木部形成に関与する遺伝子およびプロモーターを研究するための誘導性体細胞セクター分析（ISSA）の使用とセカンダリステム開発

誘導体細胞セクター解析（Induced Somatic Sector Analysis）の全体的な目的は、樹木の二次茎組織における遺伝子およびプロモーター構築物の機能解析を、比較的短期間で中から高スループットに実施するための手法を提供することです。本手法は、遺伝子がいつ、どこで発現するか、および木材形成や二次茎の発達といった生物学的に重要なプロセスにおける役割に関する重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、効率的かつ簡便で、比較的迅速な手順であり、幅広い樹種に適用可能であることです。

まず、細菌選択に適した抗生物質を含む、28 °Cに温めた新鮮なLB培地19 mLを、清潔な50 mLスクリューキャップチューブに準備します。A.tumefaciens培養液を1 mL加え、600 nmにおける光学密度（OD）を確認します。ODが0.1を超える場合は、温かいLB培地でさらに希釈します。OD 600が0.4から0.6の間になるまで、A.tumefaciens培養液を振盪インキュベーターに入れて培養します。

これが完了したら、4°C、1,000 x gで15分間、細胞を遠心分離します。チューブから上清を除去し、直ちに1 mLの冷却したMS培地で細胞ペレットを再懸濁します。懸濁液を清潔な2 mLマイクロチューブに移し、使用時まで氷上で保存します。

実験は春または初夏に開始し、形成層が活性化し急速に成長している個体を選択してください。これは、篩部を木部から容易に剥離できることで確認できます。植物の基部付近で茎のまっすぐな部分を特定し、葉や枝を取り除いてください。

鋭利なメスを用いて、師部を貫通するように5 mm間隔で2本の平行な20 mmの切開を加え、さらに基端側で2本の垂直な切開を横切るように水平に1回切断することで、1平方センチメートルの形成層ウィンドウを作成します。師部のストリップを上方へ剥がし、発達中の道管組織を露出させます。その後、ピペットを使用して、露出した道管の表面が十分に濡れる量の接種培地を添加します。

すぐに篩部ストリップを茎に再挿入し、パラフィルムでしっかりと固定します。これらの接種手順を、目的のすべての遺伝子またはプロモーターに対して繰り返し、既存のウィンドウから上下に少なくとも1 cm離し、かつ90度の角度をずらして新しい形成層ウィンドウを作成します。さらに、実験的な接種と同様に、同じ茎または別の茎のウィンドウにポジティブコントロールおよびネガティブコントロールのベクターを接種します。

茎の成長を定期的に観察し、半径方向に少なくとも5 mmの成長が認められた時点で、組織を採取してβ-グルクロニダーゼ（GUS）アッセイに用いる。試験材料を採取するには、まず茎から形成層ウィンドウを切り出し、新成長部位以外の組織を除去する。成熟した木部および師部細胞または組織の形態に関する研究を行う場合は、木部から師部を剥離させる。

あるいは、形成層帯を維持する必要がある場合や、プロモーターの発現パターンを評価する必要がある場合は、カミソリを用いて形成層窓を横方向にスライスし、厚さ 0.5 から 1 mm のディスク状に切り出します。採取した形成層窓組織を個別の 14 mL 丸底チューブに入れ、pH 7 の 0.1 M リン酸緩衝液で、組織が完全に浸っていることを確認しながら、5 分間ずつ 2 回すすぎます。2 回目のすすぎが終わったら、余分な溶液を完全に取り除いてください。

次に、各チューブに5 mLのGUS試薬を加えます。組織サンプルが完全に浸っていない場合は、試薬を追加してください。チューブを暗所で55 °Cにて10分間インキュベートします。

その後、チューブをシェーカーに入れ、37 °Cの暗所で緩やかに撹拌しながら、さらに12～16時間インキュベートします。インキュベーターから取り出した後、チューブをランダムにいくつか選び、pH 0～7の範囲のリトマス試験紙を用いてGUS試薬のpHを確認します。pHが6未満のものが一つでもあれば、それらにラベルを付け、残りのチューブをすべて確認してください。

pHが6未満のチューブにラベルを貼り、除外します。チューブからGUS試薬を捨て、組織が浸るのに十分な量の70%エタノールを補充します。サンプルは必要になるまで4°Cで保存してください。

清潔なピンセットを用いて、サンプルチューブからすべての形成層ウィンドウ組織を取り出し、顕微鏡で観察するために小さなトレイまたはペトリ皿に置きます。1倍から4倍の倍率の解剖顕微鏡のレンズ下にサンプルを置き、鮮やかな青色に染色されている細胞または組織の数を特定し、集計します。師管が除去された例では、発達中の木部表面にある形成層組織内のセクター数を数えます。

ディスク状に切り出したサンプルの場合、異なる細胞または組織タイプに見られるセクターの数をカウントします。ディスクの両面を確認し、2つのディスクにまたがって存在するセクターを照合して、数が過大評価されないようにしてください。セクターを含む組織のみを70 %エタノールを含むチューブに戻し、必要になるまで保存します。

ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールを含め、採取した他のすべての形成層ウィンドウについて分析を繰り返します。セクターの分類および正確な同定を容易にするため、茎の傷に対する反応を含む、茎の二次的な解剖学的構造および発達について熟知しておくことを推奨します。この図は、青色に染色された領域として示されている、いくつかの成功した形質転換を示しています。

例として示されている師部皮剥ぎのウィンドウには、複数の形質転換セクターが表示されています。また、2種類の樹種から採取されたディスクでは、形質転換セクターとその後の放射状の成長が確認できます。さまざまな組織型における形質転換も観察可能です。ここでは、セイヨウハコヤナギの周皮、師部、傷害柔組織、およびその他のいくつかの組織領域において、茎のセクターが見て取れます。

この画像は、形成層誘導組織における遺伝子プロモーター発現の結果を示しています。この例では、ユーカリハイブリッドの茎に導入されたeucalyptus grandis由来のさまざまなCesAプロモーターを用いた試験において、各組織型における染色の割合を示しています。師管、発達中の木部および成熟した木部における発現は、パーセンテージで表示されています。

接種した形成層1cmあたりの平均形質転換イベント数についても、各プロモーターまたは目的遺伝子ごとに算出することが可能です。この表は、ディスク採取法を用いて解析し、ポジティブコントロールまたは目的のプロモーターで形質転換されたユーカリおよびポプラの検体において同定された代表的なセクターのデータを示しています。この手法を習得すれば、二次茎の発達における形成層分化と形成の複雑な性質を解析するための、迅速かつ効率的で汎用性の高い手法となります。

このビデオを視聴することで、植物と細菌の調製方法、形質転換の方法、茎の育成および回収方法、そして表現型評価のための形質転換組織の同定および分類方法について、十分に理解することができます。