Name: 化学Exchangeプロセスの動力学的パラメーターを取得するために新しいツール：飽和移動差NMR（SSTD NMR）をスピン (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: 学ぶSSTD NMR法による有機・有機金属分子の化学交換動力学パラメーター測定手法。従来法では困難な速度定数と緩和時間の同時取得が可能で、分子動態の理解に貢献します。

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>jove_content<イーストアングリア大学、EPSRC(EP/L012855/1)、EU(H2020-MSCA-IF-2014-EF-ST-658172)からの資金提供に感謝の意を表します（MTQ）。

注意：使用する前に、関連するすべての物質安全データシート（MSDS）を参照してください。 1. NMR試料の調製<ol><li> N、N-ジメチルアセトアミド5mgを秤量し、低温のための適切なNMRチューブに追加し、トルエンさd 8の0.6ミリリットルに溶解します。 </li></ol> 2. NMR実験のセットアップ25 <ol><li> NOEスペクトルの取得<ol><li> 1次元NOE（核オーバーハウザー効果）実験を実行します。26 注：NOE効果は任意の温度で起こることができます。 SSTD NMR実験で照射される信号を照射する1次元NOEスペクトルは、ここで使用したサンプル中の回転と磁化移動が最小化されたことを確認するために、-40℃で記録したところ、したがってNOE、存在しない場合、優勢になると、この実験で測定すること。理想的には、2つの間のNOE効果は核shoulを交換しますSSTD法との干渉を避けるために存在していないdは。 </li></ol></li><li> SSTD NMR実験のセットアップ<ol><li>空気の流れをオンにするソフトウェアのコマンドラインの最初のタイピングEJによって磁石のサンプルを挿入します。そして、磁石の上にサンプルを入れ、ijを入力します。サンプルは、磁石の内側にあるまで待ちます。 </li><li>サンプルたら、磁石にコマンドラインで型EDTEです。実験（この場合は295.5 K）を実行するために最初に選択された温度まで温度を変更します。サンプルを少なくとも20分間、選択された温度で安定してみましょう。 </li><li>サンプル上の1D 1 H-NMR実験を実行します。 <ol><li> 1 H-NMR実験の新しいデータセットを作成します。このためにFILE / NEWをクリックして新規の実験に名前を付けます。 </li><li>順次入力し、仕上げに前のコマンドを待っている： ロック 、 アートマ 、topshim、getprosolとRGA。 </li><li>タイプ&lt;em&gt;のプロトン実験を取得するZG。それはフーリエ変換型EFPとAPKを終了したら、それを変換し、位相を調整。 </li></ol></li><li> 1 H NMR実験、例えば、新しいデータセットを作成します。このためにFILE / NEWをクリックして新規の実験に名前を付けます。 </li><li>この新しいデータセットでは、コマンドラインでRPARと入力します。例えばSTDDIFFESGPのために、リストから「STDDIFF」パラメータセットのいずれかを選択し、「読み」、次に（ 図1）「すべてを読み込む」をクリックします。また、 すべてのRPAR STDDIFFESGPを入力してこれを行います。 注記：この実験は、このパルスシーケンスを用いて行うことができます。しかし、我々の実験で使用されるパルスプログラムがSTDDIFFました。 </li><li> STDDIFFパルスシーケンスを選択するには、PULPROGラインの3つのドット（ 図2、図 3）でボタンをクリックします。 </li><li> SSTD NMR実験を行う前に、1 H 90°ハードPULSをキャリブレーションE（P1）。この目的のために、サンプルを所望の温度（ステップ2.2.2）で、磁石であることを確認してください。コマンドラインで入力しpulsecalと高い電力（PL1 = -1デシベルこの場合）、 すなわち、最短パルス（ 図4）を与える1で90°パルスの値をコピーします。 </li><li>実験で校正ハードパルスの値を導入します。タイプgetprosol 1H（ステップ2.2.7で得られたP1の値）（PL1の値）（ 図5）。 </li><li>整形されたパルスの長さを設定します。タイプP13と50,000マイクロ秒（ 図6）の値を紹介します。 </li><li>選択パルス形状を設定します。これを行うには、電源に移動して（ 図7）を成形するために、次の「編集...」ボタンをクリックします。整形パルス13に移動し、選択します。GAUS 1.1000（ 図8）。 </li><li>選択パルス電力（SP13）を設定します。適切な何かにそれを設定し、 すなわち </em&gt; 40〜60 dBのこのシステム上で（ 図8）（約120ヘルツの電界強度に対応します）。過度の電界強度が許容できない飽和効果につながることができます。27-29 注：50デシベルは、我々の場合には最適でした。これは減衰スケールなので、小さい方の値が高い高周波のパワーであることを考慮してください。それは長い時間（数秒）に適用される飽和ガウスカスケードに対応するように、SP13は、（必要であれば、のような高電力で長パルスがプローブヘッドを損傷する恐れがあり、機器の仕様を参照してください）40デシベル以下に行くべきではありません。私たちの経験41から61で（この作業で-1デシベル）ハード1 H 90°パルスの減衰上記デシベルが正常に動作します。常に同様の飽和レベルにつながる可能な限り最高の減衰を選択してみてください。 </li><li> ナノ秒を入力し、8に設定し、DSを入力し、4に設定します。 </li></ol></li></ol> 3. NMRデータ集録ANd処理25 <ol><li> SSTD NMR実験獲得<ol><li>照射される信号がどこにあるか確認するために、ステップ2.2.3で行わ1 H NMR実験を開きます。このため、ソフトウェアのブラウザで実験を検索し、右データセット内をクリックし、「新しいウィンドウで表示」をクリックします。 </li><li> ppmでの化学シフトを照射し、書き留めて信号の中心にカーソル線を移動します。実験に使用されるスペクトル幅を選択します。 注：この場合、照射された信号は2.17 ppmになり、使用するスペクトル幅は1.46 ppmでした。何の化学シフト補正が使用されていないか、照射回数が誤って設定することができることを確認してください。 </li><li> 2.2節で述べたセットアップを使用して、以前に作成したSSTD NMR実験に移動します。 </li><li>照射の周波数のリストを作成します。このため、コマンドラインでfq2list入力し、既存のリストを選択します。 </li><li>リストを編集3最初の行（ 図9）で、次のデータを含む照射周波数の： 行1、Pは、（以下のデータはppmであることを示す）; 行2 3.1で測定して、ppmで照射される信号の周波数を。 1;行3.40 ppmの （遠いその周波数での照射がスペクトルに影響を与えないように、化合物の1 H信号からある周波数）。 </li><li>新しい名前でリストを保存し、コマンドラインでfq2list入力し、先ほど作成したリストを選択します。 </li><li> 、検討中の信号について実験を中心型o1pと実験の中心として照射される信号の化学シフトを選択します。 </li><li>スペクトル幅を選択するタイプのSW（この場合は1.46 ppmのが、他のスペクトル幅を選択することができます）。 注：スペクトル幅を変更した後に得られた収集時間が長すぎる場合（スペクトルにおけるより多くのノイズを導入します）それは、CAnは希望する自由誘導減衰（FID）解像度（FIDRES、この場合は0.25 Hz）を提供するために、AQを入力して調整すること。 </li><li>インタースキャン緩和遅延D1の値を選択してください。それはT最も遅いリラックスの1の少なくとも1から5倍の値であることを確認してください プロトン。 注：我々は、実験の中で最も長い飽和時間（D20）で40秒、それを設定します。このように、すべての実験は、「スキャンごとに &quot;同じ合計時間（遅延+飽和時間+パルス+取得時間）を維持します。 </li><li> D1を入力し、40秒に設定します。 </li><li> D20を入力し、40秒に設定することで飽和時間の最初の値を設定します。 RGAを入力して、自動的に受信機の利得（RG）を決定します 。 </li><li> iexpno入力して、次の実験を作成します。 D20を入力し、この実験では20秒の飽和時間を選択します。自動的にRGを決定するためにRGAを入力します。 </li> &lt;李は&gt; D20 = 10、5、2.5、1.25、0.625、0.3秒のための最後のステップを繰り返します。 </li><li>すべての実験が作成されると、最初の1を開き、コマンドライン型multizgで（ すなわち 、multizg 8）この場合の実験の数、8を指定します。 </li></ol></li><li> SSTD NMR実験処理<ol><li>セットのEXPNO 1からPROCNO 1（プロセス番号）（実験番号）（高い飽和時間との1）を開きます。 </li><li>コマンドライン型ポンドで1.5に値を設定します。 注意：非常に高い信号対雑音比を有するスペクトルの場合、この値を小さくすることができます。スペクトル分解能は厳しく影響されない場合逆に、それは、ノイズの多い実験のために増加させることができました。 </li><li> PROCNO = 2（ 図10）で、コマンドライン型EFPとプロセスFID番号= 1（「オンレゾナンス」スペクトル）で。 </li><li> インタラクティブ位相補正bをクリックすることで、実験の位相を修正uttonは、2D実験として保存します。保存して終了（ 図11）。 </li><li> PROCNO 1に移動するためのコマンドラインを入力担当者1。 </li><li> PROCNO = 3（ 図12）で、コマンドライン型EFPとプロセスFID番号= 2（「オフレゾナンス」スペクトル）で。 </li><li>コマンドライン型.mdで、その後の両方に処理スペクトルを有する複数の表示ウィンドウを表示する担当者2：2（中央飽和の信号と1）と3（飽和パルス列が40 ppmに適用した1 ）（ 図13）。 </li><li>差スペクトルを計算し、PROCNO 4.終了し、複数の表示窓にそれを保存するために、デルタ記号（ 図13）でボタンをクリックします。 </li><li>左（による化学交換プロセスに彩度の移動が観察された信号）の信号の積分範囲を選択します。常にPROCNO 3とPROCNO 4に同じ領域を統合します。 <br/&gt;注： - 2.67 ppmで、この実験で用いた積分範囲は2.55でした。 </li><li>統合後は、実験のそれぞれに「積分」タブに移動し、「インテグラ[ABS]」（ 図14）の値をコピーします。 </li><li> 40秒（ηSSTD =スピン飽和移動差パラメータ）の飽和時間のためのηSSTDの値であることPROCNO 3の積分でPROCNO 4で積分を分割します。21 </li><li>異なる飽和時間と実験の残りの手順を繰り返します。 </li></ol></li></ol> 4.データ解析30 <ol><li>データの分析は、動態パラメータを取得します<ol><li>飽和時間対得ηSSTD値をプロットします。21 </li><li>式に得られた曲線を調整するために、指数フィットを実行 <img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/54499/54499eq1.jpg" /> <img aLT = &quot;数2&quot; SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 54499 / 54499eq2.jpg&quot; /&gt; <img alt="式3" src="/files/ftp_upload/54499/54499eq3.jpg" /> = <img alt="式4" src="/files/ftp_upload/54499/54499eq4.jpg" />非常に長い飽和時 トン=時間</li><li> ηSSTD MAXの値を計算し、δと以下の式に従って速度定数（k）と緩和時間（Tの1A）の値を計算するためにそれらを使用します： <img alt="式（5）" src="/files/ftp_upload/54499/54499eq5.jpg" /> スピンAのT 1A =縦緩和時間定数 K =相互サイト為替反応速度定数<ol><li>により一定の運動速度を取得します。 <img alt="式6" src="/files/ftp_upload/54499/54499eq6.jpg" /></li></ol></li></ol></li><li>熱力学パラメータを取得するためにアイリングプロット<ol><li>プロットLN 1 / T対（K / T）（T =絶対温度）、雌牛の値を用い<html>異なる温度でチック率。 </li><li>アイリング式に得られたデータを調整するための線形フィットを実行します。 <img alt="式（7）" src="/files/ftp_upload/54499/54499eq7.jpg" /> <img alt="式8" src="/files/ftp_upload/54499/54499eq8.jpg" /> <img alt="式9" src="/files/ftp_upload/54499/54499eq9.jpg" /> <img alt="式10" src="/files/ftp_upload/54499/54499eq10.jpg" /> R =気体定数 k個のB =ボルツマン定数 T =絶対温度</li><li> ≠ΔH熱力学的パラメータを計算≠とΔS。 </li><li>以下の式を用いて、E A（298）とΔG≠（298）の値を計算します。 <img alt="式11" src="/files/ftp_upload/54499/54499eq11.jpg" /> <img alt="式12" src="/files/ftp_upload/54499/54499eq12.jpg" /> S / ftp_upload / 54499 / 54499eq13.jpg &quot;/&gt; <img alt="式14" src="/files/ftp_upload/54499/54499eq14.jpg" /> </li></ol></li></ol>

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<li>Forsen, S., Hoffman, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exchange+Rates+by+Nuclear+Magnetic+Multiple+Resonance.+III.+Exchange+Reactions+in+Systems+with+Several+Nonequivalent+Sites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Exchange Rates by Nuclear Magnetic Multiple Resonance. III. Exchange Reactions in Systems with Several Nonequivalent Sites.</a> J. Chem. Phys. 40, 1189-1196 (1964).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

この方法論のより明白な利点の1つは、特定の温度の速度定数と緩和時間を、ロバストパルスシーケンス(タンパク質とリガンドの相互作用を研究するためのSTD実験に使用されるものと同じもので、通常、分光計メーカーから入手可能な実験セット内で見られます)を使用して、単一の実験セットで取得できることです。これにより、T1 を測定したり、定常状態の飽和に達したりする必要がないため、実験セットアップが簡素化されます。また、この方法は合体法として磁石の強度に依存しないことも注目に値します。一方、主な制限は、この技術が NMR 装置の温度範囲または使用する溶媒によって異なる、速すぎたり遅すぎたりする化学交換プロセスに適用できないことです。
速度論的パラメータを計算するためのこの新しい技術は、多種多様な基質に適用でき、その適用性はすでにいくつかの興味深い分子で実証されています。21 目的のメチル基の1つのシグナルが分子からの他のシグナルと重なる困難な基質である4-N,N-ジメチルアミド[2.2]パラシクロファンの速度論的パラメータは、SSTD NMRを使用して正常に計算されました。興味深いことに、この方法論は、研究のシグナルの1つが分離されている限り適用できます。SSTD NMRは、合体温度が非常に高く、分子が到達する前に分解する分子の速度論的パラメータを計算するための有用なプロトコルでもあります。これはPtCl2(ジメチルアレン)(ピリジン)の場合であり、合体に達することなく方法論がうまく適用されました。溶媒と温度の選択は、これらのパラメータによって化学交換率が大きく変化する可能性があるため、良好な結果を得るために重要です。さらに、通常のNMR実験の基準に加えて、SSTD NMR実験の重要なステップは、照射の選択性と温度制御です。実験の成功を保証するには、両方の要素が正確でなければなりません。
ここで紹介する代表的な結果は、分子内化学交換の速度論に関するものですが、この手法は、遷移金属錯体の動的挙動における一般的なプロセスである分子間化学交換および配位子交換の速度論の研究にも適用できます。 
最後に、方程式の適切な修正が行われれば、32 この方法は、以前の二重共鳴実験で行われてきたように、マルチサイト交換と不等な集団に対処するために拡張される可能性があり、8-9 困難な化合物の化学交換プロセスの研究におけるこの手法の有用性を高めます。

化学交換は、一般的に、核がNMRパラメータ（化学シフト、スカラーカップリング、双極子カップリング、緩和速度）が異なっている別の環境から移動する任意の分子間または分子内のプロセスを指します。多数の有機および有機金属分子で化学交換の例（ビアリールで例えば、回転障壁、リングの障壁と立体配座平衡をひっくり返す、窒素反転、リガンド結合、縮退した配位子交換及び互変異性）があります。1-3化学交換レートが関連するに交換プロセスの障壁の熱力学ため、その研究は、これらの系の分子動力学を理解するために決定的に重要です。 NMRでの動的交換の古典的な兆候は、温度変化などのNMR信号のライン形状の劇的な変化です。低い温度では、プロセスは遅く、二つの異なる化学シフトobserありますVED。高い温度では、2つの信号は、「合体」として知られている一つの信号、合流します。中間温度では、信号が非常に広いとなります。化学交換にNMRスペクトルのこの感度は、NMR溶液中の分子のダイナミクスを研究するための非常に強力な方法になります。二つの方法は、主に、溶液中の動的プロセスの研究に用いられてきた：4-7、ライン状の分析をし、スピン飽和移動実験8-9のほかに、それはまた、反転転送方法10とのためのCIFITプログラム11を言及する価値があります単純なシステムでの交換測定のための比較的効率的なアプローチである速度定数の直接抽出。これらの方法は、ほとんどの場合、非常に良好な結果を与えるが、それらは、しかしながら、多くの欠点を有しています。線状分析の主な欠点は、いくつかのサンプルで合体に到達するのに必要な高温である。12 CA考慮すべき主な問題アウトrryingスピン飽和移動実験は、次のとおり交換部位の間の定常状態の飽和移動に到達するために必要な非常に長い飽和時間、困難であることができる一定の縦緩和時間T 1を決定する必要性が、異なるの重なりがある場合に研究の領域における信号。13 有機金属機構における我々の調査の一環として、14-16私たちのグループは、溶液中の白金-アレン錯体の流動挙動を検討しています。これは、少なくとも3つの異なるプロセス、アレン軸の1の周りに金属のπ-顔交換又は回転され、それらのいずれかを含む複雑な作業です。私たちは、の合一温度を作った私たちの白金-アレン錯体中の非常に遅い回転に起因し、17-19は、私たちの研究に適していなかった、通常のVT実験と同様のシステムで以前に使用されてきたライン状の解析技術ことを検出しましたSIG錯体の分解温度よりも高い興味のあるのNAL。 この制限を克服するために、我々が開発し、最近相互サイトの化学交換の過程を研究するための新しいNMRプロトコル（SSTD NMR）を報告した。20名がこの方法を用いて、小分子のために使用されるスピン飽和移動方法を組み合わせ通り飽和移動差NMR法は、化学交換を受けている小分子で飽和時間（ビルドアップ曲線）を増加させるに沿って過渡スピン飽和移動を測定することによって、タンパク質-リガンド相互作用の研究、21-24のために使用します。 この新しい方法（SSTD NMR）で私たちは、伝統的なアプローチを超えるいくつかの追加の利点を持つ小さな有機および有機金属分子における分子内化学交換の動力学的パラメーターを得ることができることを示している：信号の合体が必要とされていないので、より柔軟な温度範囲をに使える研究では、交換共振の少なくとも一つは分離する必要がありますが、信号のオーバーラップは、干渉しません。 T 1を測定したり、定常状態の飽和に到達する必要はありません。速度定数の値は、直接測定され、T 1の値は、実験の唯一のセットを使用して、同じ実験で得られます。 SSTD NMR方法の別の顕著な利点は、分析を線形とは対照的に、動力学的速度定数の決意を高磁場に関連付けられた凝集温度の上昇によって制限されない、ということです。したがって、私たちの方法論は、その後、非常によく、低および高磁場の両方のために充当されます。この記事は、新しいユーザーが化学交換を受けて自分のシステムにこの新しい方法を適用して、試料調製、実験のセットアップ、データ収集、および単純な有機分子におけるデータ処理および分析の例を説明するためのものです。

<table><tbody><tr><td>N,N-ジメチルアセトアミド</td><td>アルドリッチ</td><td>38840</td><td>急性毒性</td></tr><tr><td>トルエン-d<サブ>8</サブ></td>フル<td>オロケム</td><td>D-005</td><td>可燃性で毒性</td></tr>のある <tr><td>500 MHz 7インチ セレクトシリーズ NMR チューブ</td><td>GPE LTD</td><td>S-5-500-7</td><td></td></tr><tr><td>TopSpin 2.1</td><td>TopSpin program, Bruker Corp.,http://www.bruker.com/products/mr/nmr/nmr-software/software/topspin/(2015)。</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Origin 6.0</td><td>Origin 6.0ソフトウェア、OriginLab Corp.、http://originlab.com.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bruker Avance III 500 MHz、5 mm広帯域観測BBFOplus Z-gradient SmartProbeTMプローブを装備</td><td>&nbsp;Bruker Corp.、http://www.bruker.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bruker Avance I 500 MHz Inverse Triple Resonance NMR Spectrometer with a 5 mm TXI Z-gradient probe</td><td>&nbsp;Bruker Corp.、http://www.bruker.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>セラミックスピナー標準ボアシムシステムズ(5 mm)</td><td>&nbsp;ブルカーコーポレーション、http://www.bruker.com</td><td>H00804</td><td></td></tr></tbody></table>

化学exchangeプロセスの動力学的パラメーターを取得するために新しいツール：飽和移動差nmr（sstd nmr）をスピン

Spin Saturation Transfer Difference NMR (SSTD NMR): A New Tool to Obtain Kinetic Parameters of Chemical Exchange Processes

この詳細なプロトコールは、最近、従来の方法によって分析することが困難な相互サイトの化学交換の過程を研究するために、当社グループで開発された新しいスピン飽和移動差核磁気共鳴プロトコル（SSTD NMR）を、説明します。名前が示すように、この方法では、ビルド（飽和時間を増加さに沿って過渡スピン飽和移動を測定することにより、飽和移動差タンパク質 - リガンド相互作用の研究のために用いられる（STD）NMR法を用いて、小分子のために使用されるスピン飽和移動方法を組み合わせ化学交換を受けて、小さな有機および有機金属分子で-up曲線）。 既存のものの上に、この方法の利点は次のとおりです。交換信号の合体に到達する必要はありません。この方法であれば交換部位の一方の信号が分離されているように適用することができます。 T 1を測定したり、定常状態の飽和に到達する必要はありません。速度定数v梅毒は、直接測定され、T 1の値は、実験の唯一のセットを使用して、同じ実験で得られます。 メソッドをテストするために、我々は多くのデータを比較するために提供されているN、N個の -dimethylamidesの束縛回転のダイナミクスを研究しています。 SSTDを用いて得られた熱力学的パラメーターは、報告されたもの（スピン飽和移動技術及び線状分析）と非常に類似しています。この方法は、従来の方法によって研究することができない多くの困難な基材に適用することができます。 私たちは、簡単な実験を設定することを想定し、基板の多種多様にする方法の広い適用は、このNMRにおける豊富な専門知識のない有機および有機金属化学者の間で一般的な技術になります。

SSTD NMR技術は、N、N-ジメチルアセトアミドのアミド結合の回転における動態パラメータの計算のために適用した。21これは比較のために大規模なデータが文献に見出すことができるための単純な例である。31 アミド結合の周りの束縛回転、共振による形の部分の二重結合文字に、1 H-NMRスペクトル（2.61と22.5℃で2.17 ppm以下）で2つの信号に両方のメチル基を区別します。 2.17 ppmの（ME B）におけるメチル基のシグナルのスピン飽和は、1 H NMRでのシグナルの消失をもたらします。ミーB、他のメチル基（ME A）の飽和移動の飽和時に、内部回転処理に2.61 ppmのシグナルの1 Hの強度の減少によって観察することができます。 magnituデこの減少は、飽和時間に依存する。 図15は、Nの1 H NMRスペクトルは、22.5℃でのNジメチルアセトアミドを示し、拡張（a）はせずメチルの（b）は、飽和でスペクトルを示します2.17 ppmの基、ならびにηのSSTDの値を計算するために使用される差スペクトル（C）。 ηのSSTD係数は（A）は、のように、プロトコルで説明したスペクトルで私Aの積分値によってSSTD NMRスペクトル（C）の私の積分値を除算計算されます。異なる温度でそれぞれ飽和時間のためのηSSTDの得られた値を表1にまとめられている。飽和時間対ηSSTDの得られた値のプロットは、高原が高い飽和時間で到達した指数関数曲線を与えました。一定の温度については、曲線の指数関数的な適合は、速度の計算を可能に定数（k）と測定された信号（T 1A）（ 図16）の1 Hの緩和時間。フィットで得られたkおよびT 1A値とともに図17に示す全ての得られた曲線を図 。 最後に、1 / Tに対するlnのプロット（K / T）及びアイリングの方程式に当てはめた （ 図18）は、活性化のエンタルピーおよびエントロピーを計算するために使用しました。決定起動パラメータが一緒に異なる方法を使用して計算し、以前に報告されたパラメータを用いて、 表2に示します。 表2に見られるように、活性化パラメータの値は、スピン飽和移動差法（SSTD NMR）を用いて得られたデータとよく一致している、以前にそのようなSST NMR又は他の技術を使用して報告線形状解析。 ΔS‡のために報告された値の広い範囲が原因でNMR技術を使用してこのパラメータの測定の難しさにある。活性化パラメータの残りの部分については31、私たちの方法で得られた値だけではなく、既に報告されたものには本当に似ていますしかし、より正確な、私たちの誤差（SD）は、すべての場合に小さいからです。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54499/54499fig1.jpg" /> 図 1：RPARを 入力した後、実験のリスト 。図は、STDDIFFESGPが選択されるべきであるその中の異なるパラメータセットを示している。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54499/54499fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54499/54499fig2.jpg" /><br/&gt; 図2：取得パラメータボタンが赤い四角異なるパルスプログラムのリストにつながるで強調表示。。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54499/54499fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54499/54499fig3.jpg" /> 図3： パルスプログラムの一覧図は実験（STDDIFF）で選択されたパルスプログラムを示し<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54499/54499fig3large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54499/54499fig4.jpg" /> 図4：ポップアップウィンドウが90°パルスのキャリブレーション後に出現した図は、較正された90の値を示しています。<html> ＃176;異なる電力レベルでのパルス。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54499/54499fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54499/54499fig5.jpg" /> 図5： コマンドラインのスクリーンショットの図は、較正されたハードパルスの値を導入する方法を示しています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54499/54499fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/54499/54499fig6.jpg" /> 図6：。 整形されたパルスの長さの値は、図は、整形パルスの長さの値を導入する方法を示しています。<html> g6large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/54499/54499fig7.jpg" /> 図7： 取得パラメータの図は、電力パラメータを示している。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54499/54499fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/54499/54499fig8.jpg" /> 図8：パルス状のパラメータ整形パルスの値がライン13に導入される<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54499/54499fig8large.jpg" target="_blank">。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <html> PLOAD / 54499 / 54499fig9.jpg &quot;/&gt; 図9：照射周波数の一覧図は、最初の3行で、以下のデータが含まれています。 行1. Pは、（以下のデータはppmであることを示す）; ppmで照射される信号の ロウ2 周波数、測定されます 。 3.1.1で、行3.40 ppmで （その周波数での照射がスペクトルに影響を与えないように遠く化合物の1 H信号からある周波数）。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54499/54499fig9large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図10" src="/files/ftp_upload/54499/54499fig10.jpg" /> 図10： 最初のFIDの処理図は、EFPを入力した後に表示されるポップアップウィンドウを示しています。<html> NK &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図11" src="/files/ftp_upload/54499/54499fig11.jpg" /> 図11： 位相補正スクリーンショットマニュアル位相補正用のウィンドウを示す<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54499/54499fig11large.jpg" target="_blank">。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図12" src="/files/ftp_upload/54499/54499fig12.jpg" /> 図12： 第FIDの処理は、図は、EFPを入力した後に表示されるポップアップウィンドウを示している。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54499/54499fig12large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 図13「SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 54499 / 54499fig13.jpg&quot; /&gt; 図13：赤い四角で強調表示されたスペクトル2と3ボタンの複数の表示は、差スペクトルを計算するためのものである。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54499/54499fig13large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図14" src="/files/ftp_upload/54499/54499fig14.jpg" /> 図14：積分]タブの図は、絶対的および相対積分の値を示している。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54499/54499fig14large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図15" src="/files/ftp_upload/54499/54499fig15.jpg" /> 図15： 構造と 1 </stron<html>グラム&gt; N のH NMRスペクトル 、 トルエン-D 8で22.5℃、Nジメチルアセトアミド （a）は、照射前2.13 2.66 ppmでの地域の1 H NMR展開。 （b）は 2.17 ppmのメチル基の照射後の同じ領域の拡大を。 （c）の差スペクトル[（A） - （B）]。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54499/54499fig15large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図16" src="/files/ftp_upload/54499/54499fig16.jpg" /> 図16：ηSSTD と化学の王立協会から許可を得て、参照21の支持情報から278 K.再現で、その指数関数フィット のプロットの例 。http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54499/54499fig16large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図17" src="/files/ftp_upload/54499/54499fig17.jpg" /> 図 17：ηSSTD 対 のプロット 異なる温度での飽和時間が。図は、N、N-ジメチルアセトアミド、得られた速度定数と緩和時間を持つテーブルのプロットを示している。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54499/54499fig17large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図18" src="/files/ftp_upload/54499/54499fig18.jpg" /> 図18： アイリングプロット図は、N、N-ジメチルアセトアミドのためのプロットを示しています。。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54499/54499fig18large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> 座っトン（秒） </td><td> SSTDη </td><td> SSTDη </td><td> SSTDη </td><td> SSTDη </td><td> SSTDη </td><td> SSTDη </td><td> SSTDη </td></tr><tr><td> （T = 278 K） </td><td> （T = 283 K） </td><td> （T = 285.5 K） </td><td> （T = 288 K） </td><td> （T = 290.5 K） </td><td> （T = 293 K） </td><td> （T = 295.5 K） </td></tr><tr><td> 40 </td><td> 0.2526 </td><td> 0.3957 </td><td> 0.4671 </td><td> 0.5461 </td><td> 0.626 </td><td> 0.6969 </td><td> 0.7535 </td></tr><tr><td> 20 </td><td> 0.2526 </td><td> 0.3957 </td><td> 0.4671 </td><td> 0.5461 </td><td> 0.626 </td><td> 0.6969 </td><td> 0.7535 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 0.2383 </td><td> 0.3806 </td><td> 0.4537 </td><td> 0.5355 </td><td> 0.6199 </td><td> 0.6969 </td><td> 0.7535 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 0.1904 </td><td> 0.3193 </td><td> 0.3919 </td><td> 0.481 </td><td> 0.5734 </td><td> 0.6638 </td><td> 0.7318 </td></tr><tr><td> 2.5 </td><td> 0.1263 </td><td> 0.2204 </td><td> 0.2812 </td><td> 0.3589 </td><td> 0.4449 </td><td> 0.5461 </td><td> 0.626 </td></tr><tr><td> 1.25 </td><td> 0.0761 </td><td> 0.1353 </td><td> 0.171 </td><td> 0.2247 </td><td> 0.2868 </td><td> 0.3732 </td> &lt;TD&gt; 0.4449 </td></tr><tr><td> 0.625 </td><td> 0.0467 </td><td> 0.0739 </td><td> 0.099 </td><td> 0.1327 </td><td> 0.171 </td><td> 0.2291 </td><td> 0.2758 </td></tr><tr><td> 0.3 </td><td> 0.0238 </td><td> 0.044 </td><td> 0.0472 </td><td> 0.0644 </td><td> 0.0847 </td><td> 0.1169 </td><td> 0.1463 </td></tr></tbody></table> 表1：ηSSTDの値の表では、N、温度278から295.5 Kの範囲内のN個のジメチルアセトアミドに異なる飽和時間で得られた値を示しています。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="585"><colgroup><col /><col span="5" /></colgroup><tbody><tr height="34"><td height="34" style="height:34px;width:145px;"> 方法 </td><td style="width:88px;"> SSTD NMR </td><td rowspan="2" style="width:88px;"> SST NMR 31 </<html> TD&gt; <td style="width:88px;"> 線状分析 </td><td style="width:88px;"> 線状分析 </td><td style="width:88px;"> 線状分析 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:145px;"> パラメーター </td><td style="width:88px;"> （この作品） </td><td style="width:88px;"> （1 H NMR）4 </td><td style="width:88px;"> （1 H NMR）5 </td><td style="width:88px;"> （13 C NMR）6 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:145px;"> E 298（KJのモル-1） </td><td style="width:88px;"> 79.7±0.1 </td><td style="width:88px;"> 73.1±1.4 </td><td style="width:88px;"> 70.5±1.7 </td><td style="width:88px;"> 82.0±1.3 </td><td style="width:88px;"> 79.5±0.4 </td></tr><tr height="21">21px;幅：145px; &quot;&gt;ΔH‡（KJモル-1） </td><td style="width:88px;"> 77.2±0.1 </td><td style="width:88px;"> 70.6±1.4 </td><td style="width:88px;"> 68 </td><td style="width:88px;"> 79.5±0.4 </td><td style="width:88px;"> 76.6±0.4 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:145px;"> ΔS‡（Jモル-1 K -1） </td><td style="width:88px;"> 11.5±0.4 </td><td style="width:88px;"> -10.5±5.0 </td><td style="width:88px;"> -15.0±5.1 </td><td style="width:88px;"> 13±8 </td><td style="width:88px;"> 3±4 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:145px;"> ΔG‡298（KJのモル-1） </td><td style="width:88px;"> 73.8±0.1 </td><td style="width:88px;"> 73.7±2.0 </td><td style="width:88px;"> 720.5 </td><td style="width:88px;"> 75.3±0.4 </td><td style="width:88px;"> 75.7±0.4 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:145px;"> 溶媒 </td><td style="width:88px;"> D 8 Tol- </td><td style="width:88px;"> D 8 Tol- </td><td style="width:88px;"> 四塩化炭素</td><td style="width:88px;">アセトン-d 6 </td><td style="width:88px;">ニート</td></tr></tbody></table> 表2： 活性化パラメータは、テーブルは、Nの内部回転の起動パラメータは、Nは、分析のための別のNMR法を用いて得られた同じパラメータと比較SSTD NMR法によって得られたジメチルアセトアミドを示し、この表の4,5,6エラー。標準偏差誤差（SD）を参照してください。 （ロイヤルのSocからの許可を得て、基準21から再生化学のiety）。

ここには、新しいユーザーがこの新しい方法を適用して、化学交換を受けている自身のシステムの速度論的パラメータを取得するのを助けるために、SSTD NMR法を説明する詳細なプロトコルが提示されています。

化学Exchangeプロセスの動力学的パラメーターを取得するために新しいツール：飽和移動差NMR（SSTD NMR）をスピン

This detailed protocol describes the new Spin Saturation Transfer Difference Nuclear Magnetic Resonance protocol (SSTD NMR), recently developed in our ...

本実験の全体的な目的は、従来の方法では測定が困難な、低分子有機化合物および有機金属化合物における相互化学交換の速度論的パラメータとプロセスを明らかにすることです。本手法は、化学交換を起こしている有機分子および有機金属分子の分子ダイナミクスの理解に寄与します。具体例としては、回転障壁、配座平衡、窒素反転、配位子交換、およびタウトメリズムなどが挙げられます。この手法の主な利点は、交換信号の合一（coalescence）を必要とせず、速度定数と緩和時間を同一の実験で得られることです。私たちは最初、溶液中における白金イオン錯体の機能的挙動を調べていた際にこの手法を考案しましたが、その際、可変温度線幅解析法は適していないことに気付きました。タンパク質とリグニンの相互作用をNMRで解析した経験から、同様のNMRアプローチを有機分子の交換プロセスの研究に適用できると考えましたが、それは正解でした。5 mgのnn dimethyacidamideを低温用NMRチューブに加え、0.6 mLの重水素化トルエンに溶解させます。SSTD NMR実験のセットアップとして、まずサンプルをマグネット内に挿入します。NMR実験において重要なステップの一つが温度制御であるため、サンプルを選択した温度で少なくとも20分間安定させてください。サンプルを磁石にセットしたら、コマンドラインにEDTEと入力します。実験を行うための、最初に設定した温度に変更してください。選択した温度で、サンプルを少なくとも20分間安定させます。テキストのプロトコルに従って、サンプルに対して1次元プロトンNMR実験を行い、[File]、[new]をクリックしてプロトンNMR実験の新しいデータセットを作成し、新しい実験に名前を付けます。新しいデータセットのコマンドラインにRPARと入力します。リストからSTDDIFFパラメータセットのいずれかを選択してください。STDDIFFパルスシーケンスを選択するには、パルスプログラム行にある3つの点のボタンをクリックします。SSTD NMR実験を行う前に、プロトン90度ハードパルスP1を校正してください。コマンドラインにpulsecalと入力し、最短のパルス幅を与える高出力側の90度パルスの値をコピーします。getprosolコマンドを使用して、実験における校正済みハードパルスの値を入力します。次に、セットパルスの長さを設定するため、P13と入力し、50,000マイクロ秒の値を入力します。powerに移動し、shapeの隣にあるeditボタンをクリックして選択的パルス形状を設定し、shape pulsed 13に移動してガウスパルスを選択します。選択的パルスパワーSP13を50 dBに設定します。NSを入力して8に設定し、次にDSを入力して4に設定します。SSTD NMR実験を測定するために、プロトンNMR実験を開き、照射する信号の位置を確認してください。そのためには、ソフトウェアのブラウザで実験を検索し、データセットを右クリックして「新しいウィンドウで表示」をクリックしてください。実験を成功させるためには、照射の選択性を正確にする必要があります。補正剤を使用していないことを確認してください。さもなければ、照射周波数が不適切に設定される可能性があります。カーソル線を照射する信号の中心に移動させ、化学シフトをppm（parts per million）で記録します。実験に使用するスペクトル幅を選択してください。この例では、照射する信号は2.17 ppmにあり、使用するスペクトル幅は1.46 ppmです。次に、作成済みのSSTD NMR実験に移動し、コマンドラインにFQ2LISTと入力して照射周波数のリストを作成し、既存のリストを選択します。テキストプロトコルに従って、照射周波数のリストを編集してください。その後、リストに新しい名前を付けて保存します。次に、コマンドラインに FQ2LIST と入力し、作成したリストを選択します。解析対象の信号に実験の中心を合わせるには、O1P と入力し、照射する信号の化学シフトを実験の中心として選択してください。SW と入力して、スペクトル幅を選択します。スキャン間緩和遅延 D1 の値を決定します。この値が、最も緩和の遅いプロトンの T1 の 1～5 倍以上であることを確認してください。D1 と入力し、40 seconds に設定します。次に、飽和時間の最初の値を設定するため、D20 と入力し、40 seconds に設定します。RGAと入力して、レシーバーゲインを自動的に決定します。IEXPNOと入力して、次の実験を作成します。D20と入力し、飽和時間を20 secondsに設定します。次に、RGAと入力してRGを自動的に決定します。D20を10、5、2.5、1.25、0.625、および0.3秒として、最後の手順を繰り返します。すべての実験が作成されたら、最初の実験を開き、コマンドラインにmultizgと入力して実験数を指定します。データを処理するには、飽和時間が最も長い実験セットの中からプロセス番号1を開いてください。コマンドラインにLBと入力し、値を1.5に設定します。コマンドラインにEFPと入力し、FID番号を1、プロセス番号を2として処理します。インタラクティブ位相補正ボタンをクリックして実験の位相を補正し、2G実験として保存した後、保存して終了します。コマンドラインにREP 1と入力して、プロセス番号1へ移動します。次に、コマンドラインにEFPと入力し、process FID number = 2、in-process number = 3と指定します。続いて、コマンドラインにpoint MDと入力し、REP 2と入力して、プロセス2と3の両方のスペクトルを表示するマルチディスプレイウィンドウを表示させます。デルタ記号のボタンをクリックして差スペクトルを算出し、プロセス番号4に保存します。その後、マルチディスプレイウィンドウを閉じます。左側の信号から積分範囲を選択してください。工程3と工程4では、常に同じ領域を積分してください。積分後、各実験の積分（integrals）タブを開き、積分の絶対値をコピーします。異なる飽和形式を用いた残りの実験についても、同様の手順を繰り返します。速度論的パラメータを算出するために、まず得られたSSTDパラメータ値を飽和時間に対してプロットします。その後、テキストプロトコルに記載されている手順に従ってデータ解析を行います。アミド結合周りの回転障害により、プロトンNMRスペクトルにおいて両方のメチル基が2つのシグナルに分かれます。2.17 ppmにあるメチル基のスピン飽和により、プロトンNMRにおけるその信号が消失します。2.17 ppmのメチル基Bを飽和させると、内部回転により2.16 ppmのメチル基Aへ飽和が転移し、それが2.61 ppmの信号のプロトン強度の低下として観察されます。SSTDパラメータ係数は、差スペクトルにおけるメチル基Aの積分値を、元のスペクトルにおけるメチル基Aの積分値で除して算出します。特定の温度において、SSTDパラメータの値を飽和時間に対してプロットしたところ、指数関数的な曲線が得られました。これらの曲線をフィッティングすることで、測定信号のプロトンの速度定数および緩和時間を算出しました。異なる温度におけるSSTDパラメータの飽和時間に対するプロットから、対応する速度定数および緩和時間を求めました。熱力学的パラメータの算出にはアイリング式を用いた。SSTD NMRによって得られた値は、他の手法を用いて報告されたデータと極めて良好に一致している。一定温度において速度定数および緩和時間を求めるための一連の実験に習熟すれば、適切に実施した場合、約3時間で完了させることができる。この手順を実施する際は、良好な結果を得るために溶媒と温度の選択が極めて重要であるという点に注意してください。化学交換速度は、これらのパラメータによって大きく変動するためです。本手順に従うことで、速度論的なソフト分子間化学交換やリグニンの交換などの他のプロセスも研究することができ、さらに、方程式を適切に修正すれば、多部位交換や不均一な集団への対応にこの手法を拡張することが可能です。このビデオを視聴することで、スピン飽和転移差（STD）実験の実施方法、および化学交換を起こしている分子における速度論的および熱力学的パラメータを得るための磁化転移の利用方法について、十分に理解することができます。化学薬品の取り扱いは極めて危険である場合があるため、本手順のサンプル調製を行う際は、保護メガネや手袋などの安全対策を必ず講じてください。

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