Name: 効力決意アッセイにおけるペプチドアゴニストの連続希釈のために調剤自動アコースティック (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: 学ぶ ペプチドアゴニストの連続希釈における自動アコースティック調剤法。プラスチック製器具へのペプチド吸着を最小化し、創薬における効力決定の精度とデータ再現性を向上させる技術です。

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1.ペプチドシリアル希釈<ol><li>アッセイ緩​​衝液を調製する：ハンクスを、25mM HEPES、0.1％BSAおよび0.5mMの3-イソブチル-1-メチルキサンチン（IBMX）、pH7.4で補充塩溶液（HBSS）を緩衝。 </li><li>系統的5 384ウェル低容量アッセイプレートの各ウェルにアッセイ緩​​衝液5μlを追加するために、バルク試薬ディスペンサーを使用してください。 <ol><li>製造元の指示に従って、384ウェルプレートの各ウェルに5μlのボリューム追加のためのディスペンシング・プログラムを作成するために、内部ソフトウェアを使用してください。 </li><li>アッセイ緩​​衝液およびプライム流体中の分注カセットチューブを浸し。 </li><li>プレートキャリア上の384ウェル低容量アッセイプレートを置きます。 </li><li>押してスタート。 </li></ol></li><li> 100Xペプチドストックを生成するためにアッセイバッファーに関係なく、ストレージ車両の、全てのペプチド試料を希釈します。 注：スクリーニングを必要とするペプチドは、例えば、DMSO W（適切とみなされるようにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）またはジメチルスルホキシド（DMSO）に設けられていてもよいです病気）などのPEG化などの二次修飾を有するペプチドに有害な影響を持っています。 </li><li>音響的に修飾された384ウェルポリプロピレンマイクロプレートの列1-5に25μlの100倍のペプチドストックを分注します。このプレートは、「ソースプレートのA &#39;に指定されています。そのソースプレートではなく、先のプレートを確認し、平底やアコースティック楽器のメーカーによって定義された特定の音響公差に適合しています。 </li><li>井戸A23に25μlの100倍の基準制御を分配し、ソースプレートAのA24 </li><li>ソースプレートAの列21-22に列11-15と30μlのアッセイ緩​​衝液10μlのアッセイ緩​​衝液を分注します</li><li>列6-10と列に第二の音響的修飾384ウェルポリプロピレンマイクロプレートの16-20を10μlのアッセイ緩​​衝液を分注します。このプレートは、「ソース板B &#39;と指定されています。 </li><li> 1分間300×gで遠心ソース板AとB。適切なバランスプレートが含まれます。 </li><li>音響fluiを使用してくださいソースAの列1から100倍のペプチド株式の100中間希釈液（アッセイ緩​​衝液中）：3つの連続した1を準備する自動ロボットシステムに統合Dディスペンサー 注：プログラミングは、ソースAとソースB（プレートレイアウトについては、 図1を参照）との間に3音響転送を可能にするために、プレートの再フォーマットおよび（音響流体ディスペンサーの製造業者によって提供されるような）用量反応ソフトウェアが必要です。具体的には1.9の詳細自動ロボット制御の下で、この研究室で使用される流体ディスペンサの使用をステップ（ 材料表参照）。 <ol><li>ロボットの板ホテルセクションにロード・ソース・プレートとアッセイプレート。 </li><li>オープン自動ロボットソフトウェアとロードプレート再フォーマットおよび用量反応プログラムの拡張プロトコル。 「ファイル名を指定して実行]をクリックします。 注：自動化は、ソースプレートBの列6-10にソースプレートAの列1-5から250 NLを転送するために音響流体ディスペンサを指示し、第二acousti混合する15μlのアッセイ緩​​衝液でバックフィルするために、より大きな流体体積を扱うことができるC流体ディスペンサ。自動化は、その後、（適切なバランスプレートは、すべての遠心操作のために含まれている）1分間300×gで統合された遠心分離し、遠心分離機にソースプレートBを転送します。ソース板Bは、ソースプレートAの11-15列にソースプレートBの列6-10から250ナノリットルの転送のために音響流体ディスペンサに戻り、混合するために15μlのアッセイ緩​​衝液でバックフィルされます。 1分間300×gで統合された遠心分離し、遠心分離器にオートメーション転送元板A。ソースプレートAは、ソースプレートBの列16-20にソースプレートAの列11-15から250 NLの転送のための音響流体ディスペンサに戻り、混合するために15μlのアッセイ緩​​衝液でバックフィルされます。オートメーションは、その後、1分間300×gで統合された遠心分離し、遠心分離機にソースプレートBを転送します。 注：最後に、用量応答プロトコルは、転送する音響分配を指示します（ソース板Aとソース板Bの両方で）4段階希釈したソースプレートのウェルのそれぞれから必要量をアッセイプレート中で二重に完全な11点曲線を構築するために（上記ステップ1.2で5μlのアッセイ緩​​衝液で予め充填されました）。オートメーション転送1分間300×gで統合された遠心分離し、遠心分離器にアッセイプレート。 </li></ol></li></ol> 2.細胞調製<ol><li> 20mLのアッセイ緩​​衝液中で37ºC水浴再懸濁急速にターゲットマウスGLP-1受容体を発現融解凍結保存チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞です。 </li><li>室温（RT）で200×gで5分間遠心細胞懸濁液。適切なバランスを含めます。 </li><li>上清を捨て、10ミリリットルのアッセイ緩​​衝液中で細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>トリパンブルーで1および自動細胞カウンターを用いて生存細胞密度を決定：細胞ストックを1に希釈します。 WELあたり8000細胞に（等価1mlあたり1.6×10 6細胞でアッセイ緩衝液中で細胞を再懸濁しアッセイプレートのL）。 </li><li> （5μlのアッセイ緩​​衝液中で連続希釈したペプチドを含む）をアッセイプレートの各ウェルに細胞懸濁液を5μlを添加し、室温で30分間インキュベートし、バルク試薬ディスペンサーを使用します。 </li></ol> 3. HTRFのcAMP検出アッセイ<ol><li>使用前に30分間室温にHTRF cAMPアッセイキットをもたらします。 </li><li> （cAMPの検出アッセイのメーカーが提供する独自の製剤）の溶解緩衝液で1：20希釈で個別に各HTRF試薬（クリプテートとd2）を準備します。 注：注意：溶解緩衝液は、毒性や催奇形物質13であるフッ化カリウム（KF）が含まれています。処分については、KFを含むアッセイプレートを密封し、焼却、および任意の液体廃棄物は、シンクの下、廃棄前に水で&lt;1ミリモル/ Lに希釈しなければならないしなければなりません。 </li><li>アッセイプレートのすべてのウェルに5μlのクリプテート試薬を追加するには、バルク試薬ディスペンサーを使用してください。 </li><li>コラムに5μlのd2の試薬を追加するには、バルク試薬ディスペンサーを使用しますnsのアッセイプレートの1月22日。 </li><li>すぐに手動で非特異的結合（NSB）対照ウェル、ウェルE23-P24にd2の試薬の5μLを与えるためにアッセイプレートのウェルA23-D24に5μlの溶解バッファーをピペット。 </li><li>井戸を混合し、室温で200×gで1分間のアッセイプレートを遠心します。 </li><li>蒸発および光退色を最小にし、1時間室温でインキュベートし、アッセイプレートを覆います。 </li><li> 620nmでプレートリーダーを用いて665 nmで320 nmで励起し、発光を用いた蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）シグナルを測定します。 </li></ol> 4.データ解析<ol><li>すべてのウェルからバックグラウンドを減算するNSBを意味使用してください。 </li><li>次のように665 nmの/ 620 nmの比から％デルタFを計算します。 レシオ=（665nm / 620nmの ）10 4を xは デルタF =（（サンプル比-レシオNSB）/比NSB）が ）×100 どこ比NSBはありませんd2の試薬と井戸を=。 </li><li> activat％を計算します次のように最大GLP-1リガンドで刺激非刺激細胞と細胞との間のイオン： ％活性化=（％デルタFsampleは - ％はDeltaFunstimulated細胞）/（％のDeltaFGLP-1刺激細胞 - ％DeltaF非刺激細胞）×100 </li><li>参照対照1によって定義される4パラメーターロジスティック分析により、濃度-反応曲線を分析し、％活性としてグラフ。 </li></ol>

<ol><li>Naylor, J., Rossi, A., Hornigold, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+Dispensing+Preserves+the+Potency+of+Therapeutic+Peptides+throughout+the+Entire+Drug+Discovery+Workflow%5BTitle%5D)+AND+%22J.Lab.Autom%22%5BJournal%5D)">Acoustic Dispensing Preserves the Potency of Therapeutic Peptides throughout the Entire Drug Discovery Workflow.</a> J.Lab.Autom. 21 (1), 90-96 (2016).</li>
<li>Campbell, J. E., Drucker, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacology%2C+physiology%2C+and+mechanisms+of+incretin+hormone+action%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.Metab%22%5BJournal%5D)">Pharmacology, physiology, and mechanisms of incretin hormone action.</a> Cell.Metab. 17 (6), 819-837 (2013).</li>
<li>Hui, H., Farilla, L., Merkel, P., Perfetti, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+short+half-life+of+glucagon-like+peptide-1+in+plasma+does+not+reflect+its+long-lasting+beneficial+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.J.Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The short half-life of glucagon-like peptide-1 in plasma does not reflect its long-lasting beneficial effects.</a> Eur.J.Endocrinol. 146 (6), 863-869 (2002).</li>
<li>Harris, D., Olechno, J., Datwani, S., Ellson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradient%2C+contact-free+volume+transfers+minimize+compound+loss+in+dose-response+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biomol.Screen%22%5BJournal%5D)">Gradient, contact-free volume transfers minimize compound loss in dose-response experiments.</a> J.Biomol.Screen. 15 (1), 86-94 (2010).</li>
<li>Ekins, S., Olechno, J., Williams, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispensing+Processes+Impact+Apparent+Biological+Activity+as+Determined+by+Computational+and+Statistical+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Dispensing Processes Impact Apparent Biological Activity as Determined by Computational and Statistical Analyses.</a> PLoS ONE. 8 (5), 62325(2013).</li>
<li>Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Tache, Y., Reeve, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+using+the+optimal+plasticware+and+glassware+in+studies+involving+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.Biochem%22%5BJournal%5D)">The importance of using the optimal plasticware and glassware in studies involving peptides.</a> Anal.Biochem. 414 (1), 38-46 (2011).</li>
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<li>Turmel, M., Itkin, Z., Liu, D., Nie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Innovative+Way+to+Create+Assay+Ready+Plates+for+Concentration+Response+Testing+Using+Acoustic+Technology%5BTitle%5D)+AND+%22J.Lab.Autom%22%5BJournal%5D)">An Innovative Way to Create Assay Ready Plates for Concentration Response Testing Using Acoustic Technology.</a> J.Lab.Autom. 15 (4), 297-305 (2010).</li>
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<li>Harris, D., Olechno, J., Datwani, S., Ellson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradient%2C+Contact-Free+Volume+Transfers+Minimize+Compound+Loss+in+Dose-Response+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Gradient, Contact-Free Volume Transfers Minimize Compound Loss in Dose-Response Experiments.</a> J.Biomol. Screen. 15 (1), 86-94 (2010).</li>
<li>Chan, G. K. Y., Wilson, S., Schmidt, S., Moffat, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlocking+the+potential+of+high-throughput+drug+combination+assays+using+acoustic+dispensing%5BTitle%5D)+AND+%22J.Lab.Autom%22%5BJournal%5D)">Unlocking the potential of high-throughput drug combination assays using acoustic dispensing.</a> J.Lab.Autom. 21 (1), 125-132 (2016).</li>
<li>Roberts, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+and+challenges+of+direct+acoustic+dosing+into+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.Lab.Autom%22%5BJournal%5D)">Implementation and challenges of direct acoustic dosing into cell-based assays.</a> J.Lab.Autom. 21 (1), 76-89 (2016).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

このプロトコルは、シリアルサンプルの1未満μLを必要とする3×10 6の濃度範囲にわたってペプチド試料を希釈するための自動化された音響ディスペンシングの成功のアプリケーションについて説明します。この方法の主な利点は、通常は、試薬移送および混合のために必要とされている（例えば、ピペットチップなど）、実験容器プラスチック容器への試料の還元暴露を介してプラスチック容器へのペプチドの吸着を最小化を介してデータの品質を向上させることです。音響、分配が完全にプラスチック製品の使用を排除していませんが、それはかなりそれを減らすん。また、チップベースのピペット操作の除去はまた、サンプルのキャリーオーバーを排除し、エラーが濃度-応答曲線14,15の信頼性と再現性の両方の準備を可能にし、全体の連続希釈全体に伝播されていません。 他のグループはDMSOに可溶化した試験化合物の直接音響伝達を報告しています時間16,17にわたってアッセイプレートとのインキュベーションの反転以外の不要混合工程との長期的なアッセイのための細胞（&gt; 48時間...

GLP-1Rは、2型糖尿病2の治療において確立された薬物標的です。この受容体に対する天然ペプチドアゴニストは、GLP-1は、2〜3分のインビボ半減期を有します。アデニリルシクラーゼの活性化に対する天然のGタンパク質結合を介して二次メッセンジャーcAMPの下流の製造におけるそのGタンパク質共役標的受容体の結果をGLP-1の結合。蓄積されたcAMPの測定は、受容体活性化を監視するため、好ましい物理化学的特性を有する活性GLP-1類似体をスクリーニングするための堅牢なアッセイを提供します。このようなアッセイは、濃度応答曲線を構築するために、試験試料の連続希釈を必要とし、ペプチドのサンプルを渡すときに、これは特に複雑です。チップベースのシリアル希釈調製物からの潜在的なエラーは、以前1,4,5に記載されています。ペプチドは、信頼性の低い効力の推定の結果、プラスチック容器に吸着します。ペプチドの損失は、Tを介して最小化することができます彼の緩衝液中のウシ血清アルブミン（BSA）を含めると、シリコン処理プラスチック製品の使用、まだタンパク質結合が予測できないまま。具体的には、実験的なコンテナにGLP-1の結合の変化が6に記載されています。実験室用プラスチック製品で使用されている安定剤のさらなる合併症が水性アッセイ緩衝液中に先端およびマイクロタイタープレートから浸出し、タンパク質機能7,8を妨害する可能性がある。したがって、プラスチック容器への曝露を低減するための方法は、測定の精度を高めるために必要です。 音響液体ディスペンサは、隣接するアッセイプレート9に正確なナノリットル液滴の吐出が得られ、流体試料の表面に高周波音響信号をフォーカス。音響放出の使用は、大規模な合成化合物ライブラリーの調製およびスクリーニングのための製薬業界の標準であり、技術は十分に小さいmoleculのために検証されていますエス10。我々の知る限り、我々は、組換えおよび合成ペプチドの製造のための音響分与を記述するための最初のグループであり、私たちは以前に、従来のチップベースの方法1に比べて改善された精度を報告しています。 この記事では、完全に自動化されたプレートハンドリングロボットシステムに非接触音響伝達によるペプチドシリアルおよび直接希釈液の準備の統合について説明します。サンプルの音響伝達を包含する多数の方法は、以前11に記載されています。我々は、中間ストック濃度を調製し、連続完全な用量反応曲線を生成するためのペプチド類似体を希釈するために、二段階法を利用します。準備されたペプチドは、ターゲットのマウスGLP-1Rを発現する細胞とインキュベートし、そして我々は、ペプチドアゴニストACTIVの読み出しとして、これらの細胞内cAMP蓄積を測定するための市販の均一時間分解蛍光（HTRF）アッセイを使用しています性。アッセイは、ハイスループット384ウェル形式に堅牢で適していると12を投影日常的アッセイ開発及び薬物スクリーニングの両方に適用されます。

<table><tbody><tr><td>ハンクスの平衡塩溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8264</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>3-イソブチル-1-メチルキサンチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7018</td> DMSO GLP-1 (7-36) amide Bachem H-6795 <td>の 0.5 M ストックとして調製</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>PBS中の1 mg/mLストックとして調製(「100倍リファレンスコントロール」</td></tr><tr><td>と呼ばれる)テストペプチド</td><td>MedImmune社で社内で製造</td><td>必要に応じてDMSOまたはPBSでさまざまな濃度で供給</td>100倍ペプチドストック MedImmune社で社内製造 ペプチドをアッセイバッファーに希釈して最終必要濃度の100倍に トリパンブルー溶液、0.4%サーモフィッシャーサイエンティフィック<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Cedex XS Cell Analyzer</td><td>Innovatis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning 384 well plates, Low volume</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4514</td><td></td></tr><tr><td>Echo Qualified 384-well Polypropylene Microplate</td><td>Labcyte Inc.</td> (英語)<td>P-05525</td><td></td></tr><tr><td>エコー認定貯水池</td><td>Labcyte(株)</td><td>ER-0055</td><td></td></tr><tr><td>エコー550 リキッドハンドラー</td><td>株式会社ラブサイト</td><td></td><td>液滴移動量は2.5nl刻み</td></tr><tr><td>Echo 525 Liquid Handler</td><td>Labcyte Inc.</td><td></td><td>液滴移動量は25 nl</td></tr><tr><td>ACell Benchtop Automation&nbsp;</td><td>HighRes Biosolutions</td><td>MC522</td><td></td></tr><tr><td>Cellario Lab Automation ライフサイエンスロボティクス用スケジューリングソフトウェア</td><td>HighRes Biosolutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MultidropCombi 試薬ディスペンサー</td><td>ThermFisher Scientific</td><td>5840300</td><td>「バルク試薬ディスペンサー」と呼ばれる</td></tr><tr><td>HTRF cAMP Dynamic 2 kit</td><td>Cisbio Bioassays</td><td>62AM4PEJ</td><td></td></tr><tr><td>EnVision Multilabel Reader</td><td>パーキンエルマー</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

効力決意アッセイにおけるペプチドアゴニストの連続希釈のために調剤自動アコースティック

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

小分子薬物の発見と同様に、ペプチドアゴニストのスクリーニングは、濃度 - 応答曲線を生成するために、ペプチドの連続希釈を必要とします。ペプチドをスクリーニングすることは、従来のチップベースのサンプル処理方法は、吸着を介してペプチド損失の増加の機会を提供し、プラスチック容器の大きな表面積にペプチドを露出させるように複雑さの付加的な層が得られます。プラスチック容器への過度の露出を防止するには、プラスチックへの付着を介してペプチドの損失を低減し、したがって効力予測において不正確さを最小限にし、我々は、以前にペプチドアゴニスト1のin vitroでのハイスループットスクリーニングのために分配する非接触音響の利点を記載しています。ここでは、マウスのグルカゴン様ペプチド1受容体（GLP-1R）にペプチドアゴニストのスクリーニングの例を利用してマイクロタイタープレート中のペプチドの連続希釈の非接触音響の調製のための完全に統合された自動化ソリューションを議論します。私たちの方法は、高を可能にアゴニストをスクリーニングするための細胞ベースのアッセイ-throughputおよび増加サンプルスループットをサポートするために、または（複数の標的細胞株のパネルのために、例えば 、）をアッセイプレートのコピー数の増加を可能にするために容易に拡張可能です。

<html>私たちは日常的に音響伝達を介してペプチドを希釈するために2段階の方法を使用します。最初のステップは、自動化と整合音響ディスペンサは、二つのソースプレート（図1A、B）にわたって4ストックペプチド中間希釈物を作成するために使用されます。第二段階のために、我々は、さらに、各試験ペプチド（ 図1c）のための11ポイントの濃度範囲を作成するには、ソースプレートAとBからの株式の希釈液を希釈するために音響ディスペンサーを使用しています。各ペプチド濃度範囲は、16の異なるペプチドは、384ウェルアッセイプレート（ 図1c）ごとにスクリーニングすることができるように、アッセイプレートを横切って左から右に、重複して焼成します。アッセイ緩衝液のバックフィルをアッセイプレート（ 図1D）の両端のウェル当たり一定量を確保するために行われます。参照ペプチド陽性対照はまた、最大有効濃度で先プレートに移します。 ...

従来のチップベースの段階希釈中にプラスチック製品へのペプチド吸着は、効力の決定に大きな影響を与え、創薬のリード同定およびリード最適化フェーズに使用される構造活性相関の理解を混乱させる可能性があります。ここでは、ペプチドサンプルの自動音響非接触段階希釈の方法について説明します。

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

ペプチドサンプルの連続希釈に関するこの自動化プロトコルの全体的な目的は、プラスチック器具へのペプチド吸着を最小限に抑え、創薬における正確な力価決定を可能にすることです。この手法により、データの品質と再現性を向上させることができ、さらにチップを用いたピペッティングを排除することでサンプルのキャリーオーバーを解消し、連続希釈全体にわたる誤差の蓄積を防ぐことができます。この技術の主な利点は、プラスチック器具へのペプチド吸着を最小限に抑えることで、データの品質を高められる点にあります。これは、創薬における構造活性相関の検討やリード化合物の同定キャンペーンを推進する上で特に重要です。テキストプロトコルに従ってアッセイバッファーを調製し、バルクディスペンサーの分注プログラムを作成した後、分注カセットのチューブをアッセイバッファーに浸し、液体でプライミングします。384ウェル低容量アッセイプレートをプレートキャリアに設置してください。次に、スタートボタンを押します。アコースティック分注に適した384ウェル平底ポリプロピレンマイクロプレート（ソースプレートAと定義）の1〜5列目に、100倍濃度のペプチドストックを25 µLずつ分注します。ウェルA23とA24に、100倍濃度のリファレンスコントロールを25 µLずつ分注します。続いて、11〜15列目にアッセイバッファーを10 µLずつ、21〜22列目にアッセイバッファーを30 µLずつ分注します。次に、ソースプレートBとして指定した2枚目の音響透過性384ウェルポリプロピレンマイクロプレートの6〜10列目および16〜20列目に、アッセイバッファーを10 µLずつ分注します。ソースプレートAとBを300 ×gで1分間遠心分離します。次に、ソースプレートとアッセイプレートをロボットシステムのプレートホテルセクションにロードします。次に、テキストプロトコルに従ってロボティクスソフトウェアを実行し、システムに組み込まれたアコースティック液体分注機を使用して、1/100の連続希釈を3段階で調製します。まず、ソースプレートAの1〜5列からソースプレートBの6〜10列へ分注します。最初の1/100希釈の調製後、オートメーションによりソースプレートBを組み込み遠心機に転送し、300 ×gで1分間遠心した後、プレートをアコースティック液体分注機に戻します。その後、2回目の1/100希釈のためにソースプレートBからソースプレートAへ溶液を転送し、オートメーションによってソースプレートAを遠心機に転送して遠心し、プレートを液体分注機に戻します。最後に、オートメーションによりプレートAからBへ、100倍希釈の3回目の溶液が分注された後、プレートBを再び遠心分離します。ソースプレートAおよびソースプレートBのこれらのペプチド希釈液を用いて、テキストプロトコルに記載されている通り、アッセイにおける完全な濃度反応曲線を作成します。比較対象となるチップベースの手法では、プラスチック器具へのペプチド吸着によりサンプルの力価が激しく低下するため、このステップは極めて重要です。標的となるマウスGLP1受容体を発現させた凍結保存CHO細胞を37 °Cのウォーターバスで急速解凍し、20 mLのアッセイバッファーを用いて再懸濁します。細胞懸濁液を室温、200 ×gで5分間遠心分離します。上清を捨て、10 mLのアッセイバッファーを用いて細胞ペレットを再懸濁します。Trypan Blueを用いて細胞ストックを1:1で希釈し、自動細胞計数機で生存細胞密度を測定します。次に、アッセイバッファーを用いて細胞を1.6 million cells/mLの濃度で再懸濁します。バルク試薬ディスペンサーを使用し、段階希釈したペプチドを含むアッセイプレートの各ウェルに細胞懸濁液を5 µLずつ添加し、室温で30分間インキュベートします。cyclic AMP検出アッセイを実施するために、ライシスバッファーを用いて、各同次時間分解蛍光（HTRF）試薬を20倍に希釈して調製します。バルク試薬ディスペンサーを使用して、アッセイプレートのすべてのウェルに5 µLのクリプテート試薬を加えます。次に、プレートの1列目から22列目まで5 µLのD2試薬を加えます。次に、D2試薬5 µLをウェルE23からP24に加えてください。直ちに手動ピペットを用いて、非特異的結合コントロールウェルとして使用するウェルA23からD24に溶解バッファー5 µLを加えます。アッセイプレートを200 ×g、室温で1分間遠心分離し、各ウェルを混合します。その後、プレートに蓋をし、1時間インキュベートします。インキュベート後、プレートリーダーを用いて、励起波長320 nanometers、蛍光波長620および665 nanometersでfret信号を測定します。テキストプロトコルに従ってデータを解析してください。cyclic AMP検出アッセイにおけるアコースティック転送の最初のステップは、ここに示すように、2枚のソースプレートにわたって4つのストックペプチド中間希釈液を作成することです。第2ステップでは、アコースティックディスペンサーを用いてソースプレートAおよびBからのストック溶液をさらに希釈し、16種類の異なるペプチドについて、各テストペプチドの11ポイントの濃度範囲をデュプリケートで作成します。アッセイプレート全体のウェルあたりの液量を一定にするため、アッセイバッファーによるバックフィルが行われます。ここでは、サイクリックAMP蓄積アッセイに供した16種類のペプチドを二連で配置した例を示すヒートマップを示します。紫色で示される低い値は、高いサイクリックAMP濃度を表しています。これらの濃度応答曲線は、二連測定点の再現性を示しています。サンプル1は、このアッセイにおけるポジティブコントロールを表します。サンプル2、3、および4は不活性であり、グラフ上の平坦な線で示されています。サンプル5から16は、活性を持つテストペプチドを表しています。ここで提示する手法により、広範な効力範囲にわたる完全な濃度反応曲線を生成することが可能です。習得すれば、この手法は3時間で完了できますが、これは調製が必要なサンプル数によって異なります。この手順を行う際は、ペプチドが生物学的試料であり、それに準じて取り扱う必要があることを忘れないでください。完全性を維持するため、凍結融解サイクルの繰り返しは避けてください。この手法は、ペプチド創薬分野の研究者に道を開き、構造活性相関を促進するために必要な正確な力価予測を可能にします。このビデオを視聴することで、ペプチドの連続希釈における自動音響ディスペンシングについて十分に理解でき、吸着によるペプチドの損失を最小限に抑え、測定精度を向上させることができます。ピコモル濃度の活性を持つ生物学的活性ペプチドを取り扱うことは非常に危険である可能性があるため、個人用保護具などの予防策を常に講じてください。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

安定同位体の標準と抗ペプチド抗体（SISCAPA）によって、それぞれのタンパク質の代用物としてのペプチドの定量的な測定を提供するために、安定同位体希釈質量分析法（MRM -...

質量分析法とあいまってペプチドイムノエンリッチメントを使用したタンパク質の定量化

アデニリルシクラーゼシグナル伝達の増感における抑制性Gタンパク質共役型の受容体の持続的活性化。本質的な分子経路を同定するために、偏りのないアプローチが必要であるが、この戦略は、スケーラブルな細胞ベースのcAMP増感アッセイの開発を必要とする。ここで、我々は、小分子およびsiRNAスクリーニングのために作アッセイを説明します。...

アデニリルシクラーゼの薬物誘発性感作：アッセイは、小分子およびsiRNAスクリーニング用途のために合理化·小型化

組換えヒトMHC II分子と生化学的アッセイは、免疫​​原性エピトープ同定、削除、または設計に迅速かつ定量的な洞察を提供することができます。ここで、384ウェルプレートにスケーリングペプチド-MHC II結合アッセイが記載されている。この費用対効果の高い形式は、タンパク質の脱免疫やワクチンの設計と開発の分野で有用であることを証明する必要があります。...

ペプチドエピトープの定量分析のための高スループット、MHC II結合アッセイ

私たちは、単純化された(アナログ)読み出しで核酸を定量するためのエンドポイントデジタルアッセイについて説明します。液滴ベースのデジタルアッセイのバルク蛍光は、特殊な装置ではなく標準的なqPCR装置を使用して測定し、顕微鏡で結果を確認します。...

デジタル核酸定量アッセイの簡単な一括読み出し

ペプチドおよびタンパク質定量を使用して自動免疫-MALDI (iMALDI)

合成やペプチド両親媒性分子ミセルの単球ターゲットの評価手法を提案し、生体適合性および単球にバインドするミセルの機能をテストするための試金の対応します。...

アテローム性動脈硬化のイメージングのためのペプチド両親媒性分子ミセルの単球ターゲットの合成

このプロトコルは、ラベルフリーインピーダンス測定を用いて単一の微小電極上で成長した単一の細胞層からのアゴニスト誘発GPCR活性化に関するフル用量応答関係のリアルタイム記録を示す。新しいドージング方式は、時間分解能を損なうことなくスループットを大幅に向上させます。...

ラベルフリーインピーダンスベースのGPCRアッセイにおけるスループット向上のためのステップワイズドージングプロトコル

このワークフローは、定量的なグローバルプロテオーム分析のために、複数のタンパク質翻訳後修飾(PTM)を同時に時間効率とコスト効率の高い濃縮のパフォーマンスを説明します。このプロトコルは、ペプチドレベルPTM濃縮を複数の結合抗体で利用し、続いてデータ非依存の獲得質量分析を行い、PTMクロストークに関する生物学的洞察を得る。...

定量化とサイトローカリゼーションのための2つの翻訳後修飾の同時アフィニティエンリッチメント

この研究では、組換えGタンパク質共役受容体(GPCR)上の低分子ライブラリをスクリーニングするための384ウェルプレートのハイスループット細胞内カルシウム蛍光アッセイについて説明します。標的は、牛熱ダニ由来のキニン受容体である リピケファルス・マイクロプラスが、...

組換えGタンパク質共役型受容体のハイスループットスクリーニングのための「二重付加」カルシウム蛍光アッセイ

ここでは、さまざまな細胞タイプの細胞表面プロテオームの特性評価のためのプロテオミクスワークフローについて説明します。このワークフローには、細胞表面タンパク質の濃縮、その後のサンプル調製、LC-MS/MSプラットフォームを使用した分析、および専用ソフトウェアによるデータ解析が含まれます。...

細胞表面プロテオームのラベルフリー定量のための「Cell Surface Capture」ワークフロー

学ぶ ペプチドアゴニストの連続希釈における自動アコースティック調剤法。プラスチック製器具へのペプチド吸着を最小化し、創薬における効力決定の精度とデータ再現性を向上させる技術です。

効力決意アッセイにおけるペプチドアゴニストの連続希釈のために調剤自動アコースティック

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