Name: 植物病原体の遺伝子操作ウスチラゴmaydis真菌生物と植物微生物相互作用を研究します (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: 学ぼう、植物病原体Ustilago maydisの遺伝子操作法。プロトプラスト形成と形質転換を用いて欠失変異体を作製し、感染表現型と遺伝子機能を解析する信頼性の高い手法です。

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原稿の重要な読書のための博士ベネディクトSteutenに感謝します。キチナーゼ上のオリジナル作品は、博士はThorstenラングナーにより行いました。 VGの研究室は、植物科学優秀（CEPLAS、DFG EXC 1028）とBioSCのクラスタでサポートされている、KSの研究室ではBioSCによってサポートされています。 KBはBioSCによってサポートされています。 Bioeconomy科学センター（BioSC）の科学的な活動は財政NRW Strategieprojekt BioSC（第313 / 323-400-00213）の枠組みの中でイノベーション、科学・研究省によってサポートされていました。 LFはDFG国際研究研修グループ1525 iGRADplantの博士課程の交わりによってサポートされています。

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著者らは開示するものは何もない。

このプロトコルはU.で逆遺伝学的研究のための欠失変異体を生成する方法について説明しますmaydis。出発点は、それが以前に7,9を最適化したとして、目的遺伝子の約1開始の上流および終止コドンの下流キロバイトだけでなく、適切な耐性カセットの配列を含有するフランキング配列を含む欠失構築物であります。構築物は、個別に各遺伝子のために生成され、慎重に遺伝子を欠損する前にシーケンスエラーを検証する必要があります。フランクは、隣接遺伝子に到達または変異が調節要素を変更する場合脇腹における点突然変異は、特に、ゲノム配列中の不要な変化を引き起こす可能性があります。これは、すべての形質転換体に影響を与えるだろうし、所望の遺伝子の欠失とは無関係の表現型と副作用を引き起こす可能性があります。 削除戦略を計画する場合、予想される表現型は遺伝的背景を選択するように考慮しなければなりません。本発明の場合、AB33 23とSG200 10は、形態学的スイッチと植物感染において表現型のテストを可能にするために選ば...

ウスチラゴmaydisは何十年も1,2のために広く研究されてきた植物病原性のモデル菌です。それは2つの形態、酵母様、非病原性ステージと糸状、感染型3内に存在します。このような相同組換えおよびDNA修復機構としてユニバーサル画期的な発見は、この菌4の酵母様成長段階で行われました。また、感染症のための重要な感染性フィラメントと病原性因子への形態学的スイッチは5,6を十分に特徴づけされています。このスマット菌の生物学と病原性についての増加分子の知識は、優れたゲノムアノテーション10と使用して、逆遺伝学の容易さ、 例えば 、当研究所ではよく組織プラスミドコレクション（HTTPでサポートされている簡単な遺伝子置換戦略7-9に依存しています：//www.mikrobiologie.hhu.de/ustilago-community.html）。トウモロコシの中で標準化され、急速な感染アッセイeedlingsは、病原因子11の詳細な研究を可能にします。 U.のゲノムmaydisは、約6900の遺伝子10が含まれています 。その機能を研究するために、それらが原因で、効率的な相同組換え系を個別にまたは組み合わせて削除することができます。完全に相同末端を含む約1キロバイトの隣接領域は、相同組換え率50％より多くのための理想的ですが、すでに非相同末端を有する250bpのは、構造9の正しい統合をある程度可能にします。現在、5異なる耐性カセット、ハイグロマイシン、カルボキシン、ヌーセオスリシン、G418およびフレオマイシンに対する耐性を仲介hygR、cbxR、NATR、G418R、およびphleoRは 、形質転換体7,9を選択するために使用されています。また、ハイグロマイシン耐性、異種FLPリコンビナーゼ12の一過性発現によって除去することができる再利用可能なカセット（FRT-hygR）に開発されています。これは、耐性カセットの除去とそれによって理論的には無限の遺伝的改変を可能にします。フレオマイシン新しいカセットと、リサイクルhygRカセット特にphleoRの使用が減少されるように、13変異原性です。四重変異体は、このように他の4つのカセットを使用して生成することができますが、五重変異体について、FRT-hygRシステムは、14をお勧めします。 この一般的な遺伝子欠失戦略は成功し、このようなSporisoriumのreilianum 15、Uのような他の黒穂菌類に転送されましたhordei 16、またはU.エスクレンタ 17したがって、効率的な相同組換えシステムとまだ遺伝的難治生物におけるさらなる応用の可能性を提供しています。関与する遺伝子の欠失によって例示されるようにまた、相同組換えを欠く生物が遺伝子操作を改善するために修飾することができる非相同エンD-参加アカパンカビ 18,19インチここでは、Uのための公開された遺伝子欠失戦略を説明します候補者の迅速かつ正確な検証を中心とした実験的な詳細に7,9を maydis。例として、我々は真菌キチナーゼを使用して、単一変異体の生成だけでなく、複数の欠失株20,21を示しています。彼らは剛性の細胞壁にキチンに作用するためのキチナーゼは、興味深い例です。細胞壁リモデリングは、細胞分裂、糸状成長へのスイッチ、および胞子形成の間に形態学的変化のために必要とされます。従って、欠失変異体でライフサイクル全体の表現型が期待できます。

<table><tbody><tr><td>アミノ安息香酸(遊離酸)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-9878</td><td></td></tr><tr><td>Bacto agar&nbsp;</td><td>BD</td><td>214010</td>は<td>、代わりに地元のサプライヤー</td></tr><tr><td>であるバクトペプトン</td><td>BD</td>を使用し<td>211677</td><td>または地元のサプライヤー</td></tr><tr><td>であるバクト酵母抽出物を使用します&nbsp;</td><td>BD</td><td>212750</td>は<td>、代わりに地元の</td></tr><tr><td>サプライヤーCaCl2*2H2O</td><td>Gr&uumlを使用します。ssing GmbH</td><td>10234</td>は<td>、代わりに地元の</td></tr><tr><td>サプライヤーCa-Pantothenat(Hemi-Ca.塩)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-2250</td><td></td></tr>カル<tr><td>ボキシン&nbsp;を使用します。</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>45371</td><td></td></tr><tr><td>カサミノ酸&nbsp;</td><td>BD</td><td>223050</td><td></td></tr><tr><td>Cholinchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C-1879</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸</td><td>ChemSolute</td><td>24,321,000</td><td>代替的には、地元のサプライヤー</td></tr><tr><td>CuSO4*5H2O</td><td>Fluka</td><td>61240</td><td>代替的に地元のサプライヤー</td></tr><tr><td>D(+)スクロース&nbsp;</td><td>Roth</td><td>4621.1</td>は<td>、地元のサプライヤーである</td></tr><tr><td>DNA分解遊離酸を使用します&nbsp;</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>D-3159</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>FeCl3*6H2O</td><td>Gr&uuml;ssing GmbH</td><td>10288</td><td>代替的には、地元のサプライヤー</td></tr><tr><td>Geneticin (G418) 二硫酸塩</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1720</td><td></td></tr><tr><td>Trichoderma 溶解酵素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L1412</td><td></td></tr><tr><td>D(+) Glucose</td><td>Caelo</td><td>2580</td><td>代替的に地元のサプライヤー</td></tr>を使用 <tr><td>Glycerin&nbsp;</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>G065015</td><td>は、代わりに地元の</td></tr><tr><td>サプライヤーH3BO3</td><td>AppliChemA2940</td><td></td><td>危険物質を使用します。メーカーの安全上の注意を確認してください。</td></tr><tr><td>ヘパリンナトリウム塩</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3393-50KU</td><td></td></tr><tr><td>ハイグロマイシン B溶液</td><td>Roth</td><td>1287.2</td><td>危険物質&nbsp;</td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR</td><td>26764298</td><td>、または地元の</td></tr><tr><td>サプライヤーKH2PO4</td><td>AppliChem</td><td>A3620</td><td>を代わりに使用し、地元の</td></tr><tr><td>サプライヤーMgSO4水を含まない</td><td>Merck</td><td>7487-88-9</td>水<td>を含まないことが重要です。または、地元の</td></tr><tr><td>サプライヤーMnCl2*4H2O</td><td>AppliChem</td><td>A2087</td>を使用し、<td>地元のサプライヤーmyo-Inositol</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>I-5125</td><td></td></tr><tr><td>Na2-EDTA*2H2O</td><td>AppliChem</td><td>A2937</td><td>を代わりに地元のサプライヤーを使用してください</td></tr><tr><td>Na2MoO4*2H2O</td><td>Roth</td><td>0274.2</td><td>または、地元のサプライヤー</td></tr><tr><td>Na2SO4</td><td>Gr&uuml;ssing GmbH</td><td>12174</td><td>は、地元のサプライヤー</td></tr>である <tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S316060</td><td>を使用し、地元のサプライヤー</td></tr><tr>である<td>NaOH</td><td>ChemSolute</td><td>13,751,000</td><td>を使用する代わりに、地元のサプライヤー</td></tr><tr><td>NH4NO3</td><td>Roth</td><td>K299.1</td><td>を使用し、地元のサプライヤー</td></tr><tr><td>であるニコチン酸 (遊離酸)</td> <td>Sigma を使用します。Aldrich</td><td>N-4126</td><td></td></tr><tr><td>Nourseothricin二水素硫酸塩&nbsp;&nbsp;</td><td>Werner BioAgents</td><td>5,001,000</td><td></td></tr><tr><td>栄養ブロス&nbsp;</td><td>Difco</td><td></td><td>の現地サプライヤー</td></tr><tr><td>フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール (25:24:1) pH 6.7</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3803</td><td>危険物質。メーカーの安全上の注意を確認してください。</td></tr><tr><td>ポリエチレングリコール(PEG)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-3640</td><td></td></tr><tr><td>Potassium acetate</td><td>AppliChem</td><td></td><td>121479 代わりに地元のサプライヤーを使用</td></tr><tr><td>ピリドキシン(モノ塩酸)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-9755</td><td></td></tr><tr><td>Riboflavin&nbsp;</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>R4500</td><td></td></tr><tr><td>RNaseA</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>R5503</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Roth</td><td>Cn30.3</td><td>代わりに地元のサプライヤー</td></tr><tr><td>の小さなシリンジ</td><td>BD</td><td>300300</td><td>または地元のサプライヤー</td></tr>の<tr><td>滅菌フィルター、22 & マイクロを使用します。m</td><td>VWR</td><td>28145-477</td><td>または、地元のサプライヤー</td></tr>である <tr><td>Sorbitol</td><td>Roth</td><td>6213.1</td><td>を使用する代わりに、地元のサプライヤー</td></tr><tr><td>であるチアミン - 塩酸塩</td><td>Serva</td><td>36020.02</td><td>を使用する代わりに、地元のサプライヤー</td></tr><tr><td>である tri-Na-Citrate</td><td>Fisher Chemical</td><td>S332060</td><td>を使用し、または地元のサプライヤー</td></tr><tr><td>である Tris- (ヒドロキシメチル) アミノメタン</td><td>VWR</td> <td>を使用します103156X</td><td>は、地元のサプライヤー</td></tr><tr><td>であるTris hydrochloride</td><td>Roth</td><td>9090.4</td>を、<td>または地元のサプライヤー</td></tr><tr><td>であるTriton X-100&nbspを使用します。</td><td>セルヴァ&nbsp;</td><td>37240</td>は<td>、代わりに地元の</td></tr><tr><td>サプライヤーZnCl2</td><td>Fluka</td><td>96470</td>を<td>代替的に地元のサプライヤーを使用します</td></tr><tr><td>溶液の組成/材料の</td><td></td><td></td>調製 <td>溶液の組成</td></tr><tr><td>カルボキシン</td><td></td><td></td><td>ストック:メタノール中の5 mg / ml、最終濃度:2 & マイクロ;g/ml</td></tr><tr><td>CMプレート</td><td></td><td></td><td>0.25 % (w/v) カサミノ酸、0.1 % (w/v) 酵母抽出物、1.0 % (v/v) ホリデイビタミン溶液、6.25 % (v/v);ホリデイ塩溶液、0.05 % (w/v) DNA degr.遊離酸、0.15 % (w/v) NH4NO3、2.0 % (w/v) バクト寒天;5 M NaOHを使用してpH 7.0に調整します。オートクレーブ後、1 % グルコースを添加します&nbsp;</td></tr><tr><td>ジェネチシン(G418)</td><td></td><td></td><td>ストック:H2O中の50 mg / ml、最終濃度:500 & micro;g/ml</td></tr><tr><td>HCl洗浄ガラスビーズ (0.35-0.45 mm)</td><td></td><td></td>ガラス<td>ビーズを濃縮HCl (25 %, 7.8 M) で覆い、60分間インキュベートします。HClをデカントし(液体をデカントする)、ガラスビーズを3M HClで洗浄する(液体をデカントする)。.pHが7になるまで、ガラスビーズを二重蒸留H2Oで数回洗浄します(液体は黄緑色にならないはずです)。ガラスビーズを分注し、180°Cで乾燥させます。デカントされたHClは、廃棄する前に中和する必要があります。&nbsp;</td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td></td><td></td><td>ストック:15 mg / ml</td></tr><tr><td>ホリデイ塩溶液</td><td></td><td></td><td>16.0&パーミル;(w/v)KH2PO4、4.0 &permil;(w/v)Na2SO4、8.0 & パーミル;(w/v)KCl、1.32 &permil;(w/v)CaCl2*2H2O、8.0 &permil;(v / v)微量元素、2.0およびパーミル。(w/v)MgSO<サブ>4</サブ>;滅菌濾液</td></tr><tr><td>Hollidayビタミン溶液&nbsp;</td><td></td><td></td><td>0.1&パーミル;(w/v)チアミン、0.05&permil;(w/v)リボフラビン、0.05&permil;(w/v)ピリドキシン、0.2&permil;(w/v)Ca-Pantothenat、(0.05&permil;(w/v)アミノ安息香酸、0.2&permil;(w/v)ニコチン酸、0.2&permil;(w/v)コリンクロリド、1.0&permil;(w / v)ミオイノシトール;-20°Cで保存できます。C</td></tr>ハイ<tr><td>グロマイシン</td><td></td><td></td><td>ストック:PBS中50mg / ml、最終濃度:200&マイクロ;g / ml</td></tr><tr><td>ヌーセオトリシン</td><td></td><td></td><td>ストック:H 2 O中の200 mg / ml、最終濃度:150 & micro;g/ml</td></tr><tr><td>NSY-グリセロール培地</td><td></td><td></td><td>0.8 % (w/v) 栄養ブロス、0.1 % (w/v) 酵母抽出物、0.5 % (w/v) ショ糖、&nbsp; 80.0 % (v/v) 87% グリセリン (f.c. 69.6%)&nbsp;</td></tr><tr><td>RegLight</td><td></td><td></td><td>1.0% (w/v) 酵母抽出物&nbsp; 0.4% (w/v) バクトペプトン, 0.4% (w/v) スクロース, 18.22% (w/v) ソルビトール, 1.5% (w/v) 寒天</td></tr><tr><td>SCS, pH 5.8</td><td></td><td></td><td>溶液 1: 20 mM トリ-Na-クエン酸塩、1 M ソルビトール; 溶出液 2: 20 mM クエン酸、1 M ソルビトール、pH 5.8 に達するまで溶液 2 を溶液 1 に加える; オートクレーブ</td></tr><tr><td>STC, pH 8</td><td></td><td></td><td>1 M ソルビトール、10 mM Tris-HCl pH 7.5、100 mM CaCl2; 無菌</td></tr><tr><td>STC/PEG</td><td></td><td></td><td>40 % (v/v) PEG STC バッファー中 &nbsp;</td></tr><tr><td>TEバッファー、pH 8</td><td></td><td></td><td>1.31 mM Tris-Base、8.69 mM Tris-HCl、10 mM Na2-EDTA*2H2O</td></tr><tr><td>TE/RNase</td><td></td><td></td><td>10 & micro;TEバッファー中のg / ml RNaseA</td></tr><tr><td>微量元素</td><td></td><td></td><td>0.06&permil;(w/v)H3BO3, 0.14&permil;(w/v)MnCl*4H2O, 0.4 & パーミル;(w/v)ZnCl2、0.4 &permil;(w/v)Na2MoO4*H2O:2, 0.1 & パーミル;(w/v)FeCl3*6H2O、0.04&permil;(w/v)CuSO4*5H2O</td></tr><tr><td>Trichoderma 溶解酵素溶液</td><td></td><td></td><td>12.5 mg/ml SCS; 無菌ろ過;使用直前に調製</td></tr><tr><td>Tris-HCl pH 7.5</td><td></td><td></td><td>806 mM Tris-HCl, 194 mM Tris-Base; pH を確認し、必要に応じてHClで調整; オートクレーブ</td></tr><tr><td>Usti-lysis 緩衝液 1, pH 8</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris-HCl(pH 8.0)、10 mM NaCl、1%(w/v)SDS、2%(v/v)TritonX-100、1 mM EDTA。pHメーターを使用してpHを測定しないでください。&nbsp;</td></tr><tr><td>Usti-lysis buffer 2</td><td></td><td></td><td>mix Usti lysis buffer 1 with 1x TE in a ratio at 1:1</td></tr><tr><td>YEPS-Light medium</td><td></td><td></td><td>1.0% (w/v) 酵母抽出物、0.4% (w/v) バクトペプトン、0.4% (w/v) スクロース、プレート用: 1.5% (w/v) バクト寒天</td></tr></tbody></table>

植物病原体の遺伝子操作<em&gt;ウスチラゴmaydis</em&gt;真菌生物と植物微生物相互作用を研究します

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

遺伝子欠失は、遺伝子機能の解析に重要な役割を果たしています。目的の方法で遺伝子を破壊するための最も効率的な方法の一つは、相同組換えを介して選択可能なマーカーで遺伝子全体の交換です。相同組換えの際に、DNAの交換は、高い類似性を有する配列との間で行われます。従って、標的遺伝子に隣接する線形ゲノム配列は、具体的には、所望の組込み部位を選択可能なマーカーを指向するために使用することができます。欠失コンストラクトの平滑末端は細胞のDNA修復系を活性化し、それによって、相同組換えを介して、または非相同末端接合のいずれかによって、構築物の統合を促進します。効率的な相同組換えを有する生物では、成功した遺伝子欠失の割合は、50％以上がこの戦略の貴重な遺伝子破壊システム作りに到達することができます。黒穂菌ウスチラゴmaydisは 、このような効率的な相同recombinatを示す真核生物のモデル微生物でありますイオン。その約6,900の遺伝子のうち、多くは、機能的欠失変異体を利用して特徴づけされており、遺伝子の本質的な機能で遺伝子置換試行点の失敗を繰り返しました。蛍光マーカーまたは予測ドメインの変異とタギングによる遺伝子機能のその後の特徴付けはまた、相同組換えを介したDNA交換に依存しています。ここでは、Uを発表します最も簡単な例を用いて詳細に歪み生成戦略、遺伝子欠失をmaydis。

U.でエンコードされたすべての4キチン分解遺伝子に対する欠失構築maydisゲノムはCTS1の削除のためにhygRカセットを使用して、ゴールデンゲートクローニングによって生成された、NATR CTS2の削除のため、CTS3の削除とcts4 20の削除のcbxRためG418Rカセット 。遺伝子置換戦略の概要は、CTS3の欠失（ 図1）が挙げられます。第キチン分解遺伝子とCTS1のシングルと二重変異体は、病原性におけるキチナーゼの役割の分析のための2つの異なる遺伝的背景に、同じ構築物で連続的に発生させました。二つの異なる系統の背景を使用した：AB33は、糸状の成長の誘導を可能にする病原23への第一歩、SG200は、急速な疾患のスコア10を可能に</sup...

我々は遺伝的にウスチラゴがmaydisスマット菌を操作する堅牢な遺伝子置換戦略を説明します。このプロトコルは、感染症の表現型を調べるために、欠失変異体を生成する方法について説明します。蛍光タンパク質タグをコードする配列を付加することによって、 例えば 、任意の所望の方法で遺伝子を修正するために拡張することができます。

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

このプロトコルの全体的な目標は、スマット菌、ustilago maydisを遺伝子組み換えすることです。この系統生成法により、さまざまな方法で遺伝子の機能特性評価が可能になります。例えば、遺伝子を削除したり、プロモタスを交換したり、融合コンストラクトを生成したりすることができます。この方法の主な利点は、修飾を正確に検証できるため、任意の表現型を目的の遺伝子の変化に直接関連付けることができることです。この手法の視覚的なデモンストレーションは、プロトプラスティング反応をいつ停止するかを知ることが形質転換を成功させるために重要であるため、不可欠です。準備として、2ミリリットルの丸底チューブを摂氏マイナス20度で冷却します。次に、新しいプレートを使用して、3ミリリットルのプレカルチャーをYEPS-Lightに接種します。摂氏28度の回転ホイールで24時間インキュベートします。翌日、困惑したフラスコに25マイクロリットルのプレカルチャーを50ミリリットルのYEPS-Lightに加えます。次に、オービタルシェーカーで培養物を指数関数的段階に達するまで成長させます。1.0の光学密度は、ustilago maydisの7番目の細胞に10の1〜2倍に相当します。600ナノメートルでの光学濃度を確認します。0.6 から 1.0 の値を指定できます。次に、40倍の倍率で細胞の汚染を確認します。細菌汚染は、小さく、しばしば移動する細胞として識別できます。真菌汚染は、その形状またはサイズに基づいて識別できます。常に汚染された文化を捨て、きれいな文化からのみ作業してください。細胞を1, 500 Gで5分間ペレット化した後、上層を廃棄します。その後、ペレットを25ミリリットルのSCSに再懸濁します。遠心分離を繰り返します。その間に、細胞ペレットごとに3ミリリットルのプロトプラスティング溶液を調製します。この溶液を22ミクロンのフィルターに通します。次に、上清を捨て、ペレットを2ミリリットルのプロトプラスト溶液に再懸濁します。次に、細胞の30〜40%が丸いまたはピンヘッド形状になるまで、細胞を室温で休ませます。反応には5〜20分かかる場合があります。5分後に顕微鏡で観察を開始します。最大の形質転換効率を得るためには、原形成反応を適切なタイミングで停止させる必要があります。そして、プロトプラストはシャボン玉のように非常に慎重に取り扱わなければなりません。プロトコールを進め、常にプロトプラストを氷上に保ちます。次のステップは、10ミリリットルの冷たいSCSでそれらを洗浄し、次に1, 000 Gで5分間の回転でそれらを収集することです。洗浄後、ペレットを10ミリリットルの冷たいSTCに再懸濁します。次に、1, 000 Gでさらに5分間のスピンで細胞を再度収集し、続いて1ミリリットルの冷たいSTCに再懸濁します。次に、コールドチューブに100マイクロリットルのアリコートを作り、これらのアリコートを摂氏マイナス80度で保管します。ustilago maydis protoplastsを形質転換するには、形質転換ごとに2つの選択肢を準備します。まず、RegLight寒天を溶かし、60°Cに冷まします。次に、溶けた寒天の一部に、作業濃度の2倍の選択的抗生物質を加え、各プレートに12ミリリットルを加えて最下層を形成します。サンプルは慎重に混合する必要があります。泡を作らないようにしてください。抗生物質を含まない残りのRegLightは摂氏60度に保ちます。.次に、形質転換ごとに氷上でプロトプラストのチューブを1本解凍します。解凍したら、1マイクロリットルのヘパリン溶液と1マイクログラムの直鎖状構築物DNAを追加します。その後、氷の上に10分間置きます。待っている間、抗生物質を含まない12ミリリットルのRegLightを、抗生物質を含むRegLightの上に広げます。次に、各形質転換チューブに500マイクロリットルのSTC / PEGを追加し、反転して慎重に混合します。その後、氷上でさらに15分間インキュベーションを続けます。次に、各形質転換反応を2つの別々の選択的RegLightプレートに分配します。先に進む前に、すべての液体がプレートに染み込んでいることを確認してください。次に、プレートを28°Cで直立させて5〜7日間インキュベートし、100〜200個のコロニーを作ります。数個のコロニーしか増殖しない場合、プロトプラストは細胞壁を過剰に含んでいる可能性があり、これは細胞作製血漿でそれらを形質転換することによってテストすることができます、またはそれらが再生できないかもしれません、そしてこれは抗生物質なしでそれらをプレートに植えることによってテストすることができます。後で、テスト用に 24 個の変換体を選択します。選択的なYEPS-Lightで再精製し、単一のコロニーを取得します。各プレートで、元の菌株の一部も線状に抽出して、抗生物質が非形質転換体に対して選択していることを確認します。2つのPCRとサザンブロット解析を含む3段階のプロセスを使用して変異を検証することが重要です。これらについては、テキストプロトコルで詳しく説明されています。このセクションでは、これらの解析に必要なゲノムDNAの調製方法について説明します。まず、5ミリリットルのYEPS-Lightに候補形質転換剤を接種し、回転ホイール上で28°Cで24時間インキュベートします。翌日、2マイクロリットルの培養物をCMプレートに落とします。培養物を無菌状態に保ちます。次に、約200マイクロリットルの塩酸洗浄ガラスビーズと2ミリリットルの24時間培養液を入れた2ミリリットルのチューブを準備します。チューブを12, 000 Gで5分間回転させた後、上清を吸引して廃棄します。保存のために凍結することができるペレットに、500マイクロリットルのusti-lysis緩衝液2を追加します。次に、Vibraxでチューブを1, 000 RPMで5〜15分間振ってください。細胞が完全に再懸濁されていることを確認してから、チューブを摂氏65度で15〜20分間インキュベートします。次に、チューブを氷の上に5分間置きます。冷めたら、100マイクロリットルの8モル酢酸カリウムを加え、短いボルテックス、または10回の反転を適用します。次に、チューブを室温で12, 000 Gで15分間回転させます。次に、500マイクロリットルの上清を1.5ミリリットルのチューブに分注し、400マイクロリットルのイソプロパノールを分注します。混合後、12, 000 G.Discardで5分間チューブをスピンダウンし、上清を捨て、ペレット化されたDNAを70%エタノールの500マイクロリットルで洗浄します。次に、5分間のスピンを適用し、上清を完全に取り除きます。もう一度短い回転の後、DNAペレットを数分間自然乾燥させ、次に50マイクロリットルのRNase NTEを追加します。RNaseを添加後、振とうしながらインキュベートし、DNAを解析に用います。チンチナーゼcts3デルタの単一変異体および二重変異体、および最大3つの他のキチナーゼ遺伝子を持つ複数の変異体を、2つの異なる遺伝的背景で同じ構成体で逐次生成した。形質転換体はPCRで確認し、次にサザンブロット解析で確認しました。cts3遺伝子については、SG200株の相同組換え率は70%であり、cts3が非必須機能を有することが示唆された。突然変異の中には、明らかな成長障害を引き起こすものもあります。例えば、cts1/2二重変異体には顕著な細胞分離欠損がありました。中隔を染色すると、細胞質分裂は完了するが、細胞は接続されたままであることが示されました。キチナーゼの病原性への寄与を調べるために、SG200株変異体を用いて実生感染アッセイを実施した。制御遺伝子khd4の突然変異は病原性を低下させましたが、すべてのキチナーゼの欠失はトウモロコシの苗の感染に影響を与えませんでした。このビデオを見た後、ustilago maydisのようなスマット菌を遺伝子組み換えする方法をよく理解しているはずです。一度習得すれば、約4週間で簡単に菌株を生成することができます。この手順を使用する場合、将来のクローニングプログラムを使用してひずみ検証の詳細を計画することが非常に重要です。これは、真菌培養物の取り扱いを開始する前に行ってください。この手順をわずかに変更するだけで、sporsorium reilianumやustilago esculentaなどの他のスマット菌、さらにはpiriformospora indicaのような糸状菌を遺伝子組み換えすることができます。遺伝子組み換え生物の取り扱いは、お住まいの国の規制に従って実施する必要があることを忘れないでください。

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Genetics

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植物病原体の遺伝子操作

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