Name: 迅速なワンステップ酵素合成とトレハロース類似体のすべての水精製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: 学ぶトレハロース類似体の迅速なワンステップ酵素合成とすべての水精製法。環境に優しい高収率プロトコルにより、結核菌検出プローブの製造や生物医学研究への応用が可能になります。

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この研究は、国立衛生研究所（R15 AI117670）からB.M.S.およびP.J.W.への助成金によって資金提供されました。また、リサーチコーポレーション（20185）からP.J.W. L.M.M.へのコットレルカレッジ奨学生賞は、CMUからのプロヴォストフェローシップによって支援されました。

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

トレハロース類似体は、食品や医薬品の保全から微生物感染症6の診断と治療のために、さまざまな分野に影響を与える可能性を持っています。既存の多段階の化学合成法（ 例えば 、天然に複雑なマイコバクテリア糖を生じる）の変形例の複数の部位を有する複雑なトレハロース類似体を製造するために有用です。しかしながら、これらの方法は、比較的簡単な一置換トレハロースアナログ9、13、14の合成に適用した場合であっても、常に長く、非効率的です。別の合成アプローチは、迅速かつ効率的に上記の領域内の値を有することができるトレハロース類似体の様々な種類を生産するために必要とされます。自然からのトレハロース合成酵素を利用する生体触媒のアプローチが最も有望です。いくつかのトレハロース合成経路が、自然界には存在し、我々はいくつかの理由のためのトレハロースアナログ合成のための理想的な酵素であることがT.のテナックス<...

トレハロースは、1,1-α、αグリコシド結合（ 図1A）によって結合された2つのグルコース部分からなる対称な非還元性二糖類です。トレハロースは、ヒトおよび他の哺乳動物には存在しないが、それは、細菌、真菌、植物、無脊椎動物1に一般的に見出されます。ほとんどの生物におけるトレハロースの主な役割は、乾燥1などの環境ストレスから保護することです。また、いくつかのヒト病原体は、細胞エンベロープ生合成のメディエーターとしておよび免疫脂質2の構築のためのビルディングブロックとしてトレハロースを用いる結核を引き起こす結核菌を含む、毒性のためにトレハロースを必要とします。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54485/54485fig1.jpg"> 図1： トレハロースとトレハロース類似体。 （Xは構造的な変更であり、天然トレハロースと不自然なトレハロースアナログの）構造。 （B）バイオプリザベーションとバイオイメージングにおける潜在的なアプリケーションを持っている文献に報告トレハロースアナログの例を。 、そのユニークな構造と生理機能に、トレハロースは、バイオ（テクノ）で使用するための論理的および生物医学的応用3を大きな注目を集めています。 nature- 例えばで観察されたトレハロースの保護特性は、その印象的な能力は4 -haveはバイオプリザベーション・アプリケーションでその広範な使用に拍車をかけ極度の脱水を受けた"復活"植物の生活を維持するのに役立ちます。トレハロースは、核酸、タンパク質、細胞、および組織3のような生物学的サンプルの広い配列を保存するために使用されてきました。例えば、トレハロースは、医薬品tの数で安定化添加剤として使用されています帽子は3いくつかの抗癌モノクローナル抗体を含む、市販されています。同様に、トレハロースは、食品業界で甘味料として使用され、それが広く両方食品および化粧品産業における製品の保存のために使用されます。商用アプリケーションのこれらの種類のトレハロースの採用は、当初、天然の供給源から、または合成により純粋なトレハロースの大量を得ることができないことによって制限されていました。しかしながら、澱粉からトレハロースの経済的な生産のための効率的な酵素的方法は、最近、広範な商業的使用に拍車をかけている、開発されています 5。 （ 図1Aに示される一般構造、 図1（b）に示すトレハロース類似体の具体例）化学トレハロース類似体と呼ぶ、トレハロース誘導体を改変、様々な用途にますます注目を集めている6。例えば、ラクトトレハロース、ガラクトースで置き換え、そのグルコース単位のいずれかのトレハロースアナログであり、従って、その4位のヒドロキシル基が反転立体化学構成を有しています。ラクトトレハロースはトレハロースと同様の安定化特性を有するが、ノンカロリー食品添加物6,7などが魅力的、腸の酵素による分解に耐性です。 トレハロース類似体における当社グループの持分は、主にマイコバクテリア特異的プローブおよび阻害剤としてのそれらの値に関係します。バリーとデイビス基は蛍光顕微鏡8によりその検出を可能にする、生結核菌の細胞壁を標識代謝することが示されたFITCケトトレハロース命名フルオレセイン共役ケトトレハロースアナログを開発しました。ベルトッツィラボは、代謝、細胞壁にラベルを付け、その後DET可能性が小さいアジドトレハロース（TreAz）類似体を開発しましたクリック化学と蛍光分析9を使用してected。これらの進歩は、結核のための画像診断剤としてトレハロースベースのプローブを使用する可能性を指します。トレハロース類似体はまた、生存率および病原10、11、12のために必須である細菌で経路を破壊するために、それらの潜在的に結核菌の阻害剤として追求されてきました。 これまで、バイオ（テクノ）論理及び生物医学的用途のためにトレハロースアナログを開発する主な障害は、効率的な合成方法がないことです。トレハロースの類似体を製造するには2つの伝統的なルートは、化学合成（ 図2）に依存しています。他が適切に官能単糖ビルディングブロックで始まり、に化学的グリコシル化を実行する必要が、一方の経路は、天然トレハロースの非対称化/変更を伴います1,1-α、αグリコシド結合を築きます。最近の総説13、14で議論されてきたこれらのアプローチは、 結核菌 15からそのようなスルホ脂質-1のような複雑なトレハロース含有天然物、少量の多段階合成を達成するために有用であることが判明しました。しかしながら、両方のアプローチは、非化学者に一般的に、時間がかかり、非効率的なアクセス不能であり、そして、さらに、環境に優しいとはみなされません。したがって、トレハロース類似体の特定の種類を合成するため、これらの戦略は理想的ではありません。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54485/54485fig2.jpg"> 図2： トレハロースアナログ合成へのアプローチ。化学は難しいPROTECを伴う多段階の手順を使用し、左に示し、トレハロースアナログ合成へのアプローチ化/脱保護、非対称化、および/またはグリコシル化のステップ。右側に示す酵素合成は、立体選択的に水溶液中で類似体をトレハロースするための簡単な、保護されていない基質を変換する酵素（複数可）を使用しています。本明細書で報告酵素プロトコルは、単一のステップでトレハロースの類似体へのグルコース類似体およびUDP-グルコースを変換するトレハロース合成酵素（TRET）酵素を使用しています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54485/54485fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> トレハロースアナログへの効率的な生体触媒ルートは、製造、評価し、分子のこの有望なクラスの適用を容易にするであろう。トレハロースの生産5用の市販の酵素処理は、それが基質として澱粉を使用しているため類縁体を合成に適応可能ではありませんが、他の生合成経路がありますトレハロースアナログ合成のために利用することができる自然の中での方法。しかし、最近6を検討したこの地域での研究は、制限されています。一つのレポートには、対応するフルオログルコースからの単一フルオロトレハロースアナログにアクセスするには、 大腸菌（Escherichia coli）トレハロース生合成経路に触発されたメソッドを使用していました。しかしながら、このアプローチは、限られた効率と汎用8を有する三酵素系を必要とします。探索された別のアプローチは、原理的にはグルコースアナログおよびグルコース-1-リン酸6、16、17からトレハロース類似体の一段階合成を可能にする逆方向にトレハロースホス（TREP）を使用することです。このアプローチは、将来有望であることができるが、両方の反転と保持TrePs現在アナログ合成のための欠点を有します。例えば、反転TrePsは法外EXPEを持っていますnsiveドナー分子（β-D-グルコース1-リン酸）と保持TrePsが悪い酵素発現収量/安定性と限られた基板の混乱を持っています。 TREP媒介アナログ合成が実用的である前に（酵素工学を介して、例えば ）重要な改善が必要とされるであろう。 現時点では、トレハロース類似体の酵素合成のための最も実用的なアプローチは、グルコースおよびウリジン二リン酸（UDP）は、単一のステップ6でトレハロースに-グルコース変換トレハロース合成酵素（TRET）酵素を使用することです。我々は最近、グルコース類似体およびUDP-グルコース（ 図3）19からトレハロース類似体を合成-to サーモテナックス TRET、耐熱性および一方向の酵素18の使用を報告しました。この酵素は、合成方向に動作し、TREPのシステムで検出されたトレハロースの劣化の問題を回避できます。このワンステップ反応coul1時間で完了さD、及び（高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によって決定されるように&gt; 99％まで）トレハロースアナログの広範な種々の高収率でアクセスされた容易に入手可能なグルコース類似体基質から（代表的な結果の表1を参照セクション）。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54485/54485fig3.jpg"> 図3： トレハロースアナログのTRET触媒による一段階合成。 T.テナックスからTRET酵素は、立体選択的に1ステップでトレハロースの類似体を形成するために容易に利用可能なグルコース類似体およびUDP-グルコースに参加することができます。 R 1〜R 4 =可変構造変更、例えばアジド、フルオロ、デオキシ、チオ、立体化学、または同位体ラベルの変更のため、 Yは、例えば、酸素または硫黄、または同位体標識されたヘテロための変数のヘテロ原子を=。 ここでは、広告を提供します発現および精製TRETの大腸菌から、最適化されたTRET反応条件、および完全に水性相で行われる改良された精製法を含む、TRET合成処理するためのプロトコルをetailed。この修正されたプロトコルは、セミ分取スケール（10-100 mg）を上の多様なトレハロースアナログの好都合かつ効率的な合成及び精製を可能にします。我々はまた、マイコバクテリア細胞の迅速な蛍光検出を有効にして1時間未満でマイコバクテリアにトレハロースベースのプローブを調製し、投与するために、このプロトコルの使用を実証します。

<table><tbody><tr><td>LB寒天</td><td>研究製品インターナショナル</td><td>L24021</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリンナトリウム塩</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>ルリアブロス</td><td>研究製品インターナショナル</td><td>L24045</td><td></td></tr>テ<tr><td>リフィックブロス</td><td>研究プロダクツインターナショナル</td><td>T15050</td><td></td></tr><tr><td>L-(+)-アラビノース</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>A3256</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>GE ヘルスケア</td><td>SH30256</td><td></td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>塩化</td>ナトリウム <td>BDH</td><td>BDH9286</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム、モノ塩基性</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ フィルター、0.45 &micro;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>09719D</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤ミニ錠剤、EDTA フリー</td><td>Thermo Scientific</td><td>88666</td><td></td></tr><tr><td>HisTrap HP ニッケルアフィニティーカラム、5 mL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5248-02</td><td></td></tr><tr><td>TRIS ベース超高純度</td><td>研究製品 International</td><td>T60040</td><td></td></tr><tr><td>透析チューブ、MWCO 12&ndash;14,000</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-152-16</td><td></td></tr><tr><td>グルコース類似体</td><td>CarboSynth、Sigma Aldrich、Santa Cruz Biotechnology、American Radiolabeled Chemicals</td><td></td><td>多数のグルコース類似体を提供するベンダーの例</td></tr><tr><td>6-アジド-6-デオキシグルコピラノース (6-GlcAz)</td><td>CarboSynth</td><td>MA02620</td><td></td></tr><tr><td>UDP-Glucose</td><td>abcam Biochemicals</td><td>ab120384</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>M33</td><td></td></tr><tr><td>アミコンウルトラ-15 遠心フィルターユニット</td><td>EMD ミリポア</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>バイオレックス RG 501-X8 混合床イオン交換樹脂</td><td>バイオ・ラッド</td><td>444-9999</td><td></td></tr><tr><td>エクストラファイン バイオゲル P2 担体</td><td>バイオ・ラッド</td><td>150-4118</td><td></td></tr><tr><td>ガラス裏打ちシリカゲル薄層クロマトグラフィープレート</td><td>EMD ミリポア</td><td>1056280001</td><td></td></tr><tr><td>n-ブタノール</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>A399</td><td></td></tr>エ<tr><td>タノール</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>S25310A</td><td></td></tr><tr><td>硫酸</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A300</td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>EMDミリポア</td><td>AX0145</td><td></td></tr>酸化<tr><td>重水素、99.8%</td><td>アクロス有機物</td><td>351430075</td><td></td></tr><tr><td>アミノプロピルHPLCカラム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>58338</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Ted Pella</td><td>18505</td><td></td></tr><tr><td>アルキン-488</td><td>Sigma Aldrich</td><td>761621</td><td></td></tr><tr><td>アスコルビン酸ナトリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>トリス[(1-ベンジル-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メチル]アミン (TBTA)</td><td>クリック ケミストリーツール</td><td>1061</td><td></td></tr><tr><td>tert-ブタノール</td><td>Sigma Aldrich</td><td>360538</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシ</td><td>ド Sigma Aldrich</td><td>W387520</td><td></td></tr><tr><td>硫酸銅(II) Sigma</td><td>Aldrich</td><td>C1297</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G 実装媒体</td><td>Southern Biotechnology</td><td>10001</td><td></td></tr></tbody></table>

迅速なワンステップ酵素合成とトレハロース類似体のすべての水精製

Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues

化学的に修飾されたトレハロースのバージョン、またはトレハロース類似体は、他の分野の中で、生物学、バイオテクノロジー、および製薬科学の用途を有します。例えば、検出可能なタグを有するトレハロースアナログは結核菌を検出するために使用されており、結核診断用造影剤としての用途を有することができます。トレハロースの加水分解的に安定したバージョンはまた、ノンカロリー甘味料およびbioprotective剤としての使用のためのそれらの潜在的に追求されています。様々なアプリケーションのための化合物のこのクラスの魅力にもかかわらず、彼らの可能性は、それらの製造のための強固なルートがないために満たされていないままです。ここでは、化学合成に関連する問題を回避トレハロース類似体の迅速かつ効率的な一段階の生体触媒合成のための詳細なプロトコルを報告します。 サーモテナックスから耐熱性トレハロースシンターゼ（TRET）酵素を利用することにより、トレハロースアナログはgeneratすることができグルコース類似体および15から60分で（定量的変換まで）高い収率でウリジン二リン酸グルコースから一工程で編。スピン透析とイオン交換で構成されて簡単かつ迅速な非クロマトグラフィー精製プロトコルは、わずか45として分で水溶液中の濃度が既知の多くのトレハロースの類似体を提供することができます。未反応のグルコース類似体が残る場合には、トレハロースアナログ生成物のクロマトグラフィー精製を行うことができます。全体的に、この方法は効率的で、非化学者にアクセス可能であるトレハロース類似体の迅速合成および精製のための「グリーン」生体触媒のプラットフォームを提供します。この方法の適用を例示するために、我々は、合成、すべての水精製、および1時間未満とマイコバクテリアの有効蛍光検出を取ったそのすべてがマイコバクテリアのトレハロースベースのクリック化学プローブの投与のためのプロトコルについて説明します。今後は、OTHの中で、ということを想定しますERアプリケーションは、このプロトコルは、結核の診断のためのトレハロースベースのプローブの迅速な合成に適用することができます。例えば、短寿命放射性核種修飾トレハロースアナログ（ 例えば 、18 F修飾トレハロース）は、陽電子放出断層撮影、コンピュータ断層撮影法（PET-CT）などの高度な臨床イメージング様式を使用することができます。

T.テナックス TRETは、標準的なタンパク質発現および精製技術を使用して、約4ミリグラム/ Lの収量で大腸菌から得ました。単一ニッケルアフィニティークロマトグラフィー工程は、（代表FPLCのトレースを図4に示されている）、大腸菌溶解物からTRETを精製するのに十分でした。 TRET合成プロセスに私たちの最初の出版物に設立されたように、組換えのT.テナックス TRETは、様々なグルコース類似体、多くの市販の-への高効率19と対応するトレハロースの類似体であるのの幅広いを変換することができます。私たちの最初に報告されたプロトコルを使用して、グルコース類似体を開始する数のHPLC-決定反応収率を与える表1は 、TRETの基板乱交および合成のためのその適合の範囲を示しています。アジド、フルオロ、デオキシ含む多様な構造変更、糖環の周りの異なる位置にチオ、および立体化学的修正が主な例外は4位での...

トレハロース類似体は、バイオ(テクノ)ロジカルおよびバイオメディカルアプリケーションのための重要な分子として浮上しています。トレハロース類似体を酵素的に合成および精製するための最適化された、シンプルで効率的、迅速、かつ環境に優しいプロトコールについて説明します。マイコバクテリア検出のためのプローブの迅速な製造と投与への応用が実証されています。

Chemically modified versions of trehalose, or trehalose analogues, have applications in biology, biotechnology, and pharmaceutical science, among other ...

この方法の全体的な目標は、病原菌の検出から生体材料の保存に至るまでの可能な用途を持つトレハロース類似体を迅速に合成および精製することです。これは、二糖類トレハロースの類似体へのアクセスを提供する、高速で高収率の方法です。これらの化合物は、生物医学およびバイオテクノロジー研究において、さまざまな確立された新しいアプリケーションを持っています。この方法は、ワンステップの酵素合成と全水系精製で構成されています。これらの手順を組み合わせることで、トレハロース類似体の従来の化学合成の欠点の一部に対処するのに役立ちます。これは、時間がかかり、収率が低く、環境に不利な場合があります。この方法の意味は、結核の原因物質である微小細菌結核のイメージングに修飾トレハロース類似体が使用されているため、結核の研究と診断にまで及ぶ可能性があります。この方法は、生物学的製品の保存やノンカロリー甘味料としての使用など、他の可能な用途のためのトレハロース類似体の合成と評価を加速するのにも役立ちます。手順を開始する前に、TreT発現大腸菌の一晩培養を準備します。TreT発現手順を開始するには、750ミリリットルの結核増殖培地を2, 800ミリリットルのFernbach培養フラスコに入れ、オートクレーブします。アンピシリンをブロスに加えて、1ミリリットルあたり100マイクログラムの最終濃度を達成します。紫外可視分光法用のキュベットを入手し、フラスコのブロスをブランクとして1つのキュベットに充填します。次に、調製したTreT発現大腸菌のオーバーナイト培養液を3ミリリットルフラスコに加えます。フラスコを摂氏37度でインキュベートし、200rpmで振とうします。600ナノメートルのブロスの吸光度をブロスブランクに対して定期的にチェックします。600ナノメートルの吸光度が0.5〜1.0の場合、フラスコに750マイクロリットルのアラビノースを加えてTreT発現を誘導します。200rpmで振とうしながら、37°Cで一晩培養物をインキュベートします。次に、培養物を1リットルのポリプロピレン遠心分離瓶に入れ、培養物を4,000倍Gで摂氏4度で15分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを15ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁します。懸濁液を円錐形の遠心分離管に移し、同じ条件下で遠心分離します。次に、上澄みを捨て、必要に応じてペレットを摂氏マイナス80度で保管します。プロテアーゼ阻害剤ミニ錠剤を20ミリリットルの洗浄緩衝液に溶解します。ペレットにプロテアーゼ阻害剤溶液を添加し、混合物をボルテックスしてペレットを再懸濁します。懸濁液を100ミリリットルのビーカーに移します。次に、懸濁液を超音波処理して、ビーカーの底から約1センチメートルのところにプローブを配置した細胞を溶解します。ライセートを金属製の円錐管に入れ、ライセートを摂氏4度でGの15, 000倍で60分間遠心分離します。シリンジフィルターでライセートをろ過します。高速タンパク質液体クロマトグラフィーでTreTを単離し、SDSページで純度を評価します。次に、4°Cで一晩透析することにより、TreTをTrisバッファーに交換し、トレハロースアナログ合成用のTreT溶液を形成します。透析洗浄からブランクを回収します。透析ブランクに対するUV-vis分光法により、TreT濃度を決定します。TreTを使用して20〜30ミリグラムスケールで6-アジド-トレハロースの合成を開始するには、0.08ミリモルの6-アジド-グルコース、0.16ミリモルのUDP-グルコース、および0.08ミリモルの二塩化マグネシウムを15ミリメートルの円錐管に入れます。Tret バッファーと Tris バッファーを追加します。必要に応じて混合物をトリス緩衝液で希釈し、最終容量4ミリリットルで酵素濃度300マイクログラム/ミリリットルを達成します。チューブにキャップをして反転させ、固形物を溶解します。反応混合物を300rpmで振とうしながら、摂氏70度で1時間インキュベートします。インキュベーション中に、3ミリリットルの脱イオン水を10キロダルトンの遠心フィルターユニットに入れ、すべての液体がチューブに入るまで3, 000倍Gで遠心分離します。フィルターユニットを完全にすすぐために、さらに2回洗浄を繰り返します。反応が完了したら、氷上で混合物を室温まで冷却します。次に、製品混合物を遠心フィルターユニットに移します。反応チューブを1ミリリットルの脱イオン水で3回すすぎ、各すすぎを遠心フィルターユニットに移します。すべての液体がチューブに入るまで、混合物を3, 000倍Gで遠心分離します。フィルターユニットに3ミリリットルの脱イオン水を加え、同じ条件で再度遠心分離します。製品の回収率を最大化するために、必要に応じてすすぎを繰り返します。濾液に3グラムの混合床イオン交換樹脂を加えます。混合物を攪拌棒で室温で1時間攪拌します。攪拌後、上清をデカントしてろ過します。5ミリリットルの脱イオン水で樹脂をすすぎ、すすぎをろ過します。必要に応じて繰り返して、製品の回収率を最大化し、すべての濾液を結合します。結合した濾液を濃縮します。次に、未反応の6-GlcAz前駆体を確認するために、6-GlcAz、6-TreAz、濃縮製品、およびコスポットのスポットを含むシリカゲルTLCプレートを準備します。n-ブタノール、エタノール、脱イオン水の混合物でプレートを開発します。プレートが乾いたら、プレートを5%硫酸とエタノールに浸し、高温に設定して約5分間加熱して、スポットを視覚化します。未反応の前駆体が観察された場合は、サイズ排除カラムで生成物混合物を精製し、TLC分析を繰り返します。純粋なトレハロース類似体が得られたら、水を除去して乾燥した6-TreAz製品を得ます。TreT酵素ステレオは、グルコースアナログとUDP-グルコースを選択的に結合して、対応するトレハロースアナログを形成します。反応範囲には、ステレオ化学デオキシフルオロ、チオ、およびアジド修飾が含まれます。ただし、リング上の4つの位置にある置換基は、忍容性が低くなります。この手順を用いて、グルコース類似体6-GlcAzは、TLCによって確認されたように、60分以内にトレハロース類似体6-TreAzに定量的に変換されました。純粋な生成物は、ノンクロマトグラフィースピン透析イオン交換精製法で単離され、HPLC中のNMRによって特徴付けられました。次に、純粋な6-TreAz溶液を使用して、モデル細菌M.smegmatisのアジド標識を行いました。その後、細胞表面アジ化物とのクリックケミストリー反応による蛍光色素の標識により、機能性トレハローストランスポーターを有するM.smegmatisはアジ化物で首尾よく標識されたが、アジ化物を含まない株では標識されなかったことが示されました。一度習得すると、TreT触媒反応とその後の精製は、生産回収を最大化するために使用されるリンスステップの数に応じて、1〜4時間で実行できます。この手順を試みる際には、反応生成物を常にNMRとTLCまたはHPLCで分析し、その純度と構造を確認する必要があることを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、合成されたトレハロース類似体は、細菌イメージングプローブ、代謝トレーサー、酵素阻害剤、または生体分子安定化剤として評価または使用することができます。この方法は、研究者が安定同位体や放射性同位体標識などの修飾を施したトレハロース類似体を調製する方法を提供します。全体として、この方法でアクセス可能な化合物は、結核研究やその他の生物医学研究分野で役立つはずです。このビデオを見れば、TreT酵素の発現と精製の方法、TreTを使用してトレハロース類似体をワンステップで合成する方法、トレハロース類似体製品を精製する方法を十分に理解できるはずです。

rapid-one-step-enzymatic-synthesis-all-aqueous-purification-trehalose

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迅速なワンステップ酵素合成とトレハロース類似体のすべての水精製

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