Name: 単離されたワーキングラット心臓におけるグルコースおよび脂肪酸酸化の宿泊料金を決意するための方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: 学ぶ単離ワーキングラット心臓を用いたグルコース酸化と脂肪酸酸化の同時測定法。リアルタイムで心筋代謝適応と収縮機能を評価し、心血管研究におけるエネルギー需要変化の影響を解明する。

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この作業は、国立衛生研究所の助成金R00 HL112952(R.H.へ)、R01 HL108618(J.P.G.へ)、P01 HL051971、およびP20 GM104357によって支援されました。内容は著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

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<li>Webster, I., Smith, A., Lochner, A., Huisamen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sanguinarine+non-+versus+re-circulation+during+isolated+heart+perfusion--a+Jekyll+and+Hyde+effect%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Drugs+Ther%22%5BJournal%5D)">Sanguinarine non- versus re-circulation during isolated heart perfusion--a Jekyll and Hyde effect?</a> Cardiovasc Drugs Ther. 28, 489-491 (2014).</li>
<li>Belke, D. D., Larsen, T. S., Lopaschuk, G. D., Severson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+and+fatty+acid+metabolism+in+the+isolated+working+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Glucose and fatty acid metabolism in the isolated working mouse heart.</a> Am J Physiol. 277, R1210-R1217 (1999).</li>
<li>Iannaccone, P. M., Jacob, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rats%21+%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Rats! </a> Dis Model Mech. 2, 206-210 (2009).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

前のプロトコルが同時に分離された作業用ラット心臓におけるグルコース酸化および脂肪酸酸化を介して基板のフラックスを定量化する方法を詳しく説明します。測定値は、その後、ベースラインとストレス条件（ワークロードの変化、虚血再灌流、 等 ...）の下での基質代謝と心仕事との関係を決定するために記録された心臓機能パラメータに重ね合わせることができます。代謝/収縮の関係は、例えば、心不全および糖尿病のような既存の条件に影響されるかを評価することも可能です。また、遺伝的に改変されたげっ歯類の心臓は、心臓代謝と機能上の特定のタンパク質の影響を調べるために使用することができます。最後に、これらのパラメータの薬物および他の循環要因の影響を個別に試験することができます。解糖を介してグルコースのフラックスは常にグルコース酸化の速度と相関しないので、それはかもしれフォーマ単一の実験設定で両方の経路を介してグルコースフラックスの速度に従うことを的。 3 H 2 Oの放出が糖20のエノラーゼ段階の活性によって決定されるため、解...

臨床的関連哺乳類の心臓では、酸化的代謝経路、ATP生成と心仕事1を介して基板のフラックスとの間には強い正の相関があります。過去20年間、心臓の代謝と機能との間の複雑なリンクの調査は心臓代謝の変化は、収縮不全と心臓病2-4の異なるタイプの設定で可能性の病理学的構造の再構築のための原因であることを認識することがつながっています。したがって、ストレス、心臓の代謝リモデリングを支配するメカニズムの理解が心不全5-7の予防または治療のための治療標的の同定につながることが期待されます。 「心臓代謝の評価」に関する米国心臓協会（American Heart Association）からの科学的声明の最近の刊行物はトンのための科学界の関心の高まりを強調します研究8の彼のフィールド。心臓イメージングの技術進歩は今、心形態および機能の迅速かつ正確な評価を可能にしながら、しかし、心臓代謝のin vivoでの研究は限られており、負担のまま：核磁気共鳴（NMR）分光法およびポジトロン放出断層撮影（PET）イメージングはできますエクスビボこの日付.TO 9定常状態での心臓の高エネルギーリン酸代謝及びクレブス回路のアクティビティを追跡するために使用されるが、これらの技術は、高い運用コストによって、および酸化的代謝に様々な基板の寄与を決定することができないことに悩まされています心の準備作業は、酸化的代謝経路7,9に基板の唯一かつユニークな研究に利用可能な技術、同時にかつリアルタイムで、収縮機能とフラックスを表します。以下のプロトコールは、ラットを決定するために使用される試薬の調製および使用のガイドラインを提供することを目的と孤立した作業ラット心臓における基質利用のエス。 分離されたワーキングげっ歯類ハート装置技術は、ほぼ半世紀の古いですが、孤立した作業ラットの心臓の準備は、心血管研究のための選択の方法のまま。ランゲンドルフ心臓標本と同様に、作業げっ歯類の心臓は神経ホルモン、他の器官、および他の循環要因の交絡影響から独立して心臓パラメータの広い範囲を測定するための比較的簡単で信頼性が高く、安価な方法を提供しています。しかし、ランゲンドルフ灌流心臓とは対照的に、作業の心臓は、近生理学的な心臓の仕事、in vivoの条件に関連するレベルへの酸化代謝フラックスを生成するための前提条件を実行し続けています。この左心房に接続されたカニューレを介して左心室（LV）に潅流緩衝液を提供することによって達成され、LVがいっぱいとの契約としてされ、バッファは、決定された後負荷静水圧に対する大動脈ラインを介して排出されます。もともとニーリーや同僚10によって記述灌流装置の設計は、その後Taegtmeyer、HEMSとクレブス11によって改善されたが、それ以来はほとんど変更されています。元の装置で説明したように、収縮機能は、心拍出量の決意、メスシリンダーよりも多くを使用していないと大動脈と冠状動脈の流れ10,11を測定するためのストップウォッチを介して評価することができます。いくつかのベンダーは現在、完全な作業げっ歯類心臓灌流システムを提供しています。これらの市販の装置はflowprobes、圧力変換器、圧力 - 容積カテーテルと心臓機能データの取得および分析のために必要なすべての機器を用いて取得することができます。ベンダーは、自社の機器を持つ新しいユーザーを理解するために大規模なドキュメントやトレーニングセッションを提供します。また、いくつかの総説論文の作業心臓instrumに詳細プロトコルentationおよびげっ歯類12-15で心機能を測定するためのカテーテルの使用に関する。この理由のため、我々は簡単に潅流装置と記録装置のセットアップを言及します。現在のプロトコルではなく、同時に2つの主要なエネルギーは、正常な心臓で基質を提供し、グルコースの速度と長鎖脂肪酸酸化を測定するために実施することができる方法の説明ですでに利用可能な情報を補完することを目指しています。私たちは、サンプルの回収および処理するための試薬および緩衝液の調製から、データ分析のために、心筋の酸化的代謝の評価のための放射性標識されたエネルギー基質の利用に関わるすべての手順ここで説明します。 法の原則心筋細胞は、（脂肪酸（主に長鎖脂肪酸）および炭水化物の酸化的リン酸化からの収縮のためのエネルギーの大部分を生成glucoseおよび乳酸）。心は非常に限られた精力的な埋蔵量を有しており、循環から基板を提供するこれらのエネルギーの安定供給に依存しています。解糖経路を介したグルコースの異化は、その後、ミトコンドリア内膜のピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体によって脱炭酸さピルビン酸を生成します。アルブミンまたはリポタンパク質トリグリセリドの循環から抽出された長鎖脂肪酸は、第一の細胞質ゾル中のアシル-CoA分子に活性化し、続いてβ酸化経路を入力するカルニチンシャトルを介してミトコンドリアのマトリックスの内部に搬送されます。グルコースおよび脂肪酸の異化作用によって生成されるアセチル-CoA分子は、ミトコンドリア内膜を横切ってプロトン起動力を構築する電子伝達系によって使用される還元当量（NADH及びFADH 2）を生成するクレブス回路を燃料とATP合成酵素の活性を介してATPを生成します。水および二酸化炭素は、端副生成物でありますクレブス回路の内部で起こっている酵素反応。 14 C-及び3 H-放射性標識された基質の供給を単離し作業心臓に（例えば14 C放射標識グルコースおよび3 H放射性標識オレイン酸のような）その結果、14 CO 2及び3 H 2 Oの生成をもたらすであろうことができます定量的冠動脈流出物から回収されます。 14 CO 2の回収は、密封されたチャンバー内に単離された灌流心を保つことによって、それが心を出るときに、すぐに冠動脈流出物を回収することによって行われます。小さな陰イオン交換カラムは、冠状動脈流出物から3 H 2 Oを分離し、回収するために使用されます。処理されたサンプルからの放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定し、そして使用される放射性標識基質の比活性の知識を持って、それを個別におけるグルコースおよび脂肪酸のフラックスを定量することが可能です酸化は16,17の経路。

<table><tbody><tr><td>塩化ナトリウム(NaCl)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP358</td><td></td></tr>塩化<tr><td>カリウム(KCl)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP366</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム一塩基性(KH<サブ>2</サブ>PO<サブ>4</サブ>)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>P284</td><td></td></tr><tr><td>マグネシウム硫酸塩七水和物(MgSO<サブ>4</サブ>* 7H<サブ>2</サブ>O)</td><td>フィッシャーScientific</td><td>M63</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム (NaHCO3)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>AG 1-X8 樹脂、塩化物形態、100 - 200 ドライメッシュサイズ、500 g</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1401441</td><td>この商品は、水酸化物フォームを直接購入することで交換できます&nbsp;(下記参照参照)が、これはほぼ8倍以上の</td></tr><tr><td>AG 1-X8樹脂、水酸化物形態、100 - 200ドライメッシュサイズ、100グラム</td><td>のバイオラッド</td><td>1432445</td><td>を購入すると、塩化物形態から水酸化物形態への陰イオン交換樹脂の変換をバイパスすることができます(プロトコルのセクション1.2を参照)</td></tr><tr><td>ガラス微量分析真空フィルターホルダー</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>09-753-2</td><td></td></tr>水<tr><td>酸化ナトリウム(NaOH)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S318</td>腐食性<td>。適切な取り扱いと保管については、製品のMSDSを参照してください。</td></tr><tr><td>フリットシリンダー付きガス分散チューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>11-138B</td><td></td></tr><tr><td>プロブミン ウシ 血清アルブミン 脂肪酸フリー、粉末</td><td>EMD ミリポア</td><td>820027</td><td>冷たいエタノール分画などの他の精製プロセスでは、心臓に有毒な残留物が残る可能性があるため、木炭脱脂BSAの使用をお勧めします。</td></tr><tr><td>オレイン酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O7501</td><td></td></tr><tr><td>オレイン酸、[9,10-3H(N)]-</td><td>PerkinElmer</td><td>NET289005MC</td><td>放射性物質。注文と取り扱いについては、所属機関の放射線安全オフィスのガイドラインに従ってください。</td></tr><tr><td>透析膜チューブ、直径29 mm</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>08-667E</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>グルコース、D-[14C(U)]-</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC042B005MC</td><td>放射性物質。注文と取り扱いについては、所属機関の放射線安全オフィスのガイドラインに従ってください。</td></tr><tr><td>Humulin R U-100</td><td>Eli Lilly and Company</td><td>NDC 0002-8215-01 (HI-210)</td><td></td></tr><tr><td>Inactin Hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T133</td><td>USDEA Schedule III</td></tr><tr><td>3-0 Silk Black Braid</td><td>Roboz Surgical</td><td>SUT-15-3</td><td></td></tr><tr><td>10x Hyamine Hydroxide</td><td>PerkinElmer</td><td>6003005</td><td>毒性が高く、重度の火傷を引き起こします。適切な取り扱いと保管については、製品MSDSを参照してください</td></tr><tr><td>20 mlガラスシンチレーションバイアル</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>03-341-25E</td><td>14CO<サブ>2</サブ></td></tr><tr><td>20 mlのHDPEシンチレーションバイアルの</td>定量的回収にガラスバイアルを使用してください <td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>03-337-23B</td><td><sup<>/sup>H2O Redの定量的回収にはHDPEバイアルを使用してください</td></tr><tr><td>ラバースリーブストッパー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-126DD</td><td>フィット 20 mL シンチレーションバイアル;再利用可能な</td></tr><tr><td>BDプレシジョングライドニードル 23G x 40 mm</td><td>BD</td><td>305194</td><td>CO2トラップのゴムスリーブストッパーから過塩素酸を注入するために使用します</td></tr><tr><td>過塩素酸、60%</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A228</td><td>腐食性が高く、酸化剤として作用したり、爆発の危険を引き起こしたりする可能性があります。適切な取り扱いと保管については、製品MSDSを参照してください</td></tr><tr><td>Ultima Gold, Scintillation Cocktail</td><td>PerkinElmer</td><td>6013327</td><td></td></tr><tr><td>Glass Wool</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC38606</td><td></td></tr><tr><td>Decon Dri-Clean 洗剤 パウダー</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355</td><td>ガラス製品、プラスチック部品、チューブの洗浄用</td></tr><tr><td>Alconox Tergazyme Enzyme-Active Powered Detergent</td><td>FisherScientific</td><td>16-000-115</td>脂肪<td>酸-BSA残留物で汚染された「手の届きにくい」表面(チューブ、ガラス器具)の洗浄用</td></tr></tbody></table>

単離されたワーキングラット心臓におけるグルコースおよび脂肪酸酸化の宿泊料金を決意するための方法

Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart

哺乳類の心臓は、ATPの主要な消費者であり、収縮のためのエネルギー基質の一定の供給を必要とします。驚くことではないが、心筋の代謝の変化は、収縮機能障害および心不全の発症に関連しています。したがって、代謝と収縮の間のリンクを解明する疾患状態における心臓の適応や不適応を支配するメカニズムの一部に光を当てる必要があります。単離された作業ラット心臓調製物は、同時に、リアルタイム、心収縮機能および酸化的代謝経路に基質を提供し、エネルギーのフラックスで、追跡するために使用することができます。現在のプロトコルは、グルコースおよび脂肪酸、心臓の基板を提供する主要なエネルギーのための酸化の速度を定量的に測定するための緩衝剤の調製及び利用において使用される方法の詳細な説明を提供することを目的とします。サンプル分析およびデータ解釈のために使用される方法も議論されています。簡単に言えば、この技術は、ex vivoでの14 C-放射性標識グルコースおよび3 H-放射性標識長鎖脂肪酸の供給に基づいて正常体温晶質灌流を介して心臓の鼓動。14 CO 2及び3 H 2 Oの端副産物基板を提供するこれらのエネルギーの利用に関与する酵素反応は、その後、定量的冠動脈流出物から回収されます。使用される放射性標識基質の比活性の知識によれば、個々の酸化経路におけるグルコースおよび脂肪酸のフラックスを定量することが可能です。単離された心臓の収縮機能は、適切な記録装置と並行して決定され、直接代謝フラックス値に相関させることができます。技術は、前および負荷および虚血、薬物またはcircula後の変更などの様々なストレス条件に応答して、代謝/収縮の関係を研究するために極めて有用ですティン因子、または遺伝子産物の発現の変化を以下。

2つの代表的実験は、以下の図に記載されています。どちらの場合も、16週齢の雄性Sprague Dawley系ラットの心臓を単離し、前述のプロトコルに従って調製KH緩衝液を用いて作業モードで灌流。各実験では、心臓は心臓の作業に影響を与えるためにストレス条件に供しました。心臓の収縮機能は、大動脈ラインの圧力変換器の挿入を通って心臓パワーの決意により脈圧を連続的に記録することにより評価しました。基板を提供するエネルギーの利用の各応力状態の影響を同時にグルコースおよびオレイン酸酸化の速度を測定することによって決定しました。 最初の実験では、作業負荷の急激な増加は、40％後負荷を増加させることにより、近生理ワークロードで20分間の灌流後にシミュレートした（手動によって達成大動脈溢流室を上げる）および潅流緩衝液（ 図3A）にエピネフリン（1モル/ L）を添加することによって。脈圧トレースのピーク収縮期血圧値との間の間隔を測定する...

次のプロトコルは、分離された作業ラットの心臓におけるグルコースおよび脂肪酸の酸化速度を定量的に測定するための緩衝液の調製と利用を説明しています。また、サンプル分析とデータ解釈に使用される方法についても説明します。

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of ...

この手順の全体的な目的は、摘出作動ラット心において、心筋のグルコース酸化速度と脂肪酸酸化速度、および心収縮機能を同時にリアルタイムで測定することです。この手法は、心臓がエネルギー需要の急激な変化に代謝的にどのように適応するか、また病理学的条件下でこれらの反応がどのように影響を受けるかなど、心血管分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この手法の最大の利点は、心臓に投与される基質、薬剤、またはホルモンの性質や濃度など、環境変数を研究者が完全に制御できることです。デモンストレーターは、ミシシッピ大学医療センター心血管腎リソースセンターのポストドクトラルフェローであるBhavisha Bakraniaです。まず、ポンプを始動して灌流装置のプライミングを行い、バッファーに酸素を供給します。材料を準備した後、ラットを麻酔し、手術の準備を行います。腹部の除毛を行い、正中切開および外側への切開を行います。胃と腸を脇に寄せ、下大静脈にアクセスし、ヘパリン200 USP unitsを注入します。5〜10秒間待機した後、ハサミを用いて横隔膜と肋骨 thereby 側壁を切断し、胸腔の内容物を露出させます。次に、手で心臓を慎重に掴み、心臓と肺をまとめて摘出します。その際、大動脈弓と上行大動脈を損傷させないよう注意しながら、下行大動脈のレベルで切断してください。心臓と肺を、氷冷したKH緩衝液で満たした解剖皿に直ちに移動させます。心臓の拍動が停止した後、1〜2分以内に再始動させることができるよう、迅速に操作することを習得してください。次に、心臓と肺を氷冷したKH緩衝液を入れた別の新しい皿に浸します。肺組織の大きな断片を速やかに切り取り、その後、大動脈弓の直上の下行大動脈を切断します。以下の手順では、放射性物質の使用に関する必要な予防措置を講じてください。次に、ピンセットを用いて大動脈を慎重に開き、心臓をカニューレ上にスライドさせて載せます。カニューレで大動脈ルートを通り過ぎないよう十分に注意してください。心臓の低灌流や大動脈弁の損傷を引き起こす可能性があります。次に、マイクロクリップで接合部を固定し、心臓のLagendorff灌流を開始します。急がずに、3 0 シルク縫合糸を用いて大動脈を大動脈カニューレに固定し、マイクロクリップを取り除きます。次に肺静脈を確認し、必要に応じて心臓以外の組織を取り除きます。左心房をカニューレに固定するのに十分な組織を残しておいてください。左心房へのカニューレ挿入は、本プロトコルにおいて2番目に重要なステップです。カニューレの挿入不備やリークがある場合、収縮力が弱まり、代謝率の定量化に支障をきたすためです。次に、右カニューレと同様に、左心房ラインカニューレを準備します。その後、ピンセットで肺静脈の開口部を慎重に掴み、心房カニューレに沿って心臓を上にスライドさせます。大動脈を曲げたり、心臓に過度な負担をかけたりしないよう、必要に応じて組織を動かしてください。次に、3 0シルク縫合糸でカニューレを固定します。最後に、大動脈ラインをワーキングモードに切り替えると同時に、心房ラインを開きます。左心房からバッファーが漏れた場合は、心房ラインを閉じ、ラゲンドルフモードに戻してください。その後、さらに縫合糸を用いてカニューレをより確実に固定し、再び作動モードへの切り替えを試みます。実験にカテーテルを用いたLV機能の直接測定が含まれる場合は、まず26ゲージの針を使用してLV心尖部を穿刺し、圧力体積カテーテルを挿入して、シャフトをLV縦軸に合わせます。次に、遠位電極E1を大動脈弁の直下で心内膜境界に隣接するように配置し、近位電極E4を心室壁のすぐ内側に配置します。次に、心臓をウォータージャケット付きチャンバーに封入します。その後、ソフトウェアで機能的パラメータのモニタリングを開始してください。ベースラインパラメータが少なくとも5分間安定したら、データの記録を開始します。冠血流量を測定するために、流出液を20 milliliters回収するのにかかる時間を記録します。次に、3方コックを介して流出液を2 millilitersシリンジに採取し、残りは廃棄します。採取した2 milliliterのサンプルを直ちにマイクロ遠心チューブに移し、グルコース酸化速度を測定するために0.5 milliliterを分注します。残りは氷上で保存します。冠動脈流出液のサンプリングを定期的に継続し、終了直前に、カニューレに接続される直前の心房ラインに10 µLの高張食塩水を注入します。このボーラス投与への反応を用いて平行コンダクタンスを算出し、心臓容積を正確に決定します。次に、心腔の封印を解除し、LV内のカテーテルを取り出します。その後、カニューレから心臓を切り離し、氷冷したKH緩衝液に入れます。速やかに心臓をペーパータオルで拭いて乾燥させ、湿重量を測定します。計量後、必要な組織サンプルを切り出し、残りの組織はドライアイスで冷却したピンセットを用いて凍結させます。準備として、10x hyamine hydroxideを1 mLずつガラス製シンチレーションバイアルに入れます。冠動脈流出サンプルの数だけバイアルを用意し、さらにコントロール用に2本用意してください。サンプルバイアルをロードしたら、すぐにロード済みのシンチレーションバイアルに直接入れます。分析に向けて、バイアルをラバースリーブストッパーで慎重に蓋し、パラフィルムを用いて密封します。次に、長い23ゲージ針を装着した1 mLシリンジを用いて、60%過塩素酸を200 µL、ラバースリーブを通して注入します。すべてのサンプルバイアルを一晩静置します。翌日、ピンセットで各サンプルチューブを慎重に取り出し、ヒアミン水酸化物をすべて回収するため、開口したバイアルに1 mLのシンチレーションカクテルを加えてチューブの底部を洗浄します。その後、各バイアルにさらに9 mLのシンチレーションカクテルを加えます。比活性を求めるため、プロフュージョンバッファーを0.5 milliliters、2本のバイアルに加えます。次に、バイアルを激しく振盪し、測定を行う前に少なくとも6時間静置させます。心筋のオレイン酸酸化速度を決定するには、まずサンプルごとに陰イオン交換樹脂カラムを調製します。3 mLシリンジチューブの先端にグラスウールを詰めます。次に、トランスファーピペットを用いて、各カラムの2 mLの標線まで樹脂水スラリーを加えます。続いて、各カラムに2 mLの超純水を3回通して樹脂を洗浄します。次に、カラムの下にシンチレーションバイアルを配置し、0.5 mLの冠動脈流出液をカラムにロードします。バックグラウンド測定には、代わりに灌流バッファーを使用してください。その後、0.5 mL、1 mL、そして最後に2 mLの超純水を用いて、順次カラムを溶出させます。カラムを廃棄します。次に、バイアルにシンチレーションカクテルを13 milliliters加えます。比活性を測定するため、13 millilitersの液体シンチレーションカクテルを満たした2本のバイアルに、灌流バッファーを0.5 milliliters直接加えます。バイアルを激しく振り、6時間以上静置してから測定を行う。16週齢のラット2匹から心臓を摘出し、異なるストレス条件に供した。一方の心臓では、後負荷を40%増加させ、さらに灌流バッファーにエピネフリンを添加することで、急激な負荷の増大をシミュレートした。ワークジャンプ（負荷急増）の導入により、心拍数は直ちに50%以上増加した。ワークジャンプ時に心出力は40%以上増加し、それに伴いグルコースおよびオレイン酸の両方の酸化速度が上昇した。特にグルコース酸化のベースラインからの相対的な増加は顕著であった。もう一方の心臓には、15分間の全虚血および30分間の再灌流を行いました。これらの実験条件下では、再灌流開始から数分後に、ほぼ正常な脈圧が回復しました。10分以内に心機能（cardiac power）は虚血前の値を上回るまで急速に増加し、その後、ほぼベースラインの値に戻りました。これはオレイン酸酸化の増加によるものでした。一方で、グルコース酸化は虚血前の活性まで速やかに回復しました。習熟すれば、適切に実施することで、心臓の摘出からワーキングモードでの初期再還流までを5分以内に完了させることができます。この手順に続いて、薬剤やストレス条件が分子シグナル伝達経路に及ぼす影響など、さらなる疑問を解決するために、RNAおよびタンパク質発現解析などの他の手法を行うことができます。放射性トレーサーを用いた操作は非常に危険であるため、本手順の実施中は、フルセットの個人用保護具を着用するなど、常に十分な予防措置を講じることを忘れないでください。

methods-for-determination-rates-glucose-fatty-acid-oxidation-isolated

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

目的は、生理的負荷および後負荷圧力のコンテキスト内で孤立した心臓のミトコンドリア酸化還元状態を監視することです。両心室作業ウサギの心臓のモデルが提示されます。...

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学ぶ単離ワーキングラット心臓を用いたグルコース酸化と脂肪酸酸化の同時測定法。リアルタイムで心筋代謝適応と収縮機能を評価し、心血管研究におけるエネルギー需要変化の影響を解明する。

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