イメージングGタンパク質共役型受容体媒介走化性及び好中球様HL60細胞におけるそのシグナル伝達のイベント

視覚走化性アッセイは、走化性因子媒介方向の細胞遊走を制御する方法、真核細胞のより良い理解のために不可欠です。 1）リアルタイム、複数の走化性アッセイの高解像度の監視、および2）を同時に化学誘引物質勾配を可視化し、好中球様HL60細胞内シグナル伝達事象の時空間ダイナミクス：ここで、我々はのための詳細な方法について説明します。

このモデルの全体的な目標は、複数の走化性アッセイの同時モニタリング、または単一の走化性細胞の複数のシグナル伝達イベントの可視化を可能にすることです。Overdeckの細胞生物学者は、細胞の走化性挙動を定量化するためのいくつかの異なるアプローチを開発しました。最近まで、私たちは、複数の走化性アッセイを同時に監視する方法など、走化性分野の重要な質問に答えることができました。

この技術の主な利点は、マイクロ流体工学の原理を適用して、高分解能で複数の同時走化性アッセイのための再現性と信頼性の高い成分をリアルタイムで生成できることです。その手順を実演するのは、当研究室のポスドクであるXi Wen博士です。ホルダーを組み立てるには、まずレバーを使用してベースを垂直位置に配置し、レバーがユーザーの方に傾くようにします。

次に、41ミリメートルガラスの表面に70%エタノールを軽くコーティングし、ワイプを使用してエタノールを慎重に取り除きます。ガラスをホルダーベースに挿入し、BSAコーティングされた2mm四方のカバースリップをガラスの上に置きます。次に、小さなOリングをウェーハハウジングの底に挿入し、ウェーハハウジングをホルダーベースに取り付け、機器の背面に楕円形の穴を開けます。

ホルダーベースの内側のレベルを前方に引いて水平位置まで引き、ウェーハハウジングを所定の位置にロックします。エアダスターを使用して、ウェーハハウジングの内部から破片を吹き飛ばします。次に、0.1%BSAを添加した4ミリリットルのRPMI 1640培地をハウジングに加えます。

次に、BSAコーティングされたセルモビリティ解析デバイスチップをウェーハハウジングの中央に取り付け、構造面をガラスに接触させ、位置決めマークを背面にします。ゴム製ガスケットの2つの突起を穴にはめ込み、ガスケットをウェーハクランプの下部に取り付け、大きなOリングをウェーハハウジングの上部に取り付けます。次に、センサー穴が後部にあるウェーハclを取り付け、ハウジングベースの外側のレバーを水平位置に前方に引いて、ウェーハclを所定の位置にロックします。

ホルダーを組み立てたら、ホルダーの底をライトボックスに置き、ウェルに気泡がないことを確認します。その後、カバーを取り外し、細胞移動度解析装置ユニット上部のプレートにアセンブリを移し、センサーブロックをホルダーに取り付けます。細胞移動アッセイを行うには、まず、分化したHL60細胞をBSA添加RPMI1640培地に懸濁し、1ミリリットルあたり10〜6細胞の2倍の濃度で懸濁します。

次に、細胞移動度解析装置ユニットを画像取得用のコンピューターに接続し、両方のデバイスの電源を入れます。次に、細胞移動度解析デバイスソフトウェアを開きます。カメラの画像コントロールパネルで、水平線と垂直線を使用してホルダーの位置をリアルタイムで調整し、デバイスをカメラ画像パネルの中央に配置します。

次に、[チャンネル 1] を選択してカメラを選択したチャンネルに移動し、[右に移動] の [左に移動] を使用して、カメラの X 座標を調整してビュー フィールドを水平方向に中央に配置します。画像を画面の中央に垂直に調整するには、細胞移動度解析デバイスのフロントパネルにある位置ノブを回します。ヒーターコントロールパネルで、ホルダーの温度を摂氏37度に、プレートの温度を摂氏39度に設定します。

ホルダーに接続された温度センサーを使用して温度を制御するには、[加熱]をクリックして加熱を開始し、[ホルダー]をクリックします。シューティングパネルで、インターバルに15秒、タイムに30分を入力して、ケモタキシスアッセイのインターバルとデュレーションをそれぞれ設定します。安全上の理由から、シューティングボックスの最後にあるヒーターオフを選択してください。

次に、ファイルを保存し、実験の詳細をメモパネルに入力し、デバイスがすべてのチャネルの中央に配置されていることを確認します。次に、ホルダーからすべてのバッファーを取り出し、最初のチャネルの上部から3番目のウェルから8マイクロリットルのバッファーを取り出します。シリンジを使用して、同じチャネルの2番目のウェルに2マイクロリットルの細胞を注入し、同時に画面をリアルタイムで監視して、注入中の細胞数と流れを制御します。

細胞が整列したら、すぐに8マイクロリットルのバッファーをウェルに戻し、先ほど示したように、チャネル2から6で細胞注入を繰り返します。すべての細胞を添加した後、2ミリリットルのバッファーをホルダーに戻し、上から3番目のウェルの適切なチャネルに1マイクロリットルの走化性物質を追加します。最後に、画像取得を開始します。

この代表的な実験では、HL60細胞は、走化剤の注入直後に直線経路で走化を開始し、グラジエント安定性シミュレーションの結果と一致して、アッセイの60分間全体にわたって継続します。細胞の移動経路と形態を追跡することで、細胞の全長、方向性、速度、および真円度を含む走化性指数を使用して、走化性挙動の定量的測定とその後の比較が可能になります。蛍光色素を化学誘引物質と併用すると、化学誘引物質の濃度とモニター対象の蛍光色素強度との間に直線的な関係を確立することができます。

さらに、均一に適用された走化剤刺激に応答して、HL60細胞は、GFPタクトプロテインキナーゼの堅牢な膜転座 D1.In 化学誘引剤勾配を媒介し、HL60細胞はキナーゼを前縁の後部に積極的に動員します。このプロセスをマスターすると、適切に実行すれば30分で完了できます。この手順を試行する際は、ホルダーアセンブリに関する製造元の指示に厳密に従い、細胞注入を監視することが重要です。

開発後、この技術は、走化性分野の研究者が、モノジェニズムdictyostiliumや他のタイプの哺乳類細胞システムなど、複数の走化性アッセイの可能性を探求する道を開きました。このビデオを見れば、ユニットの組み立て方法、走化性アッセイの同時実行方法、または走化性細胞における複数のシグナル伝達イベントの同時可視化方法について十分に理解できるはずです。