作成および糖尿病創傷治癒モデルにおける脂肪由来幹細胞 (ASC) シートの移植
2017年8月4日
脂肪由来幹細胞 (Asc) は簡単に隔離され、正常ラットの脂肪から採取しました。ASC のシーツは、細胞シート工学を使用して作成することができます、ザッカー出展全層脂肪の糖尿病のラット皮膚の露出した骨の欠陥と人工皮膚の層で覆われてに移植することができます。
この手順の全体的な目標は、糖尿病ラットの大きな全層皮膚欠損の創傷治癒に対する脂肪由来幹細胞シートと人工皮膚の組み合わせの効果を検証することです。この方法は、骨が露出した糖尿病性大創傷など、慢性創傷の治癒に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、細胞シート技術を使用して細胞を固体シートで傷口に移植し、その結果、生存可能で安定した移植が得られることです。
脂肪パッドドナーの場合、8〜33週齢のルイスラットを使用することを計画してください。手術部位では、いくつかの滅菌綿先端アプリケーター、ガーゼ、メス、ニードルホルダー、手術ハサミ、鉗子、5-0ナイロン縫合糸を準備します。一時的なティッシュを配置するには、100ミリリットルのペトリ皿に10ミリリットルのPBSをロードします。
PBSをロードした皿の重量を量り、後で採取した組織の質量を見つけます。ラットに麻酔をかけた後、滅菌ドレープの上に仰向けに置きます。次に、手術領域を剃り、70%エタノールのいくつかの交互のスクラブを使用して露出した皮膚をこすります。.
次に、外側の下腹部に3センチの皮膚切開を行います。次に、外側の斜筋を露出させて解剖します。次に、精巣上体を取り巻く精巣上体脂肪組織を露出させます。
次に、精巣上体脂肪組織を慎重に切除します。精巣上体、精巣、精巣上体血管の損傷を避けてください。ティッシュをPBSの皿に移します。
次に、ドナーラットを閉じ、標準的な術後ケアの実践に従います。採取した脂肪組織の2〜3グラムからASCを分離します。0.1%A型コラゲナーゼで組織を1時間消化し、間質血管画分(SVF)を取得します。
SVFを精製した後、SVFを20ミリリットルの培地に懸濁します。懸濁液を60平方センチメートルの培養皿2つに分割し、標準条件下で24時間培養します。翌日、プレートをPBSで3回洗浄して、付着していない細胞や破片を取り除きます。
最終洗浄後、新鮮な完全なメディウムを再度追加します。次に、培養3日目に細胞がほぼサブコンフルエントになるまで、細胞を継代し続けます。次に、1ミリリットルの0.25%トリプシンEDTAを短時間のインキュベーションで使用します。
プレートからセルを取り除きます。細胞を活性トリプシンに10分以上さらさないでください。細胞を観察して数えた後、1平方センチメートルあたり1, 700の密度でそれらを継代培養します。
その後、3日ごとに細胞を通過させ、3つの継代を完了してから続行します。3回目に継代培養されたラットASCを渡した後、直径35ミリメートルの温度応答性培養皿に150,000個の細胞をプレートし、2ミリリットルの培地を調製します。インキュベーターで3日間培養し、均一な細胞シートを作ります。
3日後、培地を変更し、AAのミリリットルあたり16.4マイクログラムを追加します。次に、AA培地を隔日で交換しながら細胞を培養します。AA含有培地で4〜5日後、ASCの増殖を確認します。セルと隣接するセルシートとの間に隙間がないか探します。
連続したセルシートが確立されると、そのセルをモデルに使用できます。必要に応じて、プレートを室温で15〜20分間置いて、細胞シートを回収します。プレートは温度に敏感であるため、細胞は連続したシートとして自然に剥離し、シートは鉗子で除去できます。
肥満創傷治癒モデルには、体重 500 グラムから 600 グラムの 16 週齢から 18 週齢の成体オスの ZDF ラットを使用します。ラットを手術野に配置して麻酔し、頭を剃る前に、70%エタノールを使用して洗浄します。次に、手術領域を剃り、70%エタノールを交互にスクラブして露出した皮膚をきれいにします。
この頃、脂肪幹細胞の温度感温板をベンチに移します。細胞シートがプレートから剥がれる前に、培地を取り出し、細胞シートをPBSで3回洗浄します。細胞シートを採取した後、必要になるまでPBSに浸します。
細胞の準備ができたら、ラットの頭に15 x 10 mmの全層皮膚欠損を作成します。まず、皮膚組織を骨膜まで取り除きます。次に、メスと手術用ハサミで皮膚組織を切除します。
欠陥を完成させるには、骨膜ラスパトリーで骨膜を切除します。次に、セルシートを欠陥の上に置きます。幹細胞シートは柔らかく、しなやかです。
鉗子を使用して、欠陥の隅々まで伸ばします。次に、使用直前に生理食塩水に浸した10×15mmの人工皮膚のパッチで細胞シートと欠損部を覆い、5-0ナイロン縫合糸を使用して約10針で傷口を閉じます。傷を保護するために、5-0ナイロン縫合糸を使用して、人工皮膚の上に15 x 20ミリメートルの非粘着性包帯のパッチを固定します。
ラットは常にそれを取り除き、必要に応じてすぐにドレッシングを交換するため、ドレッシングを隔日で観察することを計画してください。6匹のZucker糖尿病性脂肪ラットの2つのグループで、記載されたプロトコルを使用して頭蓋骨の欠陥を作成しました。実験ラットはラット脂肪幹細胞シートで治療され、コントロールは治療されませんでした。
14日後、治療群の創傷は対照群の創傷よりも有意に小さかった。このビデオを見た後、ラットの骨が露出した大きな傷を作り、その傷を脂肪由来の幹細胞で治療する方法をよく理解しているはずです。この手順を試みる際は、温度応答性培養皿を使用するプロセス全体で厳格な温度管理を行うようにしてください。
そうしないと、細胞が皿から自然に分離し、実験が遅れる可能性があります。
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概要
本研究では、糖尿病ラットの創傷治癒における、人工皮膚と組み合わせた脂肪由来幹細胞（ASC）シートの使用について検討します。本手法は、特に全層皮膚欠損や骨露出を伴う症例における、慢性創傷治癒の課題に対処することを目的としています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 幹細胞治療
- 創傷治癒
- 糖尿病研究
背景
- 脂肪由来幹細胞は、正常なラットから容易に採取することができる。
- 細胞シート工学を用いることで、ASCシートを作製することが可能である。
- 糖尿病ラットでは、治癒しにくい慢性創傷がしばしば認められる。
- ASCシートと人工皮膚を組み合わせることで、治癒結果が向上する可能性がある。
研究目的
- ASCシートの創傷治癒促進における有効性を評価すること。
- 広範な皮膚欠損の治療に対する本手法の可能性を検討すること。
- 糖尿病条件下における慢性創傷治癒メカニズムに関する知見を提供すること。
使用された手法
- 正常ラットからのASCの分離および採取。
- 細胞シート工学技術を用いたASCシートの作製。
- Zucker糖尿病肥満ラットへのASCシートの移植。
- 移植部位への人工皮膚2層の適用。
主要な結果
- 移植用のASCシートの作製に成功した。
- ASCシートを用いて、糖尿病ラットにおいて創傷治癒の改善が観察された。
- 細胞シート技術を用いることで、安定した生存可能な移植を実現した。
- 本手法が慢性創傷に効果的に対処できる可能性が示された。
結論
- 人工皮膚と組み合わせたASCシートは、創傷治癒に有望であることが示されています。
- この技術は、糖尿病患者の慢性創傷に対する実行可能な解決策となる可能性があります。
- 関与するメカニズムの解明および最適化には、さらなる研究が必要です。
よくある質問
産業界における重要性
糖尿病における慢性創傷の治癒は、重要なトランスレーショナルな課題となっており、スケールアップが可能で生物学的に妥当な介入策への切実なニーズが高まっています。人工皮膚と組み合わせた脂肪由来幹細胞（ASC）シートの作製および移植は、疾患に関連した前臨床モデルにおいて再生戦略を評価するためのプラットフォームを提供します。このアプローチは、初期段階の治療仮説検証における予測的な信頼性を高め、組織修復不全を標的とした細胞療法の、リスク調整に基づいた開発推進の意思決定に寄与します。
バイオ製薬R&Dにおける戦略的活用
初期探索およびターゲット検証
- 糖尿病性創傷治癒の文脈における再生メカニズムの解析を可能にする。
- in vivoにおけるASC介在性の組織修復の機能的検証をサポートする。
- 細胞ベースの治療仮説に関する生物学的リスク低減を促進する。
- 幹細胞のソースおよび投与形態の比較評価のためのプラットフォームを提供する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 後続の有効性研究に向けた、再現性と定量性のある創傷モデルを確立します。
- ASCシートの調製および移植プロトコルの標準化を可能にします。
- 候補物質の評価のための、定量的な創傷閉鎖指標の算出をサポートします。
- 再生化合物や細胞改変のスクリーニングに向けた、アッセイの準備を容易にします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 糖尿病性創傷治癒および組織再生に関する疾患関連モデルと整合しています。
- 細胞ベースの介入策について、発見から前臨床検証までの継続的なフローを提供します。
- 機能的な組織修復結果に基づいた、リスク調整済みのゴー/ノーゴー判断を可能にします。
- 再生医療におけるポートフォリオの優先順位付けに向けた、メカニズム的なリスク低減を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、発見から前臨床に至る連続的なプロセスに組み込まれており、糖尿病性創傷治癒における初期の再生仮説の検証と、トランスレーショナルモデルによる妥当性確認を橋渡しするものです。
- 探索生物学：損傷した治癒環境におけるASC介在性修復の仮説駆動型評価をサポートします。
- スクリーニング：候補物質の評価に向けた、標準化され再現性のある創傷モデルと定量的な閉鎖指標を提供します。
- 分析：創傷面積の減少の測定および治療群間の比較分析を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：糖尿病や慢性創傷の適応に関連する前臨床疾患モデルと整合しています。
- エンタープライズでの再利用：多様な細胞源、投与方法、または補助療法の試験に利用可能な再利用可能なプラットフォームを提供します。
運用および組織への影響
- 科学的価値： 再生医療プログラムにおける予測の信頼性を高め、メカニズム上の曖昧さを低減します。
- 運用的価値： ASCシートの作製および移植を標準化し、再現性のある結果を実現します。
- 戦略的価値： 細胞ベースの創傷治癒療法のgo/no-go判断および資本配分に根拠を与えます。
- ポートフォリオへの影響： 慢性創傷を標的とした再生医療候補物質の、リスク調整後の優先順位付けを可能にします。
実施上の検討事項
- 幹細胞の分離、シートエンジニアリング、および外科的移植に関する専門知識が必要です。
- 温度応答性培養容器および動物外科インフラへのアクセスが不可欠です。
- 細胞シートの作製および創傷評価プロトコルのチーム間での標準化が必要です。
- 使用する動物モデルや創傷の種類に応じて、調整が必要な場合があります。
- ASCシートは乾燥に弱いため、人工皮膚で被覆し、湿潤環境を維持する必要があります。
