Name: 木部形成に関与する遺伝子およびプロモーターを研究するための誘導性体細胞セクター分析（ISSA）の使用とセカンダリステム開発 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: 学ぶ誘導性体細胞セクター分析（ISSA）を用いた木部形成に関与する遺伝子およびプロモーターの機能解析法。A.tumefaciensを用いた二次茎組織の中高通量解析により、樹木の二次成長における遺伝子発現を効率的に研究できます。

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著者は、リンケージ助成金LP0776563（GB）AS）とLP0211919）、業界パートナーのSappi氏とMondi氏、オーストラリア研究評議会からのオーストラリア大学院賞（EM）、オーストラリア農務省（LT）によるヤング・イノベーター&サイエンティスト賞）を通じて、この研究の側面に対する資金提供に感謝したいと思います。また、このプロトコルの開発中に多くの議論とアイデアを出してくださったZander Myburg氏、Qing Wang氏、Colleen MacMillan氏、Simon Southerton氏、そして研究室関連の作業を支援してくださったMartin Ranik氏、Minique De Castro氏、Julio Najera氏、Valerie Frassiant氏、Angelique Manuel氏、Noemie Defaix氏にも感謝します。

<ol><li>Spokevicius, A. V., Tibbits, J. F. G., Bossinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+plant+and+plant+part+transgenic+approaches+in+the+study+of+wood+formation+-+benefits+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22TPJ%22%5BJournal%5D)">Whole plant and plant part transgenic approaches in the study of wood formation - benefits and limitations.</a> TPJ. 1 (1), 49-59 (2007).</li>
<li>Chaffey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wood+formation+in+forest+trees%3A+from+Arabidopsis+to+Zinnia%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Wood formation in forest trees: from Arabidopsis to Zinnia.</a> Trends Plant Sci. 4 (6), 203-204 (1999).</li>
<li>Moller, R., McDonald, A. G., Walter, C., Harris, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+differentiation%2C+secondary+cell-wall+formation+and+transformation+of+callus+tissue+of+Pinus+radiata+D.+Don%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Cell differentiation, secondary cell-wall formation and transformation of callus tissue of Pinus radiata D. Don.</a> Planta. 217 (5), 736-747 (2003).</li>
<li>Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Leitch, M. M., Bossinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+in+vitro+transformation+of+wood-producing+stem+segments+in+eucalypts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated in vitro transformation of wood-producing stem segments in eucalypts.</a> Plant Cell Rep. 23 (9), 617-624 (2005).</li>
<li>Plasencia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eucalyptus+hairy+roots%2C+a+fast%2C+efficient+and+versatile+tool+to+explore+function+and+expression+of+genes+involved+in+wood+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotech+J%22%5BJournal%5D)">Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation.</a> Plant Biotech J. , (2015).</li>
<li>Van Beveren, K. S., Spokevicius, A. V., Tibbits, J., Wang, Q., Bossinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+cambial+tissue+in+vivo+provides+efficient+means+for+Induced+Somatic+Sector+Analysis+%28ISSA%29+and+gene+testing+in+stems+of+woody+plants+species%5BTitle%5D)+AND+%22Funct+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Transformation of cambial tissue in vivo provides efficient means for Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) and gene testing in stems of woody plants species.</a> Funct Plant Biol. 33 (7), 629-638 (2006).</li>
<li>Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Bossinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+transformation+of+dormant+lateral+buds+in+poplar+trees+reveals+developmental+patterns+in+secondary+stem+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Funct+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated transformation of dormant lateral buds in poplar trees reveals developmental patterns in secondary stem tissues.</a> Funct Plant Biol. 33 (2), 133-139 (2006).</li>
<li>Spokevicius, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-tubulin+affects+cellulose+microfibril+orientation+in+plant+secondary+fiber+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">beta-tubulin affects cellulose microfibril orientation in plant secondary fiber cell walls.</a> Plant J. 51 (4), 717-726 (2007).</li>
<li>MacMillan, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fasciclin-like+arabinogalactan+protein+family+of+Eucalyptus+grandis+contains+members+that+impact+wood+biology+and+biomechanics%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">The fasciclin-like arabinogalactan protein family of Eucalyptus grandis contains members that impact wood biology and biomechanics.</a> New Phytol. 206 (4), 1314-1327 (2015).</li>
<li>Creux, N. M., Bossinger, G., Myburg, A. A., Spokevicius, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+somatic+sector+analysis+of+cellulose+synthase+%28CesA%29+promoter+regions+in+woody+stem+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Induced somatic sector analysis of cellulose synthase (CesA) promoter regions in woody stem tissues.</a> Planta. 237 (3), 799-812 (2013).</li>
<li>Hussey, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SND2%2C+a+NAC+transcription+factor+gene%2C+regulates+genes+involved+in+secondary+cell+wall+development+in+Arabidopsis+fibers+and+increases+fiber+cell+area+in+Eucalyptus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">SND2, a NAC transcription factor gene, regulates genes involved in secondary cell wall development in Arabidopsis fibers and increases fiber cell area in Eucalyptus.</a> BMC Plant Biology. 11, (2011).</li>
<li>Melder, E., Bossinger, G., Spokevicius, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+ARBORKNOX1+delays+the+differentiation+of+induced+somatic+sector+analysis+%28ISSA%29+derived+xylem+fiber+cells+in+poplar+stems%5BTitle%5D)+AND+%22Tree+Genet.+Genomes%22%5BJournal%5D)">Overexpression of ARBORKNOX1 delays the differentiation of induced somatic sector analysis (ISSA) derived xylem fiber cells in poplar stems.</a> Tree Genet. Genomes. 11 (5), (2015).</li>
<li>Baldacci-Cresp, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PtaRHE1%2C+a+Populus+tremula+x+Populus+alba+RING-H2+protein+of+the+ATL+family%2C+has+a+regulatory+role+in+secondary+phloem+fiber+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">PtaRHE1, a Populus tremula x Populus alba RING-H2 protein of the ATL family, has a regulatory role in secondary phloem fiber development.</a> Plant J. 82 (6), 978-990 (2015).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+A+laboratory+manual%22">Molecular cloning: A laboratory manual</a>. , 3rd edn, Cold Springs Harbour Press. (2001).</li>
<li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+medium+for+rapid+growth+and+bio-assays+with+tobacco+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Plant%22%5BJournal%5D)">A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures.</a> Physiol. Plant. 15 (3), 473-497 (1962).</li>
<li>Chaffey, N. The use of GUS histochemistry to visualise lignification gene expression in situ during wood formation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHawkins%2C+S+%22Wood+formation+in+trees%3A+Cell+and+Molecular+Biology+Techniques%22">Wood formation in trees: Cell and Molecular Biology Techniques</a>. , Taylor and Francis. 271-295 (2002).</li>
<li>Hodal, L., Bochardt, A., Nielsen, J. E., Mattsson, O., Okkels, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+expression+and+specific+elimination+of+endogenous+beta-glucuronidase+activity+in+transgenic+and+nontransgenic+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Detection, expression and specific elimination of endogenous beta-glucuronidase activity in transgenic and nontransgenic plants.</a> Plant Sci. 87 (1), 115-122 (1992).</li>
<li>Hansch, R., Koprek, T., Mendel, R. R., Schulze, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+protocol+for+eliminating+endogenous+beta-glucuronidase+background+in+barley%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">An improved protocol for eliminating endogenous beta-glucuronidase background in barley.</a> Plant Sci. 105 (1), 63-69 (1995).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

ISSAプロトコルは、木材に関わる目的の遺伝子およびプロモーターの分析のため、数ヶ月の空間における樹種におけるトランスジェニック幹組織を作成するための比較的単純かつ効率的な方法であり、形成を生じます。少しの努力は、生きている植物を保つことを超えて、大規模な培養は、組織または植物を維持するために必要とされる木材生産を開始する年まで取ることができる場所や、真のin vitroの方法とは対照的に立っているトランスジェニック幹組織次の接種を成長させるために必要とされます二ステムは1を作成されません。 ISSAもあれば、最適化が必要であり、ここで、非常に少ない（データは示していない） ポプラ 、 ユーカリおよびマツ 6の属だけでなく、 アカシアとCorymbiaで種を含む樹種の広い範囲に適用可能であることが示されていますトランスジェニック組織を導き出します。この方法を使用して、数値Oを調査することが可能ですF遺伝子または関心のほとんどの種への関心のプロモーター。さらに、プロトコルは、より広く、複...

ツリーは、惑星のバイオマスのかなりの量を含み、巨大な、生物学、文化、商業的に重要である茎。セカンダリが他の多くの生命体のためのリソースや避難所を提供することにより、生息地を作成茎。彼らは、彼らが生息し、木材、紙パルプ及びその他の木材や非木材製品の生産のための再生可能な資源としての役割を果たす生態系に他の多くのサービスを提供します。二次茎の発達、より具体的に木材形成は、特定の細胞型の発達を調節する複雑な分子系によって支配される、生化学それらの細胞壁の組成および方法は、それらが組織および器官を形成するように配置されています。二ステム開発と木部形成の分子基盤を解剖することは内と茎の間、長い世代時間、アウト交差配偶システム、高ヘテロ接合性、高い遺伝的負荷、季節の休眠、長い木材や茎の特性のばらつきを含む多くの要因によって混乱されます成熟しました形質設立期間と成木の薄手の物理的な大きさ。その結果、植物の発達の分子制御のほとんどの他の態様の詳細な知識に二ステム開発の相対的な理解は、まだ始まったばかりです。 インビトロでの多くの技術は、特定の木材及び二次細胞壁形成、二次茎の発達を研究し、理解するために使用されています。これらのプロトコルは、トランスジェニック植物のいずれかが作成されるか、特定の二次細胞または組織は、木材及び/又は二次茎の発達1の特定の側面の研究のために形質転換された植物全体または植物の部分システムの使用を含みます。トランスジェニック植物は、植物組織および細胞型の様々なからポスト形質転換を回収することができるが、進行が遅く、特に、長い再生に木質繊維特性を分析し、（年のオーダーで）熟成時間をステムと、高い技術と労働デーマンdsは、候補遺伝子だけでなく、いくつかの木本植物種を伝播するの難しさの低いスループット。同様の技術は、正常にこれらの制限の一部を克服するシロイヌナズナなどの非木質モデルシステムが開発されているが、これらの中には存在しないすべての二次の幹細胞型は、茎および季節性または寿命に関連する特性は、種2で検討することができません。あるいは、このようなPINUのラジアータのカルス培養3などの植物部分のシステムは、関連する時間枠を減らします。これらの方法は、しかし、個々の細胞型の研究に限定し、in vitroの実験のために述べたように同様の制約を受けるています。同様に、全体の茎外植片を含む頂端幹培養液4が有望であることが示されたが、まだ特定の遺伝子または関心のプロモーターの研究のために適用されていません。より最近では、毛状根培養を伴う代替のプロトコルは、ユーカリのために開発されており、正常でした5を適用し、しかし、この方法はまだ、 試験管内の培養に必要とする二次根を伴うのではなく茎や日付には、単一の樹種に限定されています。 ここに記載されるように誘導された体細胞セクター分析（ISSA）は、木材形成および二次茎組織発達における疑わしい役割を有する遺伝子およびプロモーターのためのハイスループット機能スクリーニングツールの媒体を提供するこれらの問題のいくつかを克服するために開発されました。 ISSA労働を克服しながら、完全な二幹トランスジェニック細胞および組織を産生するのにかかる時間を短縮するために開発されたインビボでの形質転換およびスクリーニングシステムであり、日常の技術的およびスループット限界は、 インビトロの方法で使用されます。二次はグラムなしの樹種や目的の組織では、短時間で茎にここで説明するプロトコルは、独立して形質転換組織の部門や細胞の数百の同時作成を可能に比較的短い時間枠と低人件費内eneticおよび/または環境変動。 ISSA のインビボ技術は、第一及び形成層の分化に関与する遺伝子および/またはプロモーターの研究によって二次茎組織で洗練されて以来、二ステム6と芽7組織について説明したとしていたが含まれます： チューブリン （TUB）8、 ファスシクリンのようなアラビノガラクタンを （ FLA）9、 セルロース合成酵素 （CESA）10、 二次細胞壁関連NACドメイン （SND 2）11、ARBORKNOX（ARK1）12と本当に面白い新しい遺伝子 （RING）H2タンパク質13。これらの研究は、ポプラおよびユーカリ植物の茎二次で実施し、細胞形態、細胞壁の化学的性質と遺伝子発現への洞察を提供しました。 ここで説明するプロトコルは、経験aを一緒に持って来るように意図されていますND知識は、過去10年間で出版され、未発表の研究の範囲からISSAの開発と応用を通して得られました。彼らは、二次茎組織6のin vivoでの変換に焦点を当て、 ギンドロ「錐」クローン、 ユーカリグロだけでなく、11 ユーカリグロのxカマルドレンシスクローンを含む研究に専念します。この文書は、組織の植物や細菌、幹組織の変革、成長と収穫の栽培からプロトコルを介して研究者を取り、トランスジェニック細胞および組織の識別、表現型の評価およびデータの収集と分析のための方法のための準備。技術が正常にスペースの制約、また9,11を細胞壁単糖組成を測定するために適用されているが、この文書は、細胞及び組織形態学を測定し、二番目の遺伝子発現パターンを理解するために使用される技術に集中しますEMSのみ。したがって、概説されたプロトコルは、ロールおよび/または二次的に連結された遺伝子の発現へのさらなる洞察を得るためにお探しの方に適した低コスト、技術的に容易で、かつハイスループット方法に培地を用いて茎。

<table><tbody><tr><td>植物NA</td><td></td><td>NA</td><td>必要に応じて植物については地元の苗床サプライヤーにご相談ください</td></tr><tr><td>アグロバクテリウム株</td><td>NA</td><td></td> NA <td>アグロバクトリウム株を取得する方法はたくさんあります。あなたの国や地域での細菌の入手には制限がある可能性があるため、地元の研究コミュニティ内でフォローアップすることをお勧めします。</td></tr><tr><td>バイナリベクター(遺伝子およびプロモーター)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>ゲートウェイリコンビナーゼシステムを使用して、ISSAプロトコルに適したさまざまなベクターを開発しました。これには、改変されたpCAMBIAベクターに基づく過剰発現、RNAiノックアウト、プロモーター融合ベクターが含まれ、必要に応じて喜んで提供します。さらに、研究コミュニティが利用できる多くのベクトルがあります。</td></tr><tr><td>LB培地</td><td></td><td>ΣL3022</td><td>同じ製品を他社から調達可能</td></tr><tr><td>寒天</td>培地 <td>Sigma</td><td>L2897</td><td>A同様の製品を他社から供給可能</td></tr><tr><td></td><td>Antibiotics Sigma</td><td>NA</td><td>カタログ番号は、バイナリベクターの細菌選択にさまざまな抗生物質が使用されるため、必要な抗菌薬によって異なります。この製品は、&nbsp;企業の範囲</td></tr><tr><td>50 ml スクリュートップチューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-432-22</td><td>同じ製品を別の会社から供給できます</td></tr><tr><td>2 ml マイクロチューブ</td><td>ワトソンバイオラボ</td><td>132-620C</td><td>同じ製品を別の会社から供給できます</td></tr><tr><td>MS Media</td><td>シグマ</td><td>M9274</td><td>同じ製品を別の会社から供給できます</td></tr><tr><td>メスブレード番号 11</td><td>シグマ</td><td>S2771</td><td>同じ製品は、別の会社Parafilm</td></tr><tr><td>"M"</td><td>Bemis</td><td>PM996</td>から供給することができます <td>これは、形成窓のポスト作成&nbspをバインドするために使用するのに最適な製品です。</td></tr><tr><td>14 ml丸底チューブ</td><td>Thermo Scientific</td><td>150268</td><td>同じ製品を別の会社から供給できます</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td>同じ製品を別の会社から供給できます</td></tr><tr><td>Triton</td><td></td><td>Sigma X100</td><td>同じ製品を別の会社から供給できます</td></tr><tr><td>X-Gluc</td><td>X-GLUC 直接</td><td></td><td>あなたは注文するためにウェブサイトに行く必要があります - http://www.x-gluc.com/index.html</td></tr><tr><td>フェリシアン化カリウム(III)</td><td>シグマ</td><td>244023</td><td>同じ製品は別の会社から供給することができます</td></tr><tr><td>フェロシアン化カリウム(II)</td><td>シグマ</td><td>P9387</td><td>同じ製品は別の会社から供給することができます</td></tr><tr><td>リトマス紙</td><td>シグマ</td><td>WHA10360300</td><td>同じ製品は別の会社から供給することができます</td></tr><tr><td>シングルエッジカミソリブレード</td><td>ProSciTechL055</td>同じ<td></td><td>製品を別の会社から供給することができます</td></tr><tr><td>ダブルエッジカミソリブレード</td><td>ProSciTechL056</td>同じ<td></td><td>製品を別の会社から供給することができます</td></tr>SEM<tr><td>ピンスタブ</td><td>ProSciTech</td><td>GTP16111</td><td>同じ製品を別の会社から供給することができます</td></tr>スクリュー<tr><td>キャップ付きサンプルバイアル</td><td>ProSciTechL6204</td><td></td><td>同じ製品が別の会社から供給されることができる</td></tr><tr><td>エタノール</td><td></td><td>σE7023</td><td>同じ製品が別の会社から供給される可能性がある</td></tr><tr><td>LRの白い</td><td>ProSciTech</td><td>C025</td><td>同じプロダクトは別の会社から供給</td></tr>することができる <tr><td>金型を埋め込む</td><td>ProSciTech</td><td>RL090</td><td>我々はこの品種をお勧めしますが、利用可能な</td></tr><tr><td>多くのオプションがあります 水Soulableの封入媒体</td><td>ProSciTech</td><td>IA019</td> 他の<td>オプションも存在し、検討の余地がある封入剤の一例です。</td></tr><tr><td>過酸化水素</td><td>シグマ</td><td>216763</td><td>Aのような製品は別の会社から供給することができます</td></tr><tr><td>氷酢酸</td><td>シグマ</td><td>A9967</td><td>のような製品は別の会社から供給することができます</td></tr><tr><td>Safranin O</td><td>ProSciTech</td><td>C138</td><td>のような製品は別の会社から供給することができます</td></tr><tr><td>量子環境走査型電子顕微鏡</td><td>FEI</td><td></td><td>これはこの研究の一部で使用された機器ですが、低真空モードを持つ他のSEMを利用することができ</td></tr>、<tr><td>ImageJイメージングソフトウェアは</td><td></td><td></td><td>次のURLから入手できます http://rsbweb.nih.gov/ij/</td></tr></tbody></table>

木部形成に関与する遺伝子およびプロモーターを研究するための誘導性体細胞セクター分析（issa）の使用とセカンダリステム開発

The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

樹木における二次茎の成長と関連した木部形成は、生物学的および商業的な観点の両方から重要です。しかし、比較的少ないが、その開発を支配する分子制御について知られています。これは、多くの場合、二次成長過程の研究に関連する物理、リソースと時間制限による部分です。 in vitroでの多くの技術は、植物の一部または木質及び非木質植物種の両方でプラント全体のシステムのいずれかを含む使用されています。しかし、二次茎成長プロセスの研究のための彼らの適用性についての質問には、特定の種や労働強度の反抗は、高スループットのアプリケーションへの媒体のため、多くの場合、法外です。二ステム開発や木材形成を見たときにも、調査中の特定の形質のみが成長の数年後に後半ツリーのライフサイクルにおける測定可能になるかもしれません。 生体内の P で 、これらの課題の代替に対処するにはrotocolsは、直接、植物の二次茎トランスジェニック体細胞組織セクターの創出を伴う誘発性体細胞セクター分析、命名、開発されてきました。このプロトコルの目的は、樹種の範囲内で利用することができる遺伝子及びプロモーター機能的特徴付けのために、トランスジェニック植物の二次組織を作成するための、効率的で、簡単で、比較的迅速な手段を提供することです。ここに示された結果は、トランスジェニック二ステム部門は二次ですべてのライブの組織および細胞型で作成することができることを示して容易に高い中〜容易に評価することができる樹種の多様性の茎およびセカンダリでその木材の形態学的特性だけでなく、プロモーターの発現パターンは茎スループット機能的特徴。

このプロトコルを使用してすべてのライブ二幹細胞及び組織型は、Aに対して感受性であることが示されています変換ツメファシエンスと最初に形質転換された細胞の種類に基づいて、セクタの種類と、それ以降の発育成長パターンに定義されています。セクターの種類は周皮、師部、形成層、創傷実質およびチロース（ 図1b、1C、1D） が含まれ 、一貫性の場所にあります。この段落の残りの部分で説明します。周皮部門は周皮でのみ発見、決して師部（ 図1eの ）内に延びる形質転換された細胞のグループで構成されます。師部部門は、これらの周囲の組織（ 図1F）内に延びることはありません、しかし、開始層と周皮との間に様々な場所で見つけることができます。形成層のセクターはTRANから派生形質転換された木部/形成層/篩部組織から構成されています...

ここでは、比較的短い時間枠内で、木の二次幹組織における遺伝子およびプロモーターコンストラクトの中スループットから高スループットの機能特性評価を容易にするプロトコルを提示します。効率的で使いやすく、さまざまな樹種に広く適用できます。

木部形成に関与する遺伝子およびプロモーターを研究するための誘導性体細胞セクター分析（ISSA）の使用とセカンダリステム開発

Secondary stem growth in trees and associated wood formation are significant both from biological and commercial perspectives. However, relatively little ...

誘導体細胞セクター解析（Induced Somatic Sector Analysis）の全体的な目的は、樹木の二次茎組織における遺伝子およびプロモーター構築物の機能解析を、比較的短期間で中から高スループットに実施するための手法を提供することです。本手法は、遺伝子がいつ、どこで発現するか、および木材形成や二次茎の発達といった生物学的に重要なプロセスにおける役割に関する重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、効率的かつ簡便で、比較的迅速な手順であり、幅広い樹種に適用可能であることです。まず、細菌選択に適した抗生物質を含む、28 °Cに温めた新鮮なLB培地19 mLを、清潔な50 mLスクリューキャップチューブに準備します。A.tumefaciens培養液を1 mL加え、600 nmにおける光学密度（OD）を確認します。ODが0.1を超える場合は、温かいLB培地でさらに希釈します。OD 600が0.4から0.6の間になるまで、A.tumefaciens培養液を振盪インキュベーターに入れて培養します。これが完了したら、4°C、1,000 x gで15分間、細胞を遠心分離します。チューブから上清を除去し、直ちに1 mLの冷却したMS培地で細胞ペレットを再懸濁します。懸濁液を清潔な2 mLマイクロチューブに移し、使用時まで氷上で保存します。実験は春または初夏に開始し、形成層が活性化し急速に成長している個体を選択してください。これは、篩部を木部から容易に剥離できることで確認できます。植物の基部付近で茎のまっすぐな部分を特定し、葉や枝を取り除いてください。鋭利なメスを用いて、師部を貫通するように5 mm間隔で2本の平行な20 mmの切開を加え、さらに基端側で2本の垂直な切開を横切るように水平に1回切断することで、1平方センチメートルの形成層ウィンドウを作成します。師部のストリップを上方へ剥がし、発達中の道管組織を露出させます。その後、ピペットを使用して、露出した道管の表面が十分に濡れる量の接種培地を添加します。すぐに篩部ストリップを茎に再挿入し、パラフィルムでしっかりと固定します。これらの接種手順を、目的のすべての遺伝子またはプロモーターに対して繰り返し、既存のウィンドウから上下に少なくとも1 cm離し、かつ90度の角度をずらして新しい形成層ウィンドウを作成します。さらに、実験的な接種と同様に、同じ茎または別の茎のウィンドウにポジティブコントロールおよびネガティブコントロールのベクターを接種します。茎の成長を定期的に観察し、半径方向に少なくとも5 mmの成長が認められた時点で、組織を採取してβ-グルクロニダーゼ（GUS）アッセイに用いる。試験材料を採取するには、まず茎から形成層ウィンドウを切り出し、新成長部位以外の組織を除去する。成熟した木部および師部細胞または組織の形態に関する研究を行う場合は、木部から師部を剥離させる。あるいは、形成層帯を維持する必要がある場合や、プロモーターの発現パターンを評価する必要がある場合は、カミソリを用いて形成層窓を横方向にスライスし、厚さ 0.5 から 1 mm のディスク状に切り出します。採取した形成層窓組織を個別の 14 mL 丸底チューブに入れ、pH 7 の 0.1 M リン酸緩衝液で、組織が完全に浸っていることを確認しながら、5 分間ずつ 2 回すすぎます。2 回目のすすぎが終わったら、余分な溶液を完全に取り除いてください。次に、各チューブに5 mLのGUS試薬を加えます。組織サンプルが完全に浸っていない場合は、試薬を追加してください。チューブを暗所で55 °Cにて10分間インキュベートします。その後、チューブをシェーカーに入れ、37 °Cの暗所で緩やかに撹拌しながら、さらに12～16時間インキュベートします。インキュベーターから取り出した後、チューブをランダムにいくつか選び、pH 0～7の範囲のリトマス試験紙を用いてGUS試薬のpHを確認します。pHが6未満のものが一つでもあれば、それらにラベルを付け、残りのチューブをすべて確認してください。pHが6未満のチューブにラベルを貼り、除外します。チューブからGUS試薬を捨て、組織が浸るのに十分な量の70%エタノールを補充します。サンプルは必要になるまで4°Cで保存してください。清潔なピンセットを用いて、サンプルチューブからすべての形成層ウィンドウ組織を取り出し、顕微鏡で観察するために小さなトレイまたはペトリ皿に置きます。1倍から4倍の倍率の解剖顕微鏡のレンズ下にサンプルを置き、鮮やかな青色に染色されている細胞または組織の数を特定し、集計します。師管が除去された例では、発達中の木部表面にある形成層組織内のセクター数を数えます。ディスク状に切り出したサンプルの場合、異なる細胞または組織タイプに見られるセクターの数をカウントします。ディスクの両面を確認し、2つのディスクにまたがって存在するセクターを照合して、数が過大評価されないようにしてください。セクターを含む組織のみを70 %エタノールを含むチューブに戻し、必要になるまで保存します。ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールを含め、採取した他のすべての形成層ウィンドウについて分析を繰り返します。セクターの分類および正確な同定を容易にするため、茎の傷に対する反応を含む、茎の二次的な解剖学的構造および発達について熟知しておくことを推奨します。この図は、青色に染色された領域として示されている、いくつかの成功した形質転換を示しています。例として示されている師部皮剥ぎのウィンドウには、複数の形質転換セクターが表示されています。また、2種類の樹種から採取されたディスクでは、形質転換セクターとその後の放射状の成長が確認できます。さまざまな組織型における形質転換も観察可能です。ここでは、セイヨウハコヤナギの周皮、師部、傷害柔組織、およびその他のいくつかの組織領域において、茎のセクターが見て取れます。この画像は、形成層誘導組織における遺伝子プロモーター発現の結果を示しています。この例では、ユーカリハイブリッドの茎に導入されたeucalyptus grandis由来のさまざまなCesAプロモーターを用いた試験において、各組織型における染色の割合を示しています。師管、発達中の木部および成熟した木部における発現は、パーセンテージで表示されています。接種した形成層1cmあたりの平均形質転換イベント数についても、各プロモーターまたは目的遺伝子ごとに算出することが可能です。この表は、ディスク採取法を用いて解析し、ポジティブコントロールまたは目的のプロモーターで形質転換されたユーカリおよびポプラの検体において同定された代表的なセクターのデータを示しています。この手法を習得すれば、二次茎の発達における形成層分化と形成の複雑な性質を解析するための、迅速かつ効率的で汎用性の高い手法となります。このビデオを視聴することで、植物と細菌の調製方法、形質転換の方法、茎の育成および回収方法、そして表現型評価のための形質転換組織の同定および分類方法について、十分に理解することができます。

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

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学ぶ誘導性体細胞セクター分析（ISSA）を用いた木部形成に関与する遺伝子およびプロモーターの機能解析法。A.tumefaciensを用いた二次茎組織の中高通量解析により、樹木の二次成長における遺伝子発現を効率的に研究できます。

木部形成に関与する遺伝子およびプロモーターを研究するための誘導性体細胞セクター分析（ISSA）の使用とセカンダリステム開発

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