Name: 遺伝子または薬物療法で使用するためのHIV-1産生を標的RNAの有効性および毒性の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: 学ぶHIV-1産生を標的とするRNA分子の有効性と毒性を評価する方法。shRNA、siRNA、リボザイムなどの複数設計を同時スクリーニングし、遺伝子治療や薬物療法の候補を迅速に同定できます。

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ここで紹介する作品は、（AGにDCB-120266、PPP-133377およびHBF-348967を付与）健康研究（CIHR）のカナダの研究所によってサポートされていました。

1.細胞およびトランスフェクション<ol><li>ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で培養HEK 293T細胞を、10％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補充しました。細胞培養培地中の2×10 5細胞/ mlの懸濁液を調製します。それぞれ、ウイルス産生のために、24ウェル、96ウェル、12ウェルプレートの各ウェルに細胞の生存および免疫活性化アッセイ細胞懸濁液の500、100〜1,000μLを加える（ 図2A）。 </li><li>静かにプレートを旋回し、5％のCO 2で37℃でO / Nそれらをインキュベートします。百分の50から70の密集度に細胞を増殖させます。 </li><li>トランスフェクションの計画によると、1.5ミリリットルのマイクロチューブ（例、 図2B）に試験RNAおよびそのコントロールの希釈液を準備します。 <ol><li>ウイルス産生アッセイのために、HIV-1発現プラスミド10ngの/μlの希釈を準備し、各チューブに10μlを添加します。次の5μMの試験RNAの希釈液および陰性対照RNを準備A. 25または100 nMの最終濃度のために、対応するチューブに各試験RNAおよび陰性対照希​​釈の2.5または10μLを加えます。 </li><li> C：細胞生存率アッセイのために、試験RNAおよびポジティブコントロールRNA、低分子量ポリIの10 mg / mlで希釈5μMの希釈液を準備します。それぞれ、100 nMまたはそれを200μg/ mlの最終濃度のために、対応するチューブに試験RNAまたは陽性対照RNA希釈液の2μlを添加します。 </li><li>免疫活性化アッセイのために、ステップ1.3.2で作成した試験RNAまたは陽性対照RNA希釈液の20μlのを追加します。それぞれ100 nMもしくは200 / mlの最終濃度、に対応するチューブに。 テストRNA発現プラスミドのために、試験RNAの5μM希釈液の代わりに、10 ngの/μlの希釈液を調製し、ステップ1.3.1のための25および100 ngの最終的な量を与える：注意してください。およびステップ1.3.2のための100 ngの。および1.3.3。 </li></ol></li><li>ウイルスのprodのための各トランスフェクションチューブにDMEMの50、25または75μLを加えますそれぞれuction、細胞の生存および免疫活性化アッセイ。ウイルス産生アッセイのために、次のステップの前にバイオセーフティレベル3（BSL3）研究室への細胞、準備トランスフェクションチューブをもたらします。 </li><li>トランスフェクションチューブにトランスフェクション試薬を順次2μlを添加して、複合体を形成することができるように、15〜20分間インキュベートします。使用される特定のトランスフェクション試薬のための材料の表を参照してください。 </li><li>滴下細胞培養プレートの対応する位置に各マイクロチューブから全トランスフェクション混合物を加えます。ゆっくり旋回し、5％のCO 2で37℃で48時間プレートをインキュベートします。 </li><li>細胞培養プレート中のHIV-1産生（セクション2）、細胞生存率（セクション3）と免疫活性化（セクション4）（ 図2C）を測定します 。 </li></ol> 2.ウイルス産生アッセイ<ol><li>インキュベーターから24ウェル細胞培養プレートを外し、静かにBSL3細胞培養内部のプレートを旋回フード。 HIV-1産生を定量化するために使用される96ウェル平底プレートに対応するウェルに、各ウェルからの上清150μlのを転送します。 注意：一般的なウイルスの定量アッセイは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）20、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）21によるウイルスRNAを定量することにより、HIV-1キャプシドタンパク質（P24）の発現を測定し、活性を測定することを含みますHIV-1 RT酵素。 2.2 2.5には、HIV-1 RT活性13,15,16を定量化する方法を説明する手順。 </li><li>ウイルスの破壊カクテル15（ 表1）の25μLを含む96ウェルプレートの対応するウェルに上清の5μlを採取し、。室温で5分間混合物をインキュベートし、放射能のワークステーションにプレートを転送します。 注：ステップ2.2。放射能ワークステーションがBSL3実験室で利用できない場合のみ必要です。プレートから除去する必要がない場合BSL3実験室は、2.3に進みます。放射性カクテルを25μlの代わりにウイルス/放射性崩壊カクテル（ 表1）の50μlを添加します。 </li><li>放射性カクテル15（ 表1）を準備し、ウイルス上清と混乱カクテルの各ウェルに25μlを添加します。 2時間37℃で培養します。 </li><li>スポット5ガラス繊維ディエチルアミノエチル（DEAE）フィルターマット紙で対応する四角の上に反応混合物μlのスポットが10分間乾燥させます。どの2つのサンプルが互いに直接ボーダーないように、他のすべての広場に反応混合物を発見。これは、ステップ2.6で分当たりのカウント（cpm）を決定する際にサンプル間のクロスオーバーを回避するのに役立ちます。 </li><li>紙は、95％エタノールで2つの1分間の洗浄、続いて2×生理食塩水クエン酸ナトリウム（SSC）緩衝液（ 表1）を用いて5分間、5倍洗浄します。論文は、サンプルバッグにそれらを乾燥し、密封することを可能にします。 </li><li>クリップサンプルバッグCOカセットにフィルターマット紙をntainingし、マイクロプレートシンチレーションカウンターにカセットを挿入します。実験に使用した[32 P] dTTPのバッチのために提供基準日と32 Pのためのcpmを読むためにカウンタを設定します。プレートマップを使用して、読んで、カウンタを開始するためにどのサンプルを選択します。 </li><li>任意のウイルスの定量法については、隣接する負の制御により、各試験RNAについて得られた値を分割し、試験RNAの各反復のためのHIV-1産生の阻害パーセントを取得するには100で、この値を乗算します。異なる濃度での異なる試験RNAを比較した結果の例を図3に提供されます。 </li></ol> 3.細胞生存率アッセイ<ol><li> / mlのMTT（3- [4.5ジメチル-2-チアゾリル] -2,5-ジフェニル2H-テトラゾリウムブロマイド）ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水で希釈した（インキュベーターから96ウェルプレートを取り外し、5 mgの20μlのを追加各ウェルにDPBS）。 Fプレートをインキュベートまたは37℃で3時間。 </li><li>洗剤（1％NP-40、イソプロパノール中4 mMの塩酸）を各ウェルへと酸性化イソプロパノール150μlを添加して、室温で2時間プレートをインキュベート。 </li><li>マイクロプレート分光光度計で570 nmの吸光度を決定します。 </li><li>隣接するトランスフェクション制御によって各サンプルについて得られた値を割ることにより、各陽性対照および試験RNAの相対MTT代謝を計算します。異なる試験RNAおよび陽性対照を比較した結果の一例を図4に設けられています。 </li></ol> 4.免疫活性化アッセイ<ol><li>インキュベーターから12ウェルプレートを取り外し、培地を吸引除去します。静かDPBSで細胞を2回洗浄し、各ウェルに（プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含む、 表1）冷溶解バッファ22の70μlを添加します。氷上で10分間、プレートをインキュベートします。 </li><li>マイクロチューブに細胞溶解物を移し、高速浸漬することにより、それらを凍結液体窒素中でチューブ。サンプルは解凍と3の合計2以上の凍結融解サイクルの繰り返しを許可します。 </li><li>細胞破片をペレット化し、4℃、15,700×gで15分間、溶解物を遠心分離します。新しいマイクロチューブに上清を移し、クマシーブルー（ブラッドフォード）メソッド23,24を用いてタンパク質濃度を決定します。 </li><li> 10％変性ポリアクリルアミドゲルに各試料からのタンパク質の75μgのを解決し、以前に25,26を説明したように、ニトロセルロース膜に移します。 </li><li>膜に電気泳動転写した後、蒸留水で洗浄し、1分間ポンソーS（ 表1）中で膜をインキュベートすることによってタンパク質バンドを明らかにする。 80と55 kDaので膜をカットするためのガイドとしてバンドおよびタンパク質ラダーを使用してください。 注：カットスルー所定の位置で膜をカットしていないことが容易であるように、ステップでは4.4のサンプルは、34キロダルトンまでの16×18 cm 2のゲル上で実行することができます興味のあるバンド。また、いくつかのゲルは、膜を切断回避するために、同じ試料を用いて実行することができます。 </li><li> 0.05％トゥイーン20（TBST、 表1）を含有するトリス緩衝生理食塩水ポンソーS染色を洗い流します。完全に膜をカバーするために、5％無脂肪乳でTBSTを追加します。 1時間攪拌しながら室温で膜をインキュベートします。 </li><li> 、ADAR1（110と150キロダルトン）、ホスホPKR（62キロダルトン）、およびホスホIRF3（47キロダルトン）に対して千1に希釈した3％ウシ血清アルブミン（BSA）とTBSTで膜をO / N及び抗体をインキュベートそれぞれトップ、膜の中央部および底部片のため。 </li><li>膜をTBSTで5分間、5倍、1時間（5,000 1に希釈）を5％脱脂乳およびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギ二次抗体を用いてTBSTでインキュベート洗います。 </li><li> TBSTで5分間膜5回洗浄し、製造元の指示に従って、フィルム上のバンドを可視化するために電気化学発光（ECL）ソリューションを適用します。 </li><li>フィルム上のタンパク質バンドを可視化した後、抗体剥離液で10分間、膜の中央と下部の部分を洗います。 IRF3（500中1で）総PKRに対する3％BSAを含むTBSTで膜をO / Nおよび抗体をインキュベート（千1時）、それぞれ中間及び底部片のため。繰り返しは、4.8を繰り返します。 4.9。 PKR膜（中央）、抗ウサギ二次抗体の代わりに、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスを用いました。 </li><li> TBSTで5分間膜5倍の底部片を洗浄し（5000で1に希釈）アクチンに対する抗体で1時間、3％BSAを含むTBST中で膜をインキュベートします。繰り返しは、4.8を繰り返します。 4.9。抗ウサギ二次抗体の代わりに、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスを用いました。異なる試験RNAおよびポジティブコントロールを比較した結果の一例を図5に設けられている。使用される特定の抗体のための材料の表を参照してください。 </li></ol>

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<li>Sarzotti-Kelsoe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+validation+of+the+TZM-bl+assay+for+standardized+assessments+of+neutralizing+antibodies+against+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization and validation of the TZM-bl assay for standardized assessments of neutralizing antibodies against HIV-1.</a> J Immunol Methods. 409, 131-146 (2014).</li>
<li>Campos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+lasting+control+of+viral+rebound+with+a+new+drug+ABX464+targeting+Rev+-+mediated+viral+RNA+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Long lasting control of viral rebound with a new drug ABX464 targeting Rev - mediated viral RNA biogenesis.</a> Retrovirology. 12, 1-15 (2015).</li>
<li>Zhu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRISPR%2FCas9+system+inactivates+latent+HIV-1+proviral+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">The CRISPR/Cas9 system inactivates latent HIV-1 proviral DNA.</a> Retrovirology. 12, 22(2015).</li>
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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

HIV-1産生アッセイを説明11,31標的部位をHEK293T細胞（ 図2）を使用して実施し、効果的なリボザイム13、shRNAを10,29のためのHIV-1 RNAをスクリーニングするために使用されるアッセイと類似して、siRNAの30、及びU1i RNAました。 HIV-1産生を定量するために異なる方法を使用して、ほとんどの研究は、候補RNAとHIV-1発現プラスミドのコトランスフェクションした後、ウイル​​ス産生の48時間を測定しました。 HIV-1の産生に続いて、未成熟ビリオンは、新しい細胞に感染することができる成熟ビリオン、となるようにHIV-1プロテアーゼによるそのポリタンパク質のタンパク質分解的切断を受けます。工程2.2に記載のHIV-1 RT酵素活性アッセイのために。 RT酵素が成熟ビリオンでのみアクティブになりますので、2.5に。、生産および成熟段階の両方が、評価されます。対照的に、カプシドタンパク質及びウイルスのRNAの両方の成熟と未成熟ビリオン中に存在してもよいです。したがって、p24のELI...

現在のHIV-1治療の限界は、それらが慢性疾患の進行を予防するために投与しなければならないことです。 HIV-1抵抗性Tリンパ球または造血幹細胞の移植、薬物療法1,2の非存在下でHIV-1複製の長期制御を提供する可能性があり、また、HIV-1の硬化を達成するのに有効なアプローチであり得ます3。 HIV-1複製に耐性細胞をレンダリングするための一つの方法は、自己移植4中に感染した個体の細胞内への抗HIV-1のRNAまたはペプチドをコードする1つ以上の遺伝子を挿入することです。いくつかの候補の抗HIV-1遺伝子は、任意の単一遺伝子をHIV-1抵抗性の発達を防止するために、2つの5または三6の組み合わせでいくつかの入力の臨床試験を用いて設計されています。 抗HIV-1 RNAは、免疫応答を誘発するそれらの低電位による組み合わせ遺伝子治療のために、彼らため上位候補の一つであります非常に短い遺伝子配列から転写されます。いくつかの抗HIV-1 RNAは、ウイルスの侵入及び統合を標的とするように設計されています。しかし、ほとんどの抗HIV-1 RNAは、ウイルスのライフサイクルの後の積分ステップ（ 図1）を標的とします。統合後の阻害剤は、このようなリボザイム7、shRNAは8とU1i RNAを9として、HIV-1調節タンパク質Tatのまたは改訂1、およびアンチセンスベースのRNAを標的とするHIV-1 RNAに異なる部位を標的、デコイRNAを含みます。抗HIV-1 RNAの有効性を比較するために使用されている方法は、10の候補のRNAをコードする遺伝子で形質導入した細胞におけるウイルス複製を監視し、一過候補RNAを発現するプラスミドでトランスフェクトした細胞におけるウイルス産生を測定し、HIV-1発現プラスミドを含みます-13。我々は以前に新しいリボザイム標的部位13-15ためのHIV-1 RNAをスクリーニングするために、HIV-1産生アッセイを使用しています。これらの方法は、以降、RNAのフォーマットを最適化するために洗練されています干渉分子は、shRNAのようプラスミドDNAから発現または合成siRNA 16として配信します。このアッセイは、ヒト胚性腎臓（HEK）293T細胞から成熟したウイルスの産生を測定し、HIV-1複製サイクルの後の積分ステップ（ 図1）を標的とする阻害剤の効果を比較するために使用することができます。統合前のステップを標的とする阻害剤は、このようなTZM-BL細胞感染性アッセイ17などの代替アッセイは、抗ウイルス効果を評価するために必要とされます。 診療所での抗HIV-1 RNAの送達のための主要な安全上の懸念は、人間のRNAまたはタンパク質、および先天性免疫センサーの活性化に対する潜在的なオフターゲット効果が含まれます。抗HIV-1 siRNAの毒性を評価するために、我々は、異なる細胞株16における細胞生存率アッセイを使用しています。我々はまた、二本鎖RNA、免疫センサーの活性化を測定し、RNA活性化プロテインキナーゼR（PKR）及び受容体3（TLR3）Toll様、並びにEXインターフェロンのPRESSIONは、遺伝子、ADAR1のP150を刺激しました。これらのアッセイは、抗HIV-1 RNAの有効性は、細胞の生存または免疫センサーの活性化の間接的な影響によるものではないことを確認するために使用することができます。彼らはまた、さらなる開発の潜在的な毒性を有する候補RNAを除くのに有用です。 次のプロトコルでは、新しい治療のRNAを識別し、既存のフォーマットを最適化するための手順が記載されています。方法は、HIV-1複製のRNAベースの統合後の阻害剤をスクリーニングするために有用であり、そのようなウイルスRNA 18または統合された標的とするように設計されたCRISPR / CASシステムの改訂媒介輸出を標的とする小分子などの他の統合後の阻害剤をスクリーニングするために適合させることができますHIV-1 DNA 19。

<table><tbody><tr><td>DMEM HyClone</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>FBS HyClone</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン Gibco</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養プレート、96 ウェル、24 ウェル、6 ウェル。</td><td>Corning</td><td>353075, 353047, 353043</td><td></td></tr><tr><td>Micro tubes Axygen</td><td>Corning</td><td>311-08-051</td><td></td></tr><tr><td>低分子量 Poly I:C</td><td>InvivoGen</td><td>3182-29-6</td><td></td></tr><tr><td>DharmaFECT-1</td><td>Dharmacon</td><td>T-2001-01</td><td>合成RNA用トランスフェクション試薬</td></tr><tr><td>TransIT-LT1</td><td>Mirus MIR</td><td>2300</td><td>RNA発現プラスミド</td></tr><tr>用トランスフェクション試薬<td>Nonidet P40 (NP-40)</td><td>USB</td><td>19628</td><td></td></tr><tr><td>[32P]dTTP</td><td>Perkin Elmer</td><td>BLU505H</td><td></td></tr><tr><td>poly(A) RNA template&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10108626001</td><td></td></tr><tr><td>オリゴ(dT)<サブ>12-18</サブ> DNAプライマー</td><td>サーモフィッシャー</td><td>18418-012</td><td></td></tr><tr><td>DEAE フィルターマット紙&nbsp;</td><td>Perkin Elmer</td><td>1450-522</td><td></td></tr><tr><td>マイクロプレートシンチレーションカウンター</td><td>Perkin Elmer</td><td>1450-024</td><td></td></tr><tr><td>MTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-2128</td><td></td></tr><tr><td>DPBS HyClone</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>マイクロプレート分光光度計</td><td>Bio-rad</td><td>1706930</td><td></td></tr><tr><td>Lysis buffer tablets</td><td>Roche</td><td>4693159001, 4906837001</td><td>プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤</td></tr><tr><td>微量遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 試薬</td><td>Bio-rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>ゲルランニングチャンバー</td><td>Hoefer</td><td>SE600</td><td></td></tr><tr><td>セミドライトランスファーセル</td><td>Bio-rad</td><td>1703940</td><td></td></tr><tr><td>Protein ladder EZ-Run</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP3603-500</td><td></td></tr><tr><td>ニトロセルロースメンブレン</td><td>Bio-rad</td><td>162-0094</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647-1006</td><td></td></tr><tr><td>抗体ストリッピングソリューション</td><td>ミリポア</td><td>2504</td><td></td></tr><tr><td>ECL - Pierce</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td></td><td></td>PI32106</tr><tr><td>ADAR1 抗体</td><td></td><td></td> Dr<td>. B.L. Bass</td></tr><tr><td>phospho-T446-PKR antibody</td><td>Abcam</td><td>ab32036</td><td></td></tr><tr><td>phospho-S396-IRF3 antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>4947</td><td></td></tr><tr><td>PKR antibody</td><td></td><td></td><td>from Dr. A. Hovanessian</td></tr><tr><td>IRF3 antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>11904</td><td></td></tr><tr><td>Actin 抗体</td><td>ミリポア</td><td>MAB1501</td><td></td></tr><tr><td>ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギ</td><td>KPL</td><td>474-1506</td><td></td></tr><tr><td>ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス</td><td>KPL</td><td>474-1806</td><td></td></tr><tr><td>ポンソーS&nbsp;</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>6226-79-5</td><td></td></tr></tbody></table>

遺伝子または薬物療法で使用するためのhiv-1産生を標的rnaの有効性および毒性の評価

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

>jove_content<HIV-1複製サイクルにおける統合後のステップを標的とするスモールRNA療法は、遺伝子治療の最有力候補の一つであり、HIV-1感染の薬物療法として使用される可能性を秘めています。統合後の阻害剤には、リボザイム、ショートヘアピン(sh)RNA、低分子干渉(si)RNA、U1干渉(U1i)RNA、およびRNAアプタマーが含まれます。これらの多くは、HIV-1発現プラスミドを用いた一過性の同時トランスフェクションアッセイを用いて同定されており、一部は臨床試験に進んでいます。有効性の測定に加えて、small RNAは、ヒトRNAの発現に影響を与え、細胞の成長および/または分化を変化させ、自然免疫応答を誘発する可能性について評価されています。ここで説明するプロトコルでは、HIV-1複製サイクルにおける統合後のステップを標的とするRNA分子の有効性および毒性を評価するために設計された一連の一過性トランスフェクションアッセイが記載されている。これらのアッセイを使用して、新しいリボザイムを同定し、HIV-1 RNAを標的とするshRNAおよびsiRNAのフォーマットを最適化しました。この方法は、新しい抗HIV-1 RNAのスクリーニングに有用であり、他のHIV-1複製のポストインテグレーション阻害剤のスクリーニングにも適応できるアッセイを迅速に提供します。

手順の一般的な概略図は、3つの試験RNAおよび図2Bに設けられたコントロールRNAのための例示的トランスフェクション計画を図2に示されています。ウイルスの産生および細胞生存率アッセイのために、各試験構築物のための読み出しは、陰性対照に正規化されます。各試験RNAは、その隣接する負の対照に対して標準化されるように複製が、セットでトランスフェクトされます。これは、例えば、陰性対照のすべてが最初にトランスフェクトされ、場合に生じ得る、複合体およびトランスフェクションの間の時間に関連した不正確なデータを避けるために行われています。 HIV-1は、免疫応答27,28に影響を与えることができるので、細胞の生存および免疫活性化アッセイは、HIV-1を発現するプラスミドの添加なしに行われます。 HIV-1 RNA（位置1498から1415で保存された部位を...

HIV-1複製サイクルの統合後のステップを標的とするRNA分子の有効性と毒性を評価する方法が説明されています。これらの方法は、新しい分子をスクリーニングし、既存の分子のフォーマットを最適化するのに役立ちます。

遺伝子または薬物療法で使用するためのHIV-1産生を標的RNAの有効性および毒性の評価

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

この手順の全体的な目的は、HIV-1の産生を標的とする新規RNAの有効性と毒性を比較することです。この手法は、ショートヘアピンRNAや小干渉RNA、リボザイム、RNAデコイなど、HIV-1の遺伝子治療や薬物治療に使用するための新しいRNA分子の同定に役立ちます。この技術の主な利点は、複数の新しいRNA設計を短期間で同時にスクリーニングできることです。この手法は、HIVに対する新規のRNA薬剤または遺伝子治療を評価するために設計されましたが、低分子化合物やCRISPRを用いたタスクなど、他のシステムにも適用可能です。私たちは、抗HIV効果を持つ多数のリボザイムをスクリーニングするための実験を計画していた際に、この手法を考案しました。まず、10% FPSおよび1%ペニシリン・ストレプトマイシンを含むDMEM中で、2 × 10⁵ cells/mLの濃度でヒト胚性腎臓293T細胞の懸濁液を調製します。ウイルス産生試験、細胞生存率試験、および免疫活性化試験のため、それぞれ24ウェル、96ウェル、および12ウェルプレートの各ウェルに、500 µL、100 µL、および1,000 µLの細胞懸濁液を添加します。プレートを緩やかに揺らし、37 °C、5% CO₂の条件下で、コンフルエンシーが50%から70%になるまで一晩インキュベートします。ウイルス産生試験では、HIV-1発現プラスミドを10 ng/µLに希釈して調製し、各試験チューブに10 µLずつ添加します。次に、テストRNAと陰性対照RNAの5 µM希釈液を準備します。次に、最終濃度を25 nMまたは100 nMにするため、各テストRNAおよび陰性対照の希釈液を、それぞれ対応するチューブに2.5 µLまたは10 µL加えます。細胞生存率アッセイでは、テストRNAの5 µM希釈液と、陽性対照RNAである低分子量poly(I:C)の10 mg/mL希釈液を準備します。最終濃度をそれぞれ100 nMまたは200 µg/mLにするため、テストRNAまたは陽性対照RNAの希釈液を2 µLずつ、対応するチューブに加えます。免疫活性化アッセイでは、細胞生存率アッセイ用に調製したテストRNAまたはポジティブコントロールRNAの希釈液を、最終濃度がそれぞれ100 nanomolarまたは200 micrograms per milliliterになるよう、対応するチューブに20 microlitersずつ添加します。次に、ウイルス産生、細胞生存率、および免疫活性化アッセイ用の各トランスフェクションチューブに、それぞれ50、25、または75 microlitersのDMEMを添加します。ウイルス産生アッセイを行う場合は、次のステップに進む前に、細胞と調製したトランスフェクションチューブをバイオセーフティーレベル3（BSL-3）研究室に移動させてください。トランスフェクション試薬を各トランスフェクションチューブに2 µLずつ順次添加し、複合体を形成させるため15～20分間インキュベートします。各マイクロチューブからトランスフェクション混合液全量を、細胞培養プレートの対応する位置に滴下します。プレートをゆっくりと円を描くように揺らし、37 °C、5% carbon dioxideの条件下で48時間インキュベートします。ウイルス産生アッセイを実施するため、24ウェル細胞培養プレートをインキュベーターから取り出し、BSL-3細胞培養フードへ移動させます。プレートを静かに揺すり、各ウェルの上清150 µLを、HIV-1産生量を定量するために使用する96ウェル平底プレートの対応するウェルに分注します。さらに、25 µLのウイルス破砕カクテルを含む96ウェルプレートの対応するウェルに、上清5 µLを分注します。混合物を室温で5分間インキュベートした後、プレートを放射能作業台に移します。次に、放射能カクテルを調製し、ウイルス上清および破砕カクテルが入った各ウェルに25 µLずつ加えます。プレートを37 °Cで2時間インキュベートします。反応混合液を5 µLずつ、グラスファイバー/DEAEフィルターマットペーパーの対応するマス目にスポットし、10分間乾燥させます。2x SSCバッファーを用いて、5分間の洗浄を5回行い、続いて95% ethanolで1分間の洗浄を2回行います。ペーパーを乾燥させた後、サンプルバッグに封入します。フィルターマットペーパーを含むサンプルバッグをカセットに固定し、そのカセットをマイクロプレートシンチレーションカウンターに挿入します。次に、カウンターを開始させます。いかなるウイルス定量法においても、各テストRNAで得られた値を隣接するネガティブコントロールの値で除し、この値に100を乗じることで、各テストRNAの繰り返し試行におけるHIV-1産生の阻止率（%）を算出します。細胞生存率アッセイを行うには、96ウェルプレートをインキュベーターから取り出した後、各ウェルに5 mg/mLのMTTおよびDPBSを20 µLずつ添加します。次に、プレートを37 °Cで3時間インキュベートします。各ウェルに界面活性剤を含む酸性イソプロパノールを150 µL添加し、プレートを室温で2時間インキュベートします。次に、マイクロプレートリーダーを用いて570 nmにおける吸光度を測定します。各ポジティブコントロールおよびテストRNAの相対的なMTT代謝量を、各サンプルの値を隣接するトランスフェクションコントロールで除して算出します。免疫活性化アッセイでは、12ウェルプレートをインキュベーターから取り出した後、培地を吸引し、DPBSを用いて細胞を穏やかに2回洗浄します。次に、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含む冷溶出バッファーを各ウェルに 70 µL ずつ加え、プレートを氷上で 10 分間インキュベートします。細胞溶解物をマイクロチューブに移し、チューブを液体窒素に浸して急速凍結させます。サンプルを融解させた後、さらに 2 回凍結・融解を繰り返し、計 3 回の凍結融解サイクルを行います。次に、細胞破砕液を15,700 ×g、4 °Cで15分間遠心分離し、細胞残渣を沈殿させます。その後、電気泳動およびメンブレンへの転写を行い、メンブレンをポンソー S 液に1分間浸してタンパク質バンドを可視化します。最後に、二回蒸留水で洗浄します。バンドとタンパク質ラダーを指標として、膜を80および55 kilodaltonsの位置で切断します。次に、0.05%TWEEN 20含有TBSまたはTBSTを用いて、ポンソーS染色の染料を洗い流します。5%脱脂粉乳含有TBSTを膜が完全に浸かるまで加え、室温で1時間、振盪しながらインキュベートします。メンブレンを、3% BSAを含むTBSTおよび、1:1,000に希釈したADAR、リン酸化PKR、およびリン酸化IRF3に対する抗体（それぞれメンブレンの上段、中段、下段用）に転移させます。4 °Cで振盪しながら一晩インキュベートします。翌朝、TBSTでメンブレンを5分間ずつ5回洗浄した後、5% 脱脂粉乳を含むTBSTおよび1:5,000に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギ二次抗体の中で1時間インキュベートします。フィルム上でタンパク質バンドを可視化した後、ストリッピング溶液を用いてメンブランの中央および下部の断片を10分間洗浄し、その後、中央の断片をPKR抗体で、下部の断片をIRF3抗体でインキュベートします。ポジティブコントロールとして、テキストプロトコルに従い、下部メンブランをActin抗体でプローブします。アッセイの一般的な概略図をここに示します。ここでは、3種類の試験用RNAと1種類のコントロールRNAを用いたトランスフェクション計画の例を示しています。ウイルス産生および細胞生存率アッセイにおいて、各試験コンストラクトの測定値は陰性対照に対して標準化されます。HIV-1株NL4-3を発現するプラスミドを導入した細胞を用いたHIV-1産生アッセイにおいて、ここに示したsiRNAのいずれかと共導入した細胞におけるRT活性の割合を、長いDicer基質ナンセンスsiRNAを導入した細胞と比較して算出し、HIV-1 RNAの保存領域を標的とするRNA干渉分子の最適長を特定しました。特定された最も効果的なsiRNAを用いて、導入細胞におけるMTTの代謝率を決定しました。二本鎖RNAであるpoly(I:C)は、最高用量においてのみ細胞生存率を低下させました。HIV-1 RNAの1498部位を標的とするsiRNAについては、その長さにかかわらず、細胞生存率に有意な低下は見られませんでした。ウェスタンブロットで示した通り、同一のRNAセットを用いて免疫活性化アッセイを評価しました。poly(I:C)がADAR1-p150の発現を活性化し、PKRおよびIRF3のリン酸化を誘導する条件下において、テストしたいずれのRNAについても、不活性化マーカーへの有意な影響は観察されませんでした。習得すれば、適切に実施することでこの手法は7日間で完了できます。本手順を行う際は、トランスフェクションのために高品質なRNAおよびDNA調製物を使用することが重要です。さらに、適切な陰性および陽性コントロールを含める必要があります。この手順に従い、形質導入された細胞へのHIV感染などの他の手法を用いることで、潜在的な抗HIV候補物質の長期的な有効性と毒性を評価できます。本技術の開発により、HIV RNAにおいてアクセス可能で保存された標的部位を特定し、それを標的とするリボザイム、shRNA、およびsiRNAの形式を最適化することが可能となりました。このビデオを視聴することで、ウイルス産生アッセイを用いてHIV産生を標的とする新しいRNA候補の有効性を迅速にスクリーニングする方法と、免疫活性化および細胞生存率アッセイを用いて潜在的な毒性を評価する方法について、十分に理解することができます。HIVおよび放射性標識ヌクレオチドを取り扱うことは極めて危険であることに留意してください。本手順を実施する際は、認定されたバイオセーフティー施設および放射線管理区域の使用など、常に適切な予防措置を講じてください。

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Research

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Immunology and Infection

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Source: Scarborough, R. J., et al. Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates a reverse transcriptase (RT) assay to assess the effect of a test RNA on virus-like particle (VLP) production. Cells are co-transfected with plasmids, and RT activity is measured as a quantitative indicator of VLP output. A decrease in RT activity reflects suppression of viral gene expression by the test RNA.

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学ぶHIV-1産生を標的とするRNA分子の有効性と毒性を評価する方法。shRNA、siRNA、リボザイムなどの複数設計を同時スクリーニングし、遺伝子治療や薬物療法の候補を迅速に同定できます。

遺伝子または薬物療法で使用するためのHIV-1産生を標的RNAの有効性および毒性の評価

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