世界的な農業害虫昆虫における胚のマイクロインジェクションを介して、核酸の送達、チチュウカイミバエ

この手順の全体的な目標は、重要な農業害虫であるCeratitis capitataの胚に核酸を送達し、最終的にその防除のためのツールボックスを拡大することです。この方法は、不動生物の遺伝子を機能的に補正し、トランスジェニック株を生成するのに役立ちます。この技術の主な利点は、目的の効果を達成するために非常に少量の核酸を注入することです。

メダカのコロニーのすべてのライフステージを摂氏25度、湿度65%、午前8時から始まる光期の12時間の明暗写真期間を12時間維持します。6リットルのケージを設置し、1、500〜2、000匹の蛹を1つに積み込みます。

食物の場合は、酵母と砂糖の1〜10の混合物を約45グラムケージに入れます。卵を集めるには、ケージの下に水で満たされたプレートを置きます。雌はメッシュを介して卵を産み、卵は水中に集まります。

処女の女性は卵子を産むことができるため、ハエが卵を集める前に、ハエが少なくとも1週間齢になるまで待って、卵子がすべて受精していることを確認してください。卵を集めるには、細かいストレーナーで水をろ過します。次に、パステラルピペットを使用して、約0.5リットルの標準的な幼虫の餌を入れたプラスチックの箱に卵を移します。

十分な卵が産まれなかった場合は、大人の食物の酵母含有量を最大25%増やします各箱を透明な容器に入れ、ふすまの層を入れて蛹化を促進します。容器をネットの蓋で覆い、空気が循環できるようにします。約10日後、蛹化のためにふすま層に飛び降りた3番目の幼虫を確認します。

見つかったら、翌日に蛹をチェックする準備をしてください。蛹を集めるには、柔らかいブラシを使用してコンテナから蛹を掃き出します。最初に、蛹を小さなカップに集めます。

コレクションが完了したら、蛹を新しい大人のケージに移します。成虫は約10日で羽化するはずです。マイクロインジェクションの場合は、事前にスライドを用意しておいてください。

スライドに2センチメートルの両面テープを貼り付け、端にチャイナマーカーで印を付けて、胚の水分を保つ油層の壁を作ります。産卵したばかりの胚を採取するには、受精した若い女性を新しいトレイで30分間卵子形成させてから、胚を採取します。胚から絨毛膜を除去するには、ストレーナーと卵を市販の50%漂白剤溶液に5秒間浸します。

胚を過度に漂白しないことが重要です。漂白された胚は、ストレーナーをきれいな超純水に注意深く浸して、すぐに洗います。これを少なくとも 4 回行います。

その後、ストレーナーを澄んだ超純水に保管し、2時間以内に胚を注入します。次に、細い絵筆を使用して、約50個の胚を収集し、水に浸した黒い濾紙のディスクの上に置きます。解剖実体顕微鏡の下で、準備した顕微鏡スライドの二重コーティングテープ上に胚を漕ぎます。

すべての胚を同じ方向に向けます。ペイントブラシで胚膜を突き刺すと、胚の生存率を低下させる損傷を引き起こす可能性があるため、胚を慎重に操作することが重要です。次に、胚をクロロトリフロロエトレンオイルの層で覆います。

オイルはチャイナマーカーの境界線に含まれている必要があります。境界線をはみ出さないでください。マイクロピペットを使用して、注射針に数マイクロリットルの核酸溶液を1マイクロリットルあたり1〜2マイクログラムでロードします。

次に、針をマイクロインジェクション装置に接続し、背圧150ヘクトパスカルで800ヘクトパスカルで半秒の注射を提供するように設定します。注入するには、フットペダルトリガーを使用し、マイクロマニピュレーターを使用して針を制御し、ステージコントロールを使用してスライドを動かします。注入ボーラスが適切に排出されていることを確認してから、針を列の最初の胚の後極に合わせます。

ステージを移動させることで、胚に針を挿入し、核酸のボーラスを注入します。注入された液体は内圧の上昇を誘発し、その結果、胚がわずかに動きます。ペダルを離し、すぐに、しかし穏やかに、胚から針を取り出します。

注入部位に少量の細胞質が漏れます。これは正常です。胚が注射で破裂している場合は、胚を数分間乾燥させてから、油で覆います。

注入後、スライドをペトリ皿に移します。皿の蓋に濾紙のディスクを置きます。フィルターを水に浸し、パラフィンフィルムでシャーレを閉じます。

チャンバーを摂氏25度でインキュベートします。注射の2日後、孵化した幼虫がないか、一日を通して数回スライドをチェックします。油で幼虫を探し、細い絵筆を使用して、にんじんベースの幼虫の餌を入れたシャーレに移します。

各皿に最大200匹の幼虫を入れます。幼虫は油の中で長く生き残ることができないので、頻繁に探してください。蓋をほとんど閉じた状態で幼虫を孵化させ、幼虫への空気の流れがまだあるようにします。

毎日皿をチェックし、一週間後にふすまの入った容器に皿を入れて幼虫を集める準備をします。蛹を集めて、すぐに彼らが出てくることを期待してください。その後、孵化した成体に二酸化炭素を使用して麻酔をかけ、形質転換を検査します。

スクリーニングアウトでは、その動員方法が重要になります。Medflyの成虫は、氷やCO2を使用して麻酔をかけることができますが、長時間の曝露は他の人の生存率を低下させる可能性があります。DS red wide filterを使用して赤色蛍光の存在を確認します。

または、EYFPフィルターを使用して緑色蛍光を確認します。形質転換した個体を異性の野生型の成虫と一緒に小さなケージに移し、ヘテロ接合株を確立します。ある実験では、二重ひずみRNAを使用してinx5遺伝子発現をサイレンシングしました。

未注射対照群の成人生殖細胞系は予想通り正常であるように見えますが、治療を受けた個人は未発達の精巣と卵巣を示しました。男女の個人の腹部におけるinx5転写産物の存在量の定量化により、対照と比較して遺伝子の発現が有意に低いことが確認されました。2番目の実験では、β-2チューブリンプロモーターを使用して、異なる蛍光マーカーを駆動するために、標識された精子を持つ2つの株が生成されました。

トランスジェニック男性は、体内と精巣に明確な蛍光パターンを示しました。このビデオでは、medfly胚への核酸の飼育とマイクロインジェクションに最適化されたプロトコルを提供します。一度習得すると、最大1,000個の胚を8時間の労働日に注入できます。

この手順に続いて、thy-lino-crisp-er、cas-min-eta-geno-meta-tineなどの他の金属を実行して、新世代のメドフライ株を開発することができます。