Name: 世界的な農業害虫昆虫における胚のマイクロインジェクションを介して、核酸の送達、チチュウカイミバエ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 学ぶ地中海実蠅Ceratitis capitataの胚マイクロインジェクションによる核酸送達法。低用量の核酸注入で遺伝子機能解析とトランスジェニック系統作出を実現し、農業害虫防除のための遺伝学的ツールを拡張する。

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著者は「昆虫遺伝学とゲノミクス」研究所のすべてのメンバー、特に過去30年間にわたってメドフライの開発、適応、飼育に取り組んできたロレンツォ・ギリンゲリに感謝したいと思います。この論文の代表的な結果の一部は、N. Biotechnology, 25(1) by Scolari F. et al., Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insectis capitata (Wiedemann;双翅目:Tephritidae)、76-84、2008年、エルゼビア(ライセンス番号3796240759880)の許可を得て。この作業は、Cariplo-Regione Lombardia "IMPROVE"(FS)の支援を受けました。

1.実験の設定<ol><li> 昆虫館の要件 <ol><li>すべてのC.を維持25℃、湿度65％および12/12時間の明/暗の光でcapitataのライフステージ。 </li><li> 6 Lケージには約1,500〜2,000チチュウカイミバエ蛹を置きます。産卵42を刺激するのに十分に小さい穴を有する一方の側に真鍮メッシュでケージを使用してください。毛細管現象により水でハエを提供するために、ケージのベースにある小さい開口部からスポンジ片を挿入します。大人（ 図1A）のための食料源として酵母と砂糖（1:10）の混合物を使用してください。酵母の量を増やします（最大1：砂糖：3、酵母）メスは卵を産むために失敗する必要があります。 </li><li>メッシュを通して堆積卵を収集するために、ケージの下に水で満たされたプレートを置きます。処女雌が産卵することができるようにハエがマイクロインジェクション実験のために卵を収集する前に、少なくとも6〜7日間経過するまで、待ちます。これは、女性が交尾しているであろうことを保証しますそして卵が受精されているであろうこと。 </li><li>細かいネットストレーナーで水を濾過することによって卵を収集します。標準の幼虫の食（1.5 LH 2 O、100ミリリットルを1％HClを含有するプラスチック製の箱にストレーナから卵を移す広域スペクトル抗菌剤は50ミリリットルのエタノールに溶解した5グラム、400グラムの砂糖、175グラムの脱イオンビール酵母、1パスツールピペットを使用して）軟質小麦ふすまをkgです。 </li><li>空気の循環を可能にするために、ネット蓋を透明容器内の各ボックスを配置し、ふすまの層を含有する蛹化（ 図1B）を有利にします。 </li><li>約10日後に、幼虫の食物から出てくると蛹化のためのふすま層に飛び降りる第3齢幼虫を確認してください。 </li><li> 24時間後、柔らかいブラシを使用して、小さなカップに蛹を収集し、新しい大人のケージに転送します。大人は通常10日蛹化後に出現します。新興フライはptilinum、目の上にその頭の上に位置して膨らませてポケットを使用していますアンテナの電子ベースは、蛹殻の終わりを強制的にオフにします。出現した後、ptilinumは恒久的に頭の中に戻って崩壊します。 </li></ol></li><li> マイクロインジェクション幼虫のため1 Lの食品の調製 <ol><li> 300ミリリットルのH 2 Oに2.5グラム寒天を溶かし</li><li>ホット撹拌プレート上のウォーム500ミリリットルのH 2 Oおよび4グラム安息香酸ナトリウム、4.5ミリリットル37％HClを、42グラムの酵母エキスと115グラム脱水ニンジン粉末を溶解します。 </li><li>混合物に10ミリリットルの無水エタノールに溶解した2.86グラム広域スペクトル抗菌剤の溶液を加えます。 </li><li> 15センチメートルラウンドペトリ皿に培地を配布し、放冷します。必要に応じて、4℃で保存します。 </li></ol></li><li> スライドの準備 <ol><li>顕微鏡スライド（75×26ミリメートル2）に両面テープの2cmのストリップを置き、油スプレッドと注入された胚の結果としての乾燥を防ぐために、中国のマーカーでエッジをマークします。 </li></ol></li><li><st栄&gt;核酸の準備<ol><li>市販のキット34を用いてプラスミドDNAを単離します。エタノールを用いてプラスミドを沈殿させ、所望の濃度で注射用緩衝液（0.1 mMリン酸緩衝液pH 7.4、5ミリモルのKCl）中に再懸濁します。 </li><li>フェノール-クロロホルムを使用して、長いdsRNAを合成し、in vitroで精製、イソプロパノールを用いて沈殿させ、注入バッファ43に再懸濁します。 </li></ol></li></ol> 2.胚の準備<ol><li> 6-7日齢の成人を含むケージの下に水で満たされたトレイを置きます。 </li><li>女性は30分間産卵した後、細かいストレーナーを用いて水を濾過することによって胚を収集することを許可します。常に胚の乾燥を避けるために、水にストレーナを保ちます。 </li><li>商業50％の漂白剤溶液中に5秒間ストレーナを浸すことにより、胚をDechorionate。 </li><li>少なくとも、（繰り返しきれいな超純水にストレーナを浸すことにより、慎重に胚を洗います4-5回）。最後に、きれいな超純水にストレーナを配置します。最大2時間以内に胚を使用してください。 注：マイクロインジェクションのタイミングは、前細胞化の核分裂の段階の間に、前胚盤葉の胚に注入する必要性に関連しています。これは、注入されたDNAを採取アップする核に、具体的に配偶子を発信します始原生殖細胞核の中にできます。チチュウカイミバエ細胞化に9と12時間45,46との間で行われるのに対し、 ショウジョウバエでは、極細胞で細胞化は、胚盤葉の形成は、約30分後に44を発生すると、（25℃）受精後約90分で開始します。 </li><li> 行の胚の向き <ol><li>細かい絵筆を使用して、約50の胚を収集し、水に浸した黒濾紙ディスク上に置きます。 </li><li>解剖実体顕微鏡下では、両面テープの上面の上の行の胚を手配細かい絵筆（000）を使用して、顕微鏡スライド（ 図1C）。 注：注射は生殖系列の始点となる後極で行われているように、すべて同じ向きで胚を合わせます。後極は卵門領域に対向します。 </li><li>油は（1.3を参照）中国のマーカーの境界線上にこぼれないことを確認してクロロトリフルオロエチレン油の層で胚をカバーしています。 注：油で胚をカバーする前に、更なるステップを行うことができる：胚は、その液体の含有量を減らすため、注入されたDNA溶液の侵入を容易にするために、数分間乾燥させることができます。これは、高い液体圧力の結果として、注射または注入溶液の過度の漏洩時​​の胚の破裂を回避するのに役立つことがあります。 </li></ol></li></ol> 3.胚のマイクロインジェクション<ol><li>マイクロピペットを用いてプラスミドDNAまたはdsRNA溶液（1-2μgの/μl）を用いて、針（1-2μl）を入力します。 </li><li&gt;が噴射時間（0.5秒）を制御するマイクロインジェクション装​​置に針を接続し、圧力（800ヘクトパスカル）と背圧（150ヘクトパスカル）。 </li><li>針（ 図1D）の動きを制御するためにマイクロマニピュレーターを使用して、実体顕微鏡下でマイクロインジェクションを実行します。スライドを移動するために顕微鏡ステージを使用してください。 <ol><li>スコープのステージ上にスライドを置きます。 </li><li>胚（ 図1E）の後極に針の先端を挿入します。 </li><li>ペダルとマイクロインジェクションシステムを作動させることによって溶液を注入します。注入された液体は、胚のわずかな動きで、その結果、内部圧力の増加を誘導します。 </li><li>ペダルを離すとすぐに、しかし優しく、胚から針を取り除きます。 </li><li>注射部位のほとんどの細胞質の漏れを確認します。 注：原因マイクロインジェクションプロにDNA / dsRNAは/ siRNAおよび死亡率の潜在的な致死効果とを区別するために、自身cedure、対照実験を実施しなければなりません。これらは、逆遺伝学実験の場合には、緩衝液のみの注入を含む、または、緑色蛍光タンパク質（GFP）の二本鎖RNA（dsRNA-GFP）、またはsiRNAの由来。 </li></ol></li><li>注射後25℃で胚をインキュベートします。 </li></ol> 4.注入後の手順<ol><li>注入の2日後、実体顕微鏡下で孵化した幼虫（ 図1F）のためのスライドを確認してください。幼虫は、油に移動するが、できるだけ早く幼虫食品に転送する必要があることができます。このため、スライドを数回日をご確認ください。 </li><li>細かい絵筆（000）を使用して、静かにニンジンベースの幼虫食品に孵化した幼虫を移します。各ペトリ皿当たり200幼虫の最大値まで転送します。 </li><li>湿度65％（25℃）で幼虫をインキュベートします。空気交換を損なう、蓋が皿に固執しないことを確認してください。 </li><li>蓋をペトリ皿にしてください幼虫への空気の流れがまだあるように、ほとんど閉じました。過度の乾燥を避けるために、必要に応じて、毎日の料理をチェックし、蒸発を補うために水を追加します。 </li><li>ネット蓋と蛹化を有利に働くふすまの層を含むことにより、閉じた透明容器にペトリ皿を置きます。ルーチン昆虫館飼育については、 第3齢幼虫の幼虫の食のうち、ジャンプとはふすまで蛹になります。 </li><li> （これは世代0、G0）で蛹を収集し、大人の飼育およびスクリーニングのための小さなケージに配置します。リア標準幼虫食品に子孫。 </li><li>注入された個人は、通常、キメラあるとして生殖形質転換実験の場合には、次の世代（G1）で可能な形質転換された個人のために確認してください。転位事象は、確かに、生殖細胞系または細胞体のいずれかを形成する胚の合胞体、核のいずれかに発生した可能性があります。 <ol><li>まもなく出現した後、CO 2を使用して、G1の個人を麻酔し、TRANSFをチェック落射蛍光実体顕微鏡下でのイベントをormation。緑色蛍光のために画面にEYFPフィルタ（。。;エム30分の535内線500/20）を使用しながら、; DsRedwideフィルタ（EMM 75分の605。。内線12分の546）を使用し、赤色蛍光の存在をスクリーニングするために、 。 </li><li>異性の野生型大人と小さなケージに変換された個人を置き、新しい、最初はヘテロ接合、歪みを発信。 </li></ol></li></ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

昆虫の胚中の核酸のマイクロインジェクションは、遺伝子機能の解析とバイオテクノロジーのアプリケーションの両方を容易に普遍的な技術です。 昆虫の種数の増加から、ゲノム配列の最近の刊行物は、まだ未知の機能の遺伝子の機能解析のためのツールのための緊急の必要性につながります。 RNA干渉は、分子機能49と胚のマイクロインジェクションを推測するために最も貴重な方法の一つであることが証明されたこれらの研究を容易にします。 プラスミドDNAの注入は、トランスポザーゼ媒介遺伝子挿入を用いて、昆虫のゲノムを変更するために使用することができ、より最近では、ゲノム編集ツール（ 例えば、TALEN、CRISPR / Cas9、HEGs）。これらの技術はすでに撲滅にまたは野生個体群の交換ワットの両方を目指し、害虫制御プログラムのために使用される可能性があり、複数の昆虫種の菌株の開発を可能にしています修正された生物学的機能を備えたi番目の昆虫。このプロトコルでは、我々は、プラスミドDNAまたはdsRNAのいずれかでチ...

地中海ミバエは（チチュウカイミバエ）Ceratitis capitataはコスモポリタン種広範囲に被害果物や栽培作物です。このような属BactroceraやAnastrephaに属するものなど、いくつかの害虫種を含み、ミバエ科のファミリーに属します。チチュウカイミバエは、このファミリーの最も研究の種であり、それは昆虫の侵略1の研究のためだけでなく、害虫管理戦略2を最適化するためだけでなく、モデルとなっています。 チチュウカイミバエは野生と栽培植物3,4の300以上の種を攻撃することができます多化の種です。損傷は大人と幼虫の両方によって引き起こされる：交配した雌は、微生物がそれらの商業的品質に影響を与えることができるように、産卵のために果物の表面に穴を開け、果肉上の幼虫フィード一方。 3幼虫期の後、幼虫は、ホストから出てくると土壌に蛹化。Ceratitiscapitataは、アフリカ、中東、西オーストラリア、中南米、欧州、米国5の領域を含む、ほぼ世界的な分布を表示します。 チチュウカイミバエ蔓延を制限するための最も一般的な戦略は、殺虫剤（ 例えば 、マラチオン、スピノサド）と環境に優しい滅菌昆虫技術（SIT）6の使用を伴います。後者のアプローチは、電離放射線への暴露により無菌に男性の数十万の野生への放出を伴います。野生のメスのような滅菌男性の交配は、最終的に根絶につながる、人口規模の縮小を引き起こし、ノー子孫になります。 SITは、世界中の複数のキャンペーンに有効であることが証明されたが、その主な欠点がリリースされる昆虫の何百万人を飼育し、殺菌の高コストが含まれます。放出された個人のマーキング中にフィールドに入力された野生昆虫から無菌区別する必要があります活動を監視し、それが現在の蛍光粉を使用して達成されます。これらの手順は、高価であり、望ましくない副作用7を持っています。 最適化するために、および/または、この害虫の制御のためのより効果的なアプローチを開発するためには、チチュウカイミバエ生物学と遺伝学は広く世界中で数多くの研究者によって検討されています。チチュウカイミバエゲノム配列8,9の利用可能性は、遺伝子機能に関する新たな調査を容易にするであろう。 RNA干渉は、そのような研究のための強力なツールであり、それは、dsRNA（二本鎖RNA）又はsiRNA（低分子干渉RNA）の微量注入を介して達成することができます。この技術は、Cでその性別決意分子カスケードを実証するために、例えば、使用されていますcapitataは部分的にしかショウジョウバエ 10とに対して保存されています。 C.許可チチュウカイミバエ胚を顕微注入するためのプロトコルの開発最初の非すべきcapitata-Drosophilidフライ種は遺伝的に改変されます。その卵は、 ショウジョウバエと同様であり、両方の形態および乾燥11への耐性の観点から、プレ胚盤葉の胚にプラスミドDNAを送達するためのプロトコルは、最初のDのために開発されたようにショウジョウバエ 12,13 最初にCでの使用に適合しましたcapitata。これらの最初の実験は、転移因子ミノス11に基づいて、チチュウカイミバエ生殖変換を可能にしました。その後、元のシステムは、他のトランスポゾンベースのアプローチを用いて、14変更されました。これは、鱗翅目Trichoplusianiの 15からのpiggyBacの場合です。プロトコルは、以来、さらに最適化されており、これは他の多くの双翅目22-31の他tephritid種16-21の変換とを可能にしました。人工欠陥transpo：すべてのこれらのシステムは、一般的なバイナリーベクター/ヘルパープラスミドの形質転換系の使用に依存します所望の遺伝子を含有する息子は、プラスミドDNAに組み込まとトランスポザーゼ酵素32を供給することにより、昆虫のゲノムに組み込まれています。トランスジェニックチチュウカイミバエ行数は、精度を高める可能性がある、致死性を誘発する条件優性致死遺伝子を有する株、株の雄のみの子孫を生成するため、追加の雌雄鑑別戦略を必要としない、蛍光精子で株を含む複数の機能で、生成されましたSITの監視段階33-37の。トランスジェニック生物の野生でのリリースのみ38,39蚊に対するパイロットテストで発生したが、少なくとも一つの会社は、フィールド40での使用のためのトランスジェニックチチュウカイミバエ株の数を評価しています。 胚のマイクロインジェクションは、（CRを、このような転写活性化因子のようなエフェクターヌクレアーゼ（TALENs）、クラスタ化された定期的interspaced短いパリンドロームリピートなどの新しいゲノム編集ツールの開発に有利に働くことができますISPR）/ CRISPR関連タンパク質小説進化論と発達研究を可能にするだけでなく、利用可能なバイオテクノロジーのツールボックスを展開します9ヌクレアーゼ（Cas9）とホーミングエンドヌクレアーゼ遺伝子（HEGs）、。ゲノム編集アプローチはすでに蚊41における遺伝子ドライブシステムの生成を可能にし、チチュウカイミバエへの転送が目前に迫っています。ここでは、上記のすべてのアプリケーションに有用であることができるチチュウカイミバエ胚に核酸を微量注入のための普遍的なプロトコルを記述します。

<table><tbody><tr><td>1 x 注入バッファー</td><td></td><td></td><td>0.1 mM リン酸バッファー pH 7.4, 5&nbsp;mM KCl</td></tr><tr><td>Construct Plasmid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Helper Plasmid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dsRNA</td><td></td><td></td><td>Phenol-Chloroform 精製</td></tr><tr><td>標準幼虫食品</td><td></td><td></td><td>1.5 L H2O, 100 ml HCl 1%, 5 g Broad-spectrum Antimicrobial Agent used in Pharmaceutical Products Dissolved in 50&nbsp;エタノールml、砂糖400g、脱塩ビール酵母175g、軟質小麦ふすま</td></tr><tr><td>ニンジン幼虫食品</td><td></td><td></td><td>2.5g寒天、安息香酸ナトリウム4g、4.5ml 37%HCl、酵母抽出物42g、にんじん粉末115g、2.86&nbsp;g広域スペクトル抗菌剤、水から1 L</td></tr><tr><td>の成人食用</td><td></td><td></td><td>酵母抽出物と砂糖(1:10)</td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z692247</td><td></td></tr><tr><td>注射針&nbsp;</td><td>エッペンドルフ</td><td>5242956000</td><td></td></tr><tr><td>マイクロローダー</td><td>エッペンドルフ</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>ダブルスライドテープ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman 黒丸紙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z695505</td><td></td></tr><tr><td>漂白</td><td></td><td></td>剤 <td>希釈石 1:2 使用前に</td></tr><tr><td>絵筆 (000)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>成重</td><td>MN-153</td><td></td></tr><tr><td>マイクロインジェクター</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td>フェムトジェット</td></tr><tr><td>アダルトケージ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>クロロトリフルオロエチレンオイル</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>H8898<</td><td></td></tr><tr><td>em>Ceratitis capitata</td><td></td><td></td><td>使用される株はISPRAです</td></tr></tbody></table>

世界的な農業害虫昆虫における胚のマイクロインジェクションを介して、核酸の送達、<em&gt;チチュウカイミバエ</em

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

地中海ミバエ（チチュウカイミバエ）Ceratitis capitata（ヴィーデマン）（双翅目：ミバエ科）は非常に高い農業関連性を持つ害虫種です。これは、その生殖行動に起因している：彼らはパルプに卵や孵化した幼虫のフィードを置くとき、女性は果物や野菜の外表面に損傷を与えます。ワイルドC. capitata集団は、伝統的に噴霧および/または環境に優しいアプローチは、最も成功したが、無菌昆虫技術（SIT）である殺虫剤を介して制御されています。 SITは交尾する能力を保持するが、肥沃な子孫を生成することができません男性の大量飼育、放射線ベースの殺菌・フィールドリリースに依存しています。出現およびバイオテクノロジーのツールのその後の急速な発展は、一緒にチチュウカイミバエゲノム配列の可用性と、大幅にこの種の生物学の我々の理解を後押ししています。これは、ゲノム操作のための新しい戦略の増殖を支持しているCAnは集団制御に適用します。 この文脈では、胚のマイクロインジェクションは、チチュウカイミバエ制御のためのツールボックスの拡大に二重の役割を果たしています。キー生物学的プロセスを調節する遺伝子の機能を妨害する能力は、確かに、チチュウカイミバエ侵襲性の根底にある分子機構の理解を拡張します。さらに、生殖系列形質転換を達成する能力は、新規SIT設定将来フィールドアプリケーションについて試験することができる複数のトランスジェニック株の産生を促進します。実際、遺伝子操作は、例えば、フィールド内の滅菌男性パフォーマンスを監視するために使用することができる望ましい特性を付与するために使用することができ、またはそれは、初期の生命段階の致死をもたらすことができます。ここでは、これらの二つの主要な目標を達成するためにチチュウカイミバエ胚に核酸を顕微注入するための方法を記載します。

ここでは、それぞれ、目的の遺伝子の機能解析に向け胚のマイクロインジェクションの二つのアプリケーション（ケース1）を報告し、およびトランスジェニック株の世代（ケース2）で。 胚へのdsRNAの送達は、遺伝子機能を解明します。 innexin-5遺伝子は、昆虫では、男性と女性の生殖腺43,47,48に特異的に発現しているギャップジャンクションをコードしています。近縁種のために利用可能な情報に基づいて、dsRNAを誘発性遺伝子サイレンシングは、チチュウカイミバエ雌と雄の生殖系列の切除をもたらすことが期待されていました。 2400胚の総数は548幼虫が孵化しと216大人が（未発表データ）生き残っているから、2μgの/μlのdsRNAの混合物、を注射しました。成人の約75％で、精巣および卵巣は下-de...

地中海のショウジョウバエ(メドフライ)Ceratitis capitata(双翅目:Tephritidae)は、世界的な農業害虫です。その生物学をより深く理解することは、メドバエの個体数を制御し、経済的影響を減らすための鍵です。胚マイクロインジェクションは、この種の生殖細胞系の形質転換と逆遺伝学研究の両方を可能にする基本的なツールです。

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

本手順の全般的な目的は、重要な農業害虫であるCeratitis capitataの胚に核酸を導入し、最終的にその防除のためのツールボックスを拡充することです。この手法は、生体内の遺伝子の機能的な解析だけでなく、トランスジェニック系統の作製にも役立ちます。この手法の主な利点は、目的の効果を得るために注入する核酸量が極めて少量で済むことです。ミバエコロニーのすべてのライフステージを、温度25°C、湿度65%、明期と暗期がそれぞれ12時間の光周期（明期開始は午前8時）で維持します。ケージ底部の小さな開口部からスポンジストリップを挿入し、毛細管現象によってハエに水分を供給します。6Lのケージを用意し、1つのケージに1,500から2,000匹の蛹を導入します。餌として、酵母と砂糖を1:10の割合で混合したものを約45g、ケージに入れてください。卵を回収するには、ケージの下に水を満たしたプレートを設置します。雌がメッシュを通して産卵し、卵が水の中に回収されます。未交尾の雌が未受精卵を産む可能性があるため、卵を採取する前に、ハエが少なくとも1週間になるまで待ち、すべての卵が受精していることを確認してください。卵を採取するには、細かいストレーナーで水をろ過します。次に、パステールピペットを使用して、約0.5リットルの標準幼虫餌を入れたプラスチックボックスに卵を移します。産卵数が不十分な場合は、成虫の餌に含まれる酵母の含有量を最大25%まで増やしてください。各ボックスを、蛹化を促進させるためにふすまの層を敷いた透明な容器に入れます。空気循環を確保するため、容器にネット付きの蓋をしてください。約10日後、蛹化のためにふすま層に落下した3齢幼虫がいるかを確認します。蛹が見つかったら、その後数日間にわたって蛹の有無を確認する準備をしてください。蛹を回収するには、柔らかいブラシを使用して容器から掃き出します。まず、蛹を小さなカップに回収してください。採取が完了後、蛹を新しい成虫用ケージに移動させます。成虫は約10日後に羽化します。マイクロインジェクションに向けて、あらかじめスライドを準備しておいてください。2 cmの両面テープをスライドグラスに貼り付け、チャイナマーカーで端をマークして、胚の保湿を維持するためのオイル層の壁を作ります。産卵直後の胚を回収するために、若い受精済みの雌を新しいトレイに30分間置いて産卵させ、その後、胚を回収します。胚から卵膜を除去するには、ストレーナーに入れた卵を市販の50% bleach溶液に5秒間浸します。胚を漂白しすぎないことが極めて重要です。漂白した胚を、ストレーナーを清潔な超純水に慎重に浸して直ちに洗浄してください。この操作を少なくとも4回繰り返します。その後、ストレーナーを純水に浸した状態で保持し、2時間以内に胚を注入します。次に、細い筆を使用して約50個の胚を回収し、水に浸した黒色のろ紙ディスク上に配置します。解剖用実体顕微鏡下で、胚を準備した顕微鏡スライドの両面テープの上に並べます。すべての胚を同じ方向に向けます。絵筆で胚膜を突き刺すと、胚の生存率を下げる損傷を与える可能性があるため、慎重に操作することが重要です。次に、胚をクロロトリフルオロエチレンオイルの層で覆います。オイルはチャイナマーカーで描いた境界線の中に留めてください。境界線から溢れないようにしてください。マイクロピペットを使用して、1 µLあたり1〜2 µg濃度の核酸溶液を数 µL、注入針に充填します。次に、針をマイクロインジェクション装置に接続し、背圧150 hPaで800 hPaの圧力を0.5秒間印加するように設定します。注入はフットペダルスイッチで行い、マイクロマニピュレーターで針を操作しながら、ステージコントローラーでスライドを移動させます。注入量（ボルス）が適切に排出されていることを確認し、針を列の1番目の胚の後極に合わせます。ステージを移動させて、胚に針を刺し、核酸の液滴を注入します。注入された液体によって内部圧力が高まり、胚がわずかに動きます。ペダルを離し、すぐに、かつ慎重に、胚から針を抜いてください。注入部位から少量の細胞質が漏れ出しますが、これは正常な現象です。注入によって胚が破裂する場合は、オイルで覆う前に数分間胚を乾燥させてください。注入後、スライドをペトリ皿に移します。皿の蓋にフィルターペーパーのディスクを配置してください。フィルターを水で湿らせ、パラフィンフィルムでペトリ皿を密閉します。チャンバーを 25 °C でインキュベートします。注入の2日後、1日の中で数回、スライドを観察して幼虫が孵化したか確認してください。オイル中に幼虫が見られたら、細い絵筆を使用して、ニンジンベースの幼虫飼育餌を入れたペトリ皿に幼虫を移します。各ディッシュに最大200匹の幼虫を入れます。幼虫は油の中で長く生存できないため、頻繁に確認してください。幼虫に空気の流れが届くよう、蓋をほぼ閉じた状態で幼虫をインキュベートします。毎日ディッシュを確認し、1週間後に、ディッシュをふすまの入った容器に入れて幼虫を回収する準備をします。蛹を回収し、その後間もなく羽化することを想定してください。その後、羽化した成虫を二酸化炭素で麻酔し、形質転換を確認します。スクリーニングを行う際、その動員方法は極めて重要になります。ミバエの成虫は氷またはCO2を用いて麻酔をかけることができますが、長時間にわたる曝露は生存率を低下させる可能性があります。DS red ワイドフィルターを用いて、赤色蛍光の有無を確認してください。または、EYFPフィルターを用いて緑色蛍光を確認します。形質転換個体を、対立する性の野生型成体と共に小型ケージに移し、ヘテロ接合体系統を確立させます。ある実験では、inx5遺伝子の発現をサイレンシングするために、ダブルストランドRNAが使用されました。未注入の対照群の成体生殖細胞系は、予想通り正常であると考えられますが、処置を施した個体では精巣と卵巣の発育不全が認められました。雌雄両個体のアブドメンにおけるinx5転写産物の量を定量化したところ、対照群と比較して同遺伝子の発現が有意に低いことが確認されました。2つ目の実験では、異なる蛍光マーカーを発現させるためにbeta-2 tubulinプロモーターを用いて、精子を標識した2つの系統を作製しました。形質転換オスでは、体および精巣に明確な蛍光パターンが認められました。本ビデオでは、ミバエ胚の飼育および核酸の微量注入に最適化したプロトコルを紹介します。この手法を習得すれば、8時間の勤務時間で最大1,000個の胚に注入することが可能です。この手順に従い、thy-lino-crisp-erやcas-min-eta-geno-meta-tineなどの他の金属を用いた手法を実施することで、次世代のミズアブ系統を開発することが可能です。

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

キョウソヤドリコバチ胚のマイクロインジェクションは、ゲノムの遺伝の変更を生成するため不可欠な方法です。マイクロインジェクションと大幅にこの生物の将来ゲノム操作を容易にするキョウソヤドリコバチ胚移植の手順の詳細については、ここで説明しました。...

胚のインジェクションと移植キョウソヤドリコバチゲノム操作手法

この記事では、RNA 干渉 (RNAi) 昆虫を摂食する師管液中の植物の維管束組織を通して二本鎖 RNA (dsRNA)...

篩部と半翅目昆虫の植物 sap 供給の RNA 干渉を誘発する二本鎖 RNA の経口配信方法

ここで rootworm 胚生殖細胞変換や CRISPR/Cas9-ゲノム編集など機能ゲノム試金の実行の目的のため収集、マイクロインジェクション precellular...

マイクロインジェクション ウエスタン トウモロコシ Rootworm、 Diabrotica virgifera virgifera胚の生殖細胞への変換、または CRISPR/Cas9 ゲノム編集

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このプロトコルは、CRISPR/Cas9遺伝子編集ツールで動作するように最適化された Culex quinquefasciatus...

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我々は、卵の飼育、マイクロインジェクション、およびゲノム編集後に変異株を生成し維持するために、ファイヤーブラット サーモビア家電...

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ここでは、CRISPR/Cas9ゲノム編集によって作成された Helicoverpa armigera...

CRISPR/Cas9ゲノム編集 ヘリコベルパ・アルミゲラ (Hübner)の胚マイクロインジェクションとノックアウト変異体の同定

ここには、CRISPR/Cas9ベースのゲノム編集を介してゲノムを改変する目的で、または生殖系列形質転換を介して顕著な転移性要素を追加する目的で、前細胞トウモロコシウンカ胚を収集してマイクロ注入するためのプロトコルがあります。...

トウモロコシウンカ、 ペレグリヌスマイディス、CRISPR/Cas9ゲノム編集のための胚のマイクロインジェクション

蚊のゲノムに外因性遺伝子を導入するには、マイクロインジェクション技術が不可欠です。このプロトコルは、変換された蚊を生成するために アノフェレスガンビア 胚にDNA構築物をマイクロ注入するためにジェームズ研究所によって使用される方法を説明します。...

アノフェレスガンビア胚の微小注入法

昆虫病原性線虫は細菌と共生して生きており、一緒になって自然免疫系を損なうことによって昆虫に感染することに成功しています。線虫感染の遺伝的基盤に関する研究を促進するために、昆虫病原性線虫を維持し、遺伝的に操作する方法が記載されている。...

昆虫病原性線虫の培養と遺伝子操作

学ぶ地中海実蠅Ceratitis capitataの胚マイクロインジェクションによる核酸送達法。低用量の核酸注入で遺伝子機能解析とトランスジェニック系統作出を実現し、農業害虫防除のための遺伝学的ツールを拡張する。

世界的な農業害虫昆虫における胚のマイクロインジェクションを介して、核酸の送達、

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