織プラスミノゲン活性化因子を注入すると、処置の約4分後に血栓溶解が開始されることが示されます。形成された血栓は、30分間の観察期間中に繰り返し大きさが変動することが観察されましたが、血小板介在性血栓の完全な消失は認められませんでした。PAR4の切断を遅延させるポリクローナルPAR4抗体による処置は、塩化第二鉄誘導性の頸動脈血栓症モデルにおいて、閉塞性血栓形成に至るまでの時間を有意に延長させます。血小板以外の赤血球を用いた標識実験により、塩化鉄誘導性の血栓は血管壁に付着した血小板のみで構成される一方で、赤血球は血栓内に捕捉され、時間の経過とともに血栓の形状や閉塞特性に寄与することが示されています。興味深いことに、初期の血栓は腸間膜動脈および静脈の損傷後約15秒以内に可視化されますが、腸間膜血管内での血栓形成は、腸間膜静脈では約17分、腸間膜動脈では24分近くまで大幅に遅延します。これは、少なくとも部分的には、腸間膜血管周囲の脂肪組織を通じた塩化鉄の拡散によるものと考えられます。この塩化鉄誘導血栓症モデルに習熟し、適切に実施すれば、習熟度に応じて約30分から60分で完了させることができます。本手順を実施する際は、この手法で測定されるのは損傷から完全閉塞に至るまでの経過時間であること、および正確な結果を得るためには血流を精密に観察することが極めて重要であることを忘れてはいけません。このモデルは、ex-vivoで処理した野生型血小板の輸血と組み合わせることで、血小板特異的なノックアウトを模倣し、調節経路や血小板の機能を定義するために利用することが可能です。この手法は、血管生物学分野の研究者が、血栓症における血小板の役割だけでなく、その他のさまざまな内皮炎症条件下での役割を探索することを可能にしました。このビデオを視聴することで、生体顕微鏡を用いて高い再現性を得ながら、マウスに塩化鉄誘導性の頸動脈血栓症モデルを作製する方法について十分に理解できるはずです。塩化鉄は極めて危険であるため、本モデルの作製に際しては、適切な個人用保護具の着用など、常に予防措置を講じることを忘れないでください。

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塩化第二鉄誘発性マウス血栓症モデル

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