Cryomilled哺乳動物細胞からのタンパク質複合体の親和性のキャプチャ

このアフィニティーキャプチャプロトコルの全体的な目標は、哺乳動物細胞から内因性タンパク質複合体を単離することです。この方法は、どのタンパク質が一緒に形成されて物理的にリンクされた機能モジュールになるかなど、細胞生物学や分子生物学における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、目的の標的タンパク質に関連する多数の物理的相互作用が同時に観察される可能性があることです。

テキストプロトコルに記載されているように、1〜8グラムの細胞を増殖させます。成長培地を大きなビーカーに注ぎます。次に、大きな長方形の氷皿の氷の上に培養皿を置きます。

20ミリリットルの氷冷した1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を培養皿に加え、大型の細胞スクレーパーを使用して皿から細胞を放出します。氷上で予冷した50ミリリットルのチューブに細胞を移します。同じ皿にさらに10ミリリットルの氷冷した1xPBSを追加します。

残りの細胞を採取し、50ミリリットルのチューブに移します。このプロセスを料理ごとに繰り返します。異なるディッシュからの細胞懸濁液を組み合わせて、サンプル数とプラスチック廃棄物を減らすことができます。

次に、サンプルを摂氏4度で1, 000 x gで5分間遠心分離します。遠心分離後、上清を慎重に注ぎます。各ペレットを氷冷した1x PBSの10ミリリットルに再懸濁します。

再懸濁したペレットを50ミリリットルのチューブあたり最大5個で固めます。空のチューブを10ミリリットルのPBSで洗います。固めたサンプルに溶液を加え、前と同じように遠心分離します。

上清を取り除いた後、ペレットを10ミリリットルの氷冷した1x PBSに再懸濁します。20ミリリットルの注射器からプランジャーを取り外し、脇に置きます。シリンジのノズルにキャップをし、シリンジを50ミリリットルのチューブの中に入れ、そこに細胞懸濁液を移します。

1000 x g、摂氏4度で5分間遠心分離します。真空トラップシステムに取り付けられた先端の細いピペットで、細胞の最上層が吸い上げられるまで上清を吸引します。これにより、湿ったセルペレットが得られます。

シリンジのキャップを外し、プランジャーを挿入し、発泡スチロールの箱に入った液体窒素浴に保持された液体窒素で満たされた大きなプラスチックビーカーに細胞を直接滴下します。残りの細胞をシリンジから強制的に突っ込みます。次に、凍結した細胞を50ミリリットルのチューブに注ぎます。

チューブを緩くキャップして、余分な液体窒素を蒸発させます。摂氏80度で一晩保持します。翌日、キャップを完全に締めます。

凍結細胞は、この方法で80°Cで凍結するまで保存できます。細胞ビーズを摂氏80度の冷凍庫から取り出し、液体窒素浴の50ミリリットルのチューブホルダーに入れます。50ミリリットルの瓶、20ミリメートルのボール2つ、瓶の蓋を液体窒素が入ったきれいな長方形の氷のバケツで予冷します。

また、PTFE絶縁体を予冷します。パックのセットまたはスリーブアンドパックのいずれかを使用してください。ミルに適切なカウンターバランスを設定します。

鉗子を使用して、予冷した20mmのミリングボール2つと凍結したセルを予冷したミリングジャーの中に入れます。液体窒素を瓶に半分まで加え、蓋を瓶に置き、アセンブリをミルに移します。アセンブリを所定の位置にクランプし、400rpm、3分、毎分逆回転、インターバルブレークなしのプログラムを使用して、3サイクルのフライス加工を実行します。

フライス加工中にボールがガタガタと音を立てるのを聞くことは重要であり、これはボールが衝突して材料を粉砕していることを示しています。この音が聞こえない場合は、フライス加工が行われていないことを意味します。3回の製粉サイクルが完了したら、ジャーを液体窒素に戻し、しばらく休ませて冷まします。

蓋を慎重に取り外します。鉗子を使用してボールを取り外し、予冷したヘラを使用して粉末を予冷した50ミリリットルチューブに移します。瓶に液体窒素を加えると、ボールに固まった粉末を取り除くのに役立つことに注意してください。

細胞抽出物の調製には、100ミリグラムの細胞粉末を予冷した1.5ミリリットルまたは2ミリリットルのマイクロフュージチューブに入れます。空のマイクロフュージチューブで分析天びんを風袋引きします。液体窒素冷却スプーンまたはヘラを使用して、細胞粉末をチューブに分注します。

チューブ内に分注された粉末の質量を分析天びんで確認してから、チューブを液体窒素に戻します。細胞粉末の入ったチューブを開封し、室温で1分間放置してチューブ内の圧力を逃がし、粉末に添加した抽出バッファーがすぐに凍結するのを防ぎます。チューブにプロテアーゼ阻害剤を添加した400マイクロリットルの抽出剤を追加します。

チューブを短時間ボルテックスしてから、氷の上に保ちます。マイクロチップ超音波装置を使用して、サンプルに短時間の低エネルギーパルスを与え、凝集体を分散させます。遠心分離により抽出物を清澄化します。

最後に、上清を取り除き、アフィニティーキャプチャに進みます。アフィニティー培地を予備洗浄するには、抗体結合常磁性ビーズを含むチューブを磁石の上に置きます。ビーズは数秒以内にチューブの側面に蓄積し、保存溶液を取り除くことができます。

次に、500マイクロリットルの抽出バッファーをビーズに加えます。中速で短時間渦を巻いて混ぜます。さらに、ミニ遠心分離機でチューブを回転させ、すべての内容物をチューブの底に集めます。

次に、チューブを磁石に置き、溶液を吸引します。アフィニティーキャプチャーを開始するには、清澄化した細胞抽出物を、事前に洗浄したアフィニティー培地とボルテックスを短時間ボルテックスしたチューブに移します。チューブを摂氏4度で30分間インキュベートし、ローテーターホイールで連続的に穏やかに混合します。

ビーズはインキュベーション中ずっと懸濁したままにする必要があります。上清を吸引し、ビーズを1ミリリットルの冷抽出緩衝液で3回洗浄します。タンパク質を溶出するには、還元剤を含まないSDSページサンプルバッファーを添加して、ビーズからの抗体鎖の放出を軽減します。

撹拌しながら室温で5〜10分間インキュベートします。上清を収集して保存し、サンプルをSDSページにさらした後、標準的な手法を使用してタンパク質染色を行います。個々のタンパク質バンドを同定のために切除することも、サンプルを短時間だけ電気泳動することにより、サンプル全体を1回の分析で特徴付けすることもできます。

アフィニティーキャプチャーに使用される不溶性媒体を含む材料は、回収されたプロテオームに影響を与える可能性があります。ここに示されているのは、磁気ビーズ、鉄含浸アガロース、および伝統的なアガロースです。各培地は抗FLAG M2抗体と結合し、凍結粉砕されたHEK 293細胞から産生された抽出物にスパイクされたFLAGタグ付き細菌アルカリホスファターゼを捕捉するために使用されました。

ミクロンスケールの磁気ビーズは最もクリーンなプロファイルを示し、非特異的タンパク質の吸着レベルが比較的低いことを示しました。細胞溶解の方法も、回復したプロテオームに影響を与える可能性があります。ここでは、内因性タンパク質複合体を、凍結粉砕または超音波処理された細胞抽出物からのアフィニティー捕捉に供した。

凍結粉砕された細胞粉末から細胞抽出物を製造した場合、高質量の汚染物質は観察されませんでした。磁性媒体は他の媒体よりもバックグラウンドが低くても、抗体自体が、特にその標的抗原がない場合には、偽陽性の汚染の吸着を促進する可能性があります。抗体パラトープが占有されている、または使用されていないときに抗FLAG磁性体が寄与するバックグラウンド結合を決定するために、3x FLAGペプチドスパイクインの存在下または非存在下で、HEK 293T細胞抽出物を使用して模擬アフィニティーキャプチャ実験を実施しました。

同族のエピトープがない場合、alpha FLAG培地は、3x FLAGペプチドと競合して回避でき、SDSページサンプルバッファーによってより多く回避される可能性のある検出可能なレベルのバックグラウンドタンパク質を捕捉します。主な汚染物質種は、37〜50キロダルトンで観察されました。競合するエピトープが存在する場合、3x FLAGおよびSDSベースの溶出液はどちらも、バックグラウンドタンパク質の結合がほぼありません。

この手順を試みるときは、慎重に、迅速かつ正確に作業することが重要です。手順と観察されたバリエーションを追跡して、結果にとって最も重要なステップを学びます。この手順に続いて、質量分析、レートゾーン遠心分離、電子顕微鏡などの他の方法を実行して、混合物の組成、その均一性のレベル、および構成高分子複合体のサイズと形状を分析できます。

その開発後、アフィニティーキャプチャは、プロテオミクスの分野の研究者が生理学的タンパク質複合体の組成を比類のない詳細で探索する道を開きました。このビデオを見れば、哺乳類細胞をクライオミリング用に調製する方法や、目的のタンパク質のアフィニティーキャプチャーを実行する方法について十分に理解できるはずです。