単離されたワーキングラット心臓におけるグルコースおよび脂肪酸酸化の宿泊料金を決意するための方法

この手順の全体的な目的は、摘出作動ラット心において、心筋のグルコース酸化速度と脂肪酸酸化速度、および心収縮機能を同時にリアルタイムで測定することです。この手法は、心臓がエネルギー需要の急激な変化に代謝的にどのように適応するか、また病理学的条件下でこれらの反応がどのように影響を受けるかなど、心血管分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。

この手法の最大の利点は、心臓に投与される基質、薬剤、またはホルモンの性質や濃度など、環境変数を研究者が完全に制御できることです。デモンストレーターは、ミシシッピ大学医療センター心血管腎リソースセンターのポストドクトラルフェローであるBhavisha Bakraniaです。まず、ポンプを始動して灌流装置のプライミングを行い、バッファーに酸素を供給します。

材料を準備した後、ラットを麻酔し、手術の準備を行います。腹部の除毛を行い、正中切開および外側への切開を行います。胃と腸を脇に寄せ、下大静脈にアクセスし、ヘパリン200 USP unitsを注入します。

5〜10秒間待機した後、ハサミを用いて横隔膜と肋骨 thereby 側壁を切断し、胸腔の内容物を露出させます。次に、手で心臓を慎重に掴み、心臓と肺をまとめて摘出します。その際、大動脈弓と上行大動脈を損傷させないよう注意しながら、下行大動脈のレベルで切断してください。

心臓と肺を、氷冷したKH緩衝液で満たした解剖皿に直ちに移動させます。心臓の拍動が停止した後、1〜2分以内に再始動させることができるよう、迅速に操作することを習得してください。次に、心臓と肺を氷冷したKH緩衝液を入れた別の新しい皿に浸します。

肺組織の大きな断片を速やかに切り取り、その後、大動脈弓の直上の下行大動脈を切断します。以下の手順では、放射性物質の使用に関する必要な予防措置を講じてください。次に、ピンセットを用いて大動脈を慎重に開き、心臓をカニューレ上にスライドさせて載せます。

カニューレで大動脈ルートを通り過ぎないよう十分に注意してください。心臓の低灌流や大動脈弁の損傷を引き起こす可能性があります。次に、マイクロクリップで接合部を固定し、心臓のLagendorff灌流を開始します。急がずに、3 0 シルク縫合糸を用いて大動脈を大動脈カニューレに固定し、マイクロクリップを取り除きます。

次に肺静脈を確認し、必要に応じて心臓以外の組織を取り除きます。左心房をカニューレに固定するのに十分な組織を残しておいてください。左心房へのカニューレ挿入は、本プロトコルにおいて2番目に重要なステップです。カニューレの挿入不備やリークがある場合、収縮力が弱まり、代謝率の定量化に支障をきたすためです。

次に、右カニューレと同様に、左心房ラインカニューレを準備します。その後、ピンセットで肺静脈の開口部を慎重に掴み、心房カニューレに沿って心臓を上にスライドさせます。大動脈を曲げたり、心臓に過度な負担をかけたりしないよう、必要に応じて組織を動かしてください。

次に、3 0シルク縫合糸でカニューレを固定します。最後に、大動脈ラインをワーキングモードに切り替えると同時に、心房ラインを開きます。左心房からバッファーが漏れた場合は、心房ラインを閉じ、ラゲンドルフモードに戻してください。

その後、さらに縫合糸を用いてカニューレをより確実に固定し、再び作動モードへの切り替えを試みます。実験にカテーテルを用いたLV機能の直接測定が含まれる場合は、まず26ゲージの針を使用してLV心尖部を穿刺し、圧力体積カテーテルを挿入して、シャフトをLV縦軸に合わせます。次に、遠位電極E1を大動脈弁の直下で心内膜境界に隣接するように配置し、近位電極E4を心室壁のすぐ内側に配置します。

次に、心臓をウォータージャケット付きチャンバーに封入します。その後、ソフトウェアで機能的パラメータのモニタリングを開始してください。ベースラインパラメータが少なくとも5分間安定したら、データの記録を開始します。

冠血流量を測定するために、流出液を20 milliliters回収するのにかかる時間を記録します。次に、3方コックを介して流出液を2 millilitersシリンジに採取し、残りは廃棄します。採取した2 milliliterのサンプルを直ちにマイクロ遠心チューブに移し、グルコース酸化速度を測定するために0.5 milliliterを分注します。

残りは氷上で保存します。冠動脈流出液のサンプリングを定期的に継続し、終了直前に、カニューレに接続される直前の心房ラインに10 µLの高張食塩水を注入します。

このボーラス投与への反応を用いて平行コンダクタンスを算出し、心臓容積を正確に決定します。次に、心腔の封印を解除し、LV内のカテーテルを取り出します。その後、カニューレから心臓を切り離し、氷冷したKH緩衝液に入れます。速やかに心臓をペーパータオルで拭いて乾燥させ、湿重量を測定します。

計量後、必要な組織サンプルを切り出し、残りの組織はドライアイスで冷却したピンセットを用いて凍結させます。準備として、10x hyamine hydroxideを1 mLずつガラス製シンチレーションバイアルに入れます。冠動脈流出サンプルの数だけバイアルを用意し、さらにコントロール用に2本用意してください。

サンプルバイアルをロードしたら、すぐにロード済みのシンチレーションバイアルに直接入れます。分析に向けて、バイアルをラバースリーブストッパーで慎重に蓋し、パラフィルムを用いて密封します。次に、長い23ゲージ針を装着した1 mLシリンジを用いて、60%過塩素酸を200 µL、ラバースリーブを通して注入します。

すべてのサンプルバイアルを一晩静置します。翌日、ピンセットで各サンプルチューブを慎重に取り出し、ヒアミン水酸化物をすべて回収するため、開口したバイアルに1 mLのシンチレーションカクテルを加えてチューブの底部を洗浄します。その後、各バイアルにさらに9 mLのシンチレーションカクテルを加えます。

比活性を求めるため、プロフュージョンバッファーを0.5 milliliters、2本のバイアルに加えます。次に、バイアルを激しく振盪し、測定を行う前に少なくとも6時間静置させます。心筋のオレイン酸酸化速度を決定するには、まずサンプルごとに陰イオン交換樹脂カラムを調製します。

3 mLシリンジチューブの先端にグラスウールを詰めます。次に、トランスファーピペットを用いて、各カラムの2 mLの標線まで樹脂水スラリーを加えます。続いて、各カラムに2 mLの超純水を3回通して樹脂を洗浄します。

次に、カラムの下にシンチレーションバイアルを配置し、0.5 mLの冠動脈流出液をカラムにロードします。バックグラウンド測定には、代わりに灌流バッファーを使用してください。その後、0.5 mL、1 mL、そして最後に2 mLの超純水を用いて、順次カラムを溶出させます。

カラムを廃棄します。次に、バイアルにシンチレーションカクテルを13 milliliters加えます。比活性を測定するため、13 millilitersの液体シンチレーションカクテルを満たした2本のバイアルに、灌流バッファーを0.5 milliliters直接加えます。

バイアルを激しく振り、6時間以上静置してから測定を行う。16週齢のラット2匹から心臓を摘出し、異なるストレス条件に供した。一方の心臓では、後負荷を40%増加させ、さらに灌流バッファーにエピネフリンを添加することで、急激な負荷の増大をシミュレートした。

ワークジャンプ（負荷急増）の導入により、心拍数は直ちに50%以上増加した。ワークジャンプ時に心出力は40%以上増加し、それに伴いグルコースおよびオレイン酸の両方の酸化速度が上昇した。特にグルコース酸化のベースラインからの相対的な増加は顕著であった。

もう一方の心臓には、15分間の全虚血および30分間の再灌流を行いました。これらの実験条件下では、再灌流開始から数分後に、ほぼ正常な脈圧が回復しました。10分以内に心機能（cardiac power）は虚血前の値を上回るまで急速に増加し、その後、ほぼベースラインの値に戻りました。

これはオレイン酸酸化の増加によるものでした。一方で、グルコース酸化は虚血前の活性まで速やかに回復しました。習熟すれば、適切に実施することで、心臓の摘出からワーキングモードでの初期再還流までを5分以内に完了させることができます。

この手順に続いて、薬剤やストレス条件が分子シグナル伝達経路に及ぼす影響など、さらなる疑問を解決するために、RNAおよびタンパク質発現解析などの他の手法を行うことができます。放射性トレーサーを用いた操作は非常に危険であるため、本手順の実施中は、フルセットの個人用保護具を着用するなど、常に十分な予防措置を講じることを忘れないでください。