Name: と実験感染リステリア菌ホストインターフェロンγ応答を研究するためのモデルとして、 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 学ぶリステリア菌感染モデルでC57BL/6Jマウスのインターフェロンγ応答と生存率を測定する方法。細菌培養から免疫細胞応答解析まで、感染症免疫学研究の基盤技術を習得できます。

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<ol><li>Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+responses+to+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune responses to Listeria monocytogenes.</a> Nat Rev Immunol. 4 (10), 812-823 (2004).</li>
<li>Ranson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+V+alpha+14%2B+NKT+cells+participate+in+the+early+response+to+enteric+Listeria+monocytogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Invariant V alpha 14+ NKT cells participate in the early response to enteric Listeria monocytogenes infection.</a> J Immunol. 175 (2), 1137-1144 (2005).</li>
<li>Bancroft, G. J., Schreiber, R. D., Unanue, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+immunity%3A+a+T-cell-independent+pathway+of+macrophage+activation%2C+defined+in+the+scid+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Natural immunity: a T-cell-independent pathway of macrophage activation, defined in the scid mouse.</a> Immunol Rev. 124, 5-24 (1991).</li>
<li>Soudja, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory-T-cell-derived+interferon-gamma+instructs+potent+innate+cell+activation+for+protective+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Memory-T-cell-derived interferon-gamma instructs potent innate cell activation for protective immunity.</a> Immunity. 40 (6), 974-988 (2014).</li>
<li>Schoenborn, J. R., Wilson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+interferon-gamma+during+innate+and+adaptive+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of interferon-gamma during innate and adaptive immune responses.</a> Adv Immunol. 96, 41-101 (2007).</li>
<li>Filipe-Santos, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inborn+errors+of+IL-12%2F23-+and+IFN-gamma-mediated+immunity%3A+molecular%2C+cellular%2C+and+clinical+features%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inborn errors of IL-12/23- and IFN-gamma-mediated immunity: molecular, cellular, and clinical features.</a> Semin Immunol. 18 (6), 347-361 (2006).</li>
<li>Flynn, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+for+interferon+gamma+in+resistance+to+Mycobacterium+tuberculosis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection.</a> J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).</li>
<li>Cooper, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disseminated+tuberculosis+in+interferon+gamma+gene-disrupted+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Disseminated tuberculosis in interferon gamma gene-disrupted mice.</a> J Exp Med. 178 (6), 2243-2247 (1993).</li>
<li>Dalton, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+defects+of+immune+cell+function+in+mice+with+disrupted+interferon-gamma+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiple defects of immune cell function in mice with disrupted interferon-gamma genes.</a> Science. 259 (5102), 1739-1742 (1993).</li>
<li>Harty, J. T., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+immunity+to+Listeria+monocytogenes+in+the+absence+of+IFN+gamma%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Specific immunity to Listeria monocytogenes in the absence of IFN gamma.</a> Immunity. 3 (1), 109-117 (1995).</li>
<li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+response+in+mice+that+lack+the+interferon-gamma+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Immune response in mice that lack the interferon-gamma receptor.</a> Science. 259 (5102), 1742-1745 (1993).</li>
<li>Wang, Z. E., Reiner, S. L., Zheng, S., Dalton, D. K., Locksley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+effector+cells+default+to+the+Th2+pathway+in+interferon+gamma-deficient+mice+infected+with+Leishmania+major%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">CD4+ effector cells default to the Th2 pathway in interferon gamma-deficient mice infected with Leishmania major.</a> J Exp Med. 179 (4), 1367-1371 (1994).</li>
<li>Hess, J., Ladel, C., Miko, D., Kaufmann, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+typhimurium+aroA-+infection+in+gene-targeted+immunodeficient+mice%3A+major+role+of+CD4%2B+TCR-alpha+beta+cells+and+IFN-gamma+in+bacterial+clearance+independent+of+intracellular+location%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Salmonella typhimurium aroA- infection in gene-targeted immunodeficient mice: major role of CD4+ TCR-alpha beta cells and IFN-gamma in bacterial clearance independent of intracellular location.</a> J Immunol. 156 (9), 3321-3326 (1996).</li>
<li>Ikeda, H., Old, L. J., Schreiber, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+IFN+gamma+in+protection+against+tumor+development+and+cancer+immunoediting%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">The roles of IFN gamma in protection against tumor development and cancer immunoediting.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 13 (2), 95-109 (2002).</li>
<li>Hodge, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-gamma+AU-rich+element+removal+promotes+chronic+IFN-gamma+expression+and+autoimmunity+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">IFN-gamma AU-rich element removal promotes chronic IFN-gamma expression and autoimmunity in mice.</a> J Autoimmun. 53, 33-45 (2014).</li>
<li>Seery, J. P., Carroll, J. M., Cattell, V., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antinuclear+autoantibodies+and+lupus+nephritis+in+transgenic+mice+expressing+interferon+gamma+in+the+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Antinuclear autoantibodies and lupus nephritis in transgenic mice expressing interferon gamma in the epidermis.</a> J Exp Med. 186 (9), 1451-1459 (1997).</li>
<li>Peng, S. L., Moslehi, J., Craft, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+interferon-gamma+and+interleukin-4+in+murine+lupus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Roles of interferon-gamma and interleukin-4 in murine lupus.</a> J Clin Invest. 99 (8), 1936-1946 (1997).</li>
<li>Savinov, A. Y., Wong, F. S., Chervonsky, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-gamma+affects+homing+of+diabetogenic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">IFN-gamma affects homing of diabetogenic T cells.</a> J Immunol. 167 (11), 6637-6643 (2001).</li>
<li>Miller, C. H., Maher, S. G., Young, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Use+of+Interferon-gamma%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Clinical Use of Interferon-gamma.</a> Ann N Y Acad Sci. 1182, 69-79 (2009).</li>
<li>Paget, C., Chow, M. T., Duret, H., Mattarollo, S. R., Smyth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+gammadelta+T+cells+in+alpha-galactosylceramide-mediated+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Role of gammadelta T cells in alpha-galactosylceramide-mediated immunity.</a> J Immunol. 188 (8), 3928-3939 (2012).</li>
<li>Leonard, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+single-dose+interleukin-12+exposure+on+interleukin-12-associated+toxicity+and+interferon-gamma+production%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Effects of single-dose interleukin-12 exposure on interleukin-12-associated toxicity and interferon-gamma production.</a> Blood. 90 (7), 2541-2548 (1997).</li>
<li>Zenewicz, L. A., Shen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+and+adaptive+immune+responses+to+Listeria+monocytogenes%3A+a+short+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Innate and adaptive immune responses to Listeria monocytogenes: a short overview.</a> Microbes Infect. 9 (10), 1208-1215 (2007).</li>
<li>Viegas, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-gamma+production+by+CD27%28%2B%29+NK+cells+exacerbates+Listeria+monocytogenes+infection+in+mice+by+inhibiting+granulocyte+mobilization%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">IFN-gamma production by CD27(+) NK cells exacerbates Listeria monocytogenes infection in mice by inhibiting granulocyte mobilization.</a> Eur J Immunol. 43 (10), 2626-2637 (2013).</li>
<li>Selvanantham, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nod1+and+Nod2+enhance+TLR-mediated+invariant+NKT+cell+activation+during+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Nod1 and Nod2 enhance TLR-mediated invariant NKT cell activation during bacterial infection.</a> J Immunol. 191 (11), 5646-5654 (2013).</li>
<li>Becavin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+widely+used+Listeria+monocytogenes+strains+EGD%2C+10403S%2C+and+EGD-e+highlights+genomic+variations+underlying+differences+in+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity.</a> MBio. 5 (2), e00969-e00914 (2014).</li>
<li>Jones, G. S., D'Orazio, S. E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unit+9B.2+Listeria+monocytogenes%3A+cultivation+and+laboratory+maintenance%2C+Chapter+31B%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Unit 9B.2 Listeria monocytogenes: cultivation and laboratory maintenance, Chapter 31B.</a> Curr Protoc Microbiol. , (2013).</li>
<li>Conour, L. A., Murray, K. A., Brown, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+animals+for+research--issues+to+consider+for+rodents+and+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Preparation of animals for research--issues to consider for rodents and rabbits.</a> ILAR J. 47 (4), 283-293 (2006).</li>
<li>Obernier, J. A., Baldwin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+an+appropriate+period+of+acclimatization+following+transportation+of+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Establishing an appropriate period of acclimatization following transportation of laboratory animals.</a> ILAR J. 47 (4), 364-369 (2006).</li>
<li>BD LSR II User's Guide. , download from bdbiosciences.com. 
 <a target="_blank" href="http://flowcytometry.sysbio.med.harvard.edu/documents/BD%20LSRII%20User's%20Guide.pdf">http://flowcytometry.sysbio.med.harvard.edu/documents/BD%20LSRII%20User's%20Guide.pdf</a> (2007).</li>
<li>Flowjo Tutorial. , download from bdbiosciences.com. 
 <a target="_blank" href="http://www.flowjo.com/tutorials">http://www.flowjo.com/tutorials</a> (2016).</li>
<li>Zhang, M. A., Ahn, J. J., Zhao, F. L., Selvanantham, T., Mallevaey, T., Stock, N., Correa, L., Clark, R., Spaner, D., Dunn, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonizing+peroxisome+proliferator-activated+receptor+alpha+%28PPARalpha%29+activity+enhances+Th1+immunity+in+male+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antagonizing peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARalpha) activity enhances Th1 immunity in male mice.</a> J. Immunol. , (2015).</li>
<li>Kaplan, E. L., Meier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonparametric+estimation+from+incomplete+observations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Amer+Stat+Assoc%22%5BJournal%5D)">Nonparametric estimation from incomplete observations.</a> J Amer Stat Assoc. 53, 457-481 (1958).</li>
<li>Brown, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+role+of+CD28-mediated+signals+in+T+helper+subset+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Limited role of CD28-mediated signals in T helper subset differentiation.</a> J Exp Med. 184 (3), 803-810 (1996).</li>
<li>Czuprynski, C. J., Brown, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relative+difference+in+anti-Listeria+resistance+of+C57BL%2F6+and+A%2FJ+mice+is+not+eliminated+by+active+immunization+or+by+transfer+of+Listeria-immune+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">The relative difference in anti-Listeria resistance of C57BL/6 and A/J mice is not eliminated by active immunization or by transfer of Listeria-immune T cells.</a> Immunology. 58 (3), 437-443 (1986).</li>
<li>Busch, D. H., Vijh, S., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+model+for+infection+with+Listeria+monocytogenes%2C++Chapter+19%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Animal model for infection with Listeria monocytogenes, Chapter 19.</a> Curr Protoc Immunol. , (2001).</li>
<li>Mekada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+differences+among+C57BL%2F6+substrains%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Anim%22%5BJournal%5D)">Genetic differences among C57BL/6 substrains.</a> Exp Anim. 58 (2), 141-149 (2009).</li>
<li>Ivanov, I. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+microbiota+direct+the+differentiation+of+IL-17-producing+T-helper+cells+in+the+mucosa+of+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Specific microbiota direct the differentiation of IL-17-producing T-helper cells in the mucosa of the small intestine.</a> Cell Host Microbe. 4 (4), 337-349 (2008).</li>
<li>Bou Ghanem, N. E., Myers-Morales, T., Jones, G. S., D'Orazio, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+transmission+of+Listeria+monocytogenes+in+mice+via+ingestion+of+contaminated+food%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Oral transmission of Listeria monocytogenes in mice via ingestion of contaminated food.</a> J Vis Exp. (75), e50381(2013).</li>
<li>Lecuit, M., Dramsi, S., Gottardi, C., Fedor-Chaiken, M., Gumbiner, B., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+amino+acid+in+E-cadherin+responsible+for+host+specificity+towards+the+human+pathogen+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">A single amino acid in E-cadherin responsible for host specificity towards the human pathogen Listeria monocytogenes.</a> Embo J. 18 (14), 3956-3963 (1999).</li>
<li>Wollert, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extending+the+host+range+of+Listeria+monocytogenes+by+rational+protein+design%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extending the host range of Listeria monocytogenes by rational protein design.</a> Cell. 129 (5), 891-902 (2007).</li>
<li>Brunt, L. M., Portnoy, D. A., Unanue, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presentation+of+Listeria+monocytogenes+to+CD8%2B+T+cells+requires+secretion+of+hemolysin+and+intracellular+bacterial+growth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Presentation of Listeria monocytogenes to CD8+ T cells requires secretion of hemolysin and intracellular bacterial growth.</a> J Immunol. 145 (11), 3540-3546 (1990).</li>
<li>Muraille, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+in+vivo+dendritic+cell+activation+by+live+versus+killed+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Distinct in vivo dendritic cell activation by live versus killed Listeria monocytogenes.</a> Eur J Immunol. 35 (5), 1463-1471 (2005).</li>
<li>Datta, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccination+with+irradiated+Listeria+induces+protective+T+cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Vaccination with irradiated Listeria induces protective T cell immunity.</a> Immunity. 25 (1), 143-152 (2006).</li>
<li>Geginat, G., Schenk, S., Skoberne, M., Goebel, W., Hof, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+of+direct+ex+vivo+epitope+mapping+identifies+dominant+and+subdominant+CD4+and+CD8+T+cell+epitopes+from+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A novel approach of direct ex vivo epitope mapping identifies dominant and subdominant CD4 and CD8 T cell epitopes from Listeria monocytogenes.</a> J Immunol. 166 (3), 1877-1884 (2001).</li>
<li>Shen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+Listeria+monocytogenes+as+a+live+vaccine+vehicle+for+the+induction+of+protective+anti-viral+cell-mediated+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Recombinant Listeria monocytogenes as a live vaccine vehicle for the induction of protective anti-viral cell-mediated immunity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (9), 3987-3991 (1995).</li>
<li>Foulds, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+CD4+and+CD8+T+cells+are+intrinsically+different+in+their+proliferative+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: CD4 and CD8 T cells are intrinsically different in their proliferative responses.</a> J Immunol. 168 (4), 1528-1532 (2002).</li>
</ol>

開示する利益相反はありません。

ここでは、LのEGD株はオスまたはメスC57BL / 6Jマウスに25を モノサイトゲネスでの基本的な感染実験を実施する方法のプロトコルを記述します。このプロトコルは、インビボ 31 に先天性および適応リンパ球によるIFN-γ産生に対する新しい小分子IS001の効果を研究するために設立されました。細菌クリアランスと生存感染後を監視することにより、洞察力は、IFN-γにおけるこれらの変化は、感染を制御するホストの能力に影響を与えたかに得られました。 プロトコルにおける重要な検討事項研究のこのタイプの設計における重要な考慮点は、各実験が適切給電と適切に制御することです。感染による免疫応答における生物学的変化に（ 図4、図6を参照）、N = 4ことをお勧めします-グループ当たり5匹のマウスは最初の免疫研究のために使用されるべきです。もしFTERデータの傾向が、グループ間で明らかな有意差があ...

IFN-γは、細胞内病原体に対する免疫を媒介するため、腫瘍の成長5を制御するために重要であるサイトカインです。耐性菌におけるこのサイトカインの重要性は、IFN-γシグナル伝達経路に変異を有する人間観察に明らかであるマイコバクテリアやサルモネラ菌6での感染を非常に受けやすいです。同様に、マイコバクテリア7-9とL.を含む他の細胞内病原体に対するIFN-γまたは抵抗のIFN-γ受容体展示欠陥のいずれかを欠損したマウスは、10,11、 リーシュマニア 12、 ネズミチフス菌 13、および特定のウイルス11 モノ サイトゲネス 。病原体に対抗することに加えて、IFN-γは、腫瘍14に対する宿主防御に重要な役割を果たしています。 IFN-γの高い生産は、感染または癌の文脈において有益であるが、このサイトカインの持続的生産はトンをリンクされています全身性自己免疫15-17と非肥満糖尿病マウスモデル18におけるI型糖尿病の加速の開発O。 IFN-γの主要な源は、NK細胞、NKT細胞、γδT細胞、Tヘルパー1（Th1）細胞、および細胞傷害性Tリンパ球（CTL）5,19,20を含みます。 IFN-γは、によって先天性および適応免疫の両方を増強する：（1）アップレギュレート（3）強化マクロファージ、（2）抗原提示細胞上の共刺激分子の発現を増加させる、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）クラスIおよびII発現を食作用および炎症性サイトカインの産生および殺菌因子（ 例えば 、一酸化窒素および活性酸素種）、（4）（5）（免疫グロブリン抗体のクラススイッチを促進するTh1エフェクター細胞へのナイーブCD4 + T細胞の分化を促進します（）マウスにおけるIg）図2aおよびIgG3、（6）は、iの部位に免疫細胞を動員するケモカインの産生を誘導しますnfection、及び（7）NK細胞およびCTL応答5,19を高めます。病原体および腫瘍に対する宿主応答におけるIFN-γの決定的な重要性を考えると、組換えIFN-γは（19件）様々な感染症や悪性腫瘍の治療薬として試験されています。 IFN-γまたはのTh1促進サイトカインインターロイキン-12（IL-12）の全身投与は、副作用および用量関連毒性19,21に関連付けられているためしかし、によりIFN-γ産生を増加するための代替戦略を開発することに関心があります免疫細胞。新しい生物製剤と小分子の開発は、このような薬剤は、免疫応答の間に、これは、このような動物の生存の増加などの意味のある生物学的作用に変換するかどうかのIFN-γ産生を増加させるかどうかをテストするためにin vivoでスクリーニングツールが必要です。 グラム陽性細菌リステリア菌によるマウスの実験的感染は、のために尽力したモデルとなっています細胞内病原体1,22に対する宿主免疫におけるIFN-γの役割を解読します。静脈内または腹腔内病原体（IP）によるマウスの感染は、それらが脾臓中のピークの細菌負荷が3と4日の間に発生すると常駐マクロファージおよび肝細胞によって内在なり脾臓および肝臓に細菌の急速な普及につながる後感染1,3,22。 NK細胞によるIFN-γの産生は、マクロファージの活性化及び病原体3に対する早期の抵抗のために重要です。しかし高感染性用量で、IFN-γの産生も病原体のクリアランス23に損害を与える恐れがあります。 NKT細胞は、病原体2,24の初期制御時の脾臓および肝臓におけるIFN-γの供給源であり、この生産は、NK細胞2を含む他の細胞型によってIFN-γ産生を増幅することが示されています。一方、後に作用する適応型Tリンパ球パルティで、CD8 + T細胞cularは、病原体のクリアランスを媒介し、再感染1,4,22に対する保護を提供するために重要です。 この感染モデルは、（1件）いくつかの理由のための研究者にとって魅力となっています。まず、病原体による感染は非常に再現性があり、強力なTh1および細胞性免疫応答を誘導します。第二に、致死感染中に、細菌負荷は、それが容易に測定することができ、肝臓及び脾臓に集中しています。第三に、病原体を安全バイオセーフティーレベル2（BSL2）条件下で取り扱うことができます。第四に、生物とそれが広範囲に特徴づけられている生成する免疫応答。最後に、変異体および遺伝的に改変された株の様々な使用のために利用可能であるが開発されています。 ここで説明するL.のEGD株とC57BL / 6Jマウスの接種のための基本的なプロトコルは25とIFNを測定するためのモノサイトゲネスれる-再γNK、NKT、および適応リンパ球感染後によりsponses。また、致死感染後の脾臓および肝臓における細菌負荷を測定し、病原体の改変LD 50用量での感染後の生存研究を行う方法について説明します。最後に、代表的なデータは、このプロトコルはL.、感染モノサイトゲネスからのIFN-γ応答およびマウス生存に対する新規治療法の効果をスクリーニングするために使用することができる方法を示しています。

<table><tbody><tr><td>ブレインハートインフュージョンブロス、修正</td><td>BD</td><td>299070</td>任意の<td>ブランドが適切であるべきです</td></tr>寒<tr><td>天</td><td>BD</td><td>214010</td>任意の<td>ブランドが適切であるべきです</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>任意のブランドが適切であるべきです</td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>シグマ</td><td>D8537</td>任意の<td>ブランドが適切であるべきです</td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>塩化アンモニウム(NH3Cl)</td><td></td><td></td><td>どのブランドも適切であるべきです</td></tr><tr><td>KHCO3</td><td></td><td></td><td>どのブランドも適切であるべきです</td></tr><tr><td>Na2EDTA</td><td></td><td></td><td>どのブランドも適切であるべきです</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>22400089</td><td>どのブランドも適切でなければなりません</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12483</td>使用<td>前に、56°Cで熱不活性化してください。C 30分間</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td>任意のブランドが適切であるべきです</td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td>Gibco</td><td>11140</td><td>任意のブランドは適切であるべきです</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>どのブランドも適切であるべきです</td></tr><tr><td>GolgiStop タンパク質輸送阻害剤 (モネンシンを含む)</td><td>BD</td><td>554724</td><td>4 &mu;l 6 mL 細胞培養</td></tr>中 <tr><td>16% パラホルマルデヒ電子</td><td>顕微鏡法 Sciences</td><td>15710</td><td>ddH2O または 1x PBS</td></tr><tr><td>10x Perm/Wash バッファー</td><td>BD</td><td>554723</td><td>ddH2O</td></tr><tr><td>Fc ブロック、抗マウス CD16/CD32 精製</td><td>eBioscience</td><td>14-0161</td><td>希釈 1:50</td></tr><tr><td>固定可能な生存率 色素 eFluor 506</td><td>eBioscience</td><td>65-0866</td><td>希釈 1:1,000 (分子プローブからの生存率染料も使用しています)</td></tr><tr><td>抗マウス CD4-PE-Cy5 (GK1.5)</td><td>eBioscience</td><td>15-0041</td><td>メーカーは特定のテストサイズを推奨していますが、これは使用前に滴定する必要があります。</td></tr><tr><td>抗マウスCD8-FITC (53-6.7)</td><td>eBioscience</td><td>11-0081</td><td>メーカーは特定の試験サイズを推奨していますが、これは使用前に滴定する必要があります。</td></tr><tr><td>PBS57/mCD1d tetramer-APC</td><td>NIH Tetramer Core</td><td>Facility N/A</td><td>施設からの贈り物として入手</td></tr><tr><td>anti-Mouse TCR&beta;-PE-Cy7 (H56-597)</td><td>eBioscience</td><td>25-5961</td><td>メーカーは、特定のテストサイズを推奨しています。ただし、これは使用前に滴定する必要があります。</td></tr><tr><td>抗マウス NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4)</td><td>eBioscience</td><td>47-3351</td><td>メーカーは一定の試験サイズを推奨していますが、これは使用前に滴定する必要があります。</td></tr><tr><td>抗マウスCD45 PE-シアニン7 (30-F11)</td><td>eBioscience</td><td>25-0451</td><td>製造業者は特定の試験サイズを推奨していますが、これは使用前に滴定する必要があります。</td></tr><tr><td>抗マウスIFNガンマ-PE(XMG1.2)</td><td>eBioscience</td><td>12-7311</td><td>メーカーは特定のテストサイズを推奨していますが、これは使用前に滴定する必要があります。</td></tr><tr><td>OneComp eBeads</td><td>eBioscience</td><td>01-1111</td><td>染色ごとに1滴使用</td></tr><tr><td>マウスIFNガンマELISAキット</td><td>eBioscience</td><td>88-7314</td><td>培養上清中のインターフェロンガンマの測定に使用</td></tr><tr><td>培養用</td><td></td><td></td>50mlのベントチューブ <td>細菌の培養に使用され、どのブランドも適切であるべきです</td></tr><tr><td>1.5mlの微量遠心チューブは</td><td></td><td></td><td>適切であるべきです</td></tr><tr><td>細菌性ペトリ皿</td><td></td><td></td><td>任意のブランドは適切であるべきです</td></tr><tr><td>2 mL cyrovials</td><td></td><td></td><td>任意のブランドは適切であるべきです</td></tr><tr><td>UV 分光計</td><td></td><td></td><td>任意のブランドは適切であるべきです</td></tr><tr><td>安全設計された針</td><td></td><td></td><td>任意のブランドは適切であるべきです</td></tr><tr><td>C57BL/6J</td><td>ジャクソン研究所</td><td>Stock#000664</td><td>注文7週間での到着</td></tr><tr><td>漂白剤</td><td></td><td></td><td>除染用</td></tr><tr><td>70% エタノール</td><td></td><td></td><td>除染用</td></tr><tr><td>ガラスビーズ</td><td></td><td></td><td>どのブランドも適切であるべきです</td></tr><tr><td>遠心分離</td><td></td><td></td><td>機のローター、バケツ、バケツカバー。</td></tr><tr><td>微量遠心分離機</td><td></td><td></td><td>任意のブランドは適切であるべきです</td></tr><tr><td>滅菌グリセロール</td><td></td><td></td><td>任意のブランドは適切であるべきです</td></tr><tr><td>ピペットのヒント</td><td></td><td></td><td>どのブランドも適切であるべきです</td></tr><tr><td>ピペット</td><td></td><td></td><td>は適切であるべきです</td></tr><tr><td>手術器具</td><td></td><td></td><td>どのブランドも適切であるべきです</td></tr><tr><td>70ミクロンストレーナー</td><td></td><td></td><td>任意のブランドは適切であるべきです</td></tr><tr><td>3 mlシリンジ</td><td></td><td></td><td>どのブランドも適切であるべきです</td></tr><tr><td>ピペットガン</td><td></td><td></td><td>どのブランドも適切であるべきです</td></tr><tr><td>ろ過ユニット</td><td></td><td></td><td>どのブランドも適切であるべきです</td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td></td><td></td><td>1 から 9 を ddH2O で希釈します、どのブランドも適切であるべきです</td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td></td><td></td><td>任意のブランドが適切であるべき</td></tr><tr><td>丸底プレート</td><td></td><td></td><td>どのブランドも適切であるべき</td></tr><tr><td>FACs チューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-959-5</td><td></td></tr><tr><td>BD LSR II</td><td>BD</td><td></td><td>任意のフローサイトメーターは、フルオロコルムスを区別するために適切なレーザー構成とフィルターセットを持つ取得に使用できます</td></tr><tr><td>Flowjoソフトウェア</td><td>Treestar</td><td></td><td>データ分析に使用されます。他のタイプのデータ分析ソフトウェアも適切です</td></tr><tr><td>マルチチャンネルピペッター(0-300 &micro;l)</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td>フローサイトメトリー染色中の細胞洗浄および抗体添加に使用</td></tr><tr><td>酢酸</td><td></td><td></td><td>ガラスビーズの洗浄に使用され、どのブランドも適切であるべきです</td></tr><tr><td>マイクロバンク 細菌保存システム</td><td>プロラボ診断</td><td></td><td>細菌の長期保存のためのグリセロールストックの代替として使用されます</td></tr></tbody></table>

と実験感染<em&gt;リステリア菌</em&gt;ホストインターフェロンγ応答を研究するためのモデルとして、

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

リステリア菌は、ヒトにおける食品媒介性疾患の原因であるグラム陽性細菌です。この病原体によるマウスの実験的感染は、細胞内病原体に対する宿主の免疫における自然免疫と適応免疫細胞および特定のサイトカインの役割に非常に有益となっています。 リステリア菌と亜致死感染の間の生来の細胞によるIFN-γの産生は、マクロファージおよび病原体1-3の初期の制御を活性化するために重要です。また、適応メモリリンパ球によるIFN-γ産生が再感染4時に先天性細胞の活性化をプライミングするために重要です。 L.は、このように感染モデルをモノサイトゲネス IFN-γの産生を増加させるために設計されている新しい治療法は、in vivoでの IFN-γ応答に影響を与えると、そのような細菌のクリアランスを大きくするか、マウスの生存率を向上させるなどの生産的な生物学的効果を持っているかどうかを調査するための優れたツールとして機能しますから感染。 リステリア菌のEGD株とC57BL / 6Jマウスの腹腔内感染を行うために、フローサイトメトリーによって、NK細胞、NKT細胞、および適応リンパ球によるIFN-γの産生を測定する方法のための基本的なプロトコルは、ここで説明します。 （1）成長し、接種菌を調製し、（2）脾臓及び肝臓における細菌負荷を測定し、エンドポイント（3）測定動物の生存：また、手順がに記載されています。代表的なデータは、この感染モデルは、 リステリア・モノサイトゲネスおよびこの感染からマウスの生存に対するIFN-γ応答の特定の薬剤の効果を試験するために使用することができる方法を説明するために提供されます。

図3は、病原体の10 5 CFUで24時間の感染後に脾臓NK細胞およびNKT細胞におけるIFN-γのいくつかの典型的なフローサイトメトリー染色を提示します。この図はまた、表2に記載の染色パネルのためのゲーティング戦略を示しています。 図4は、雄マウスは、PPARαアンタゴニストIS001や車両制御で処理された10 5 CFU リステリア菌に感染させ、その後、24時間後にNK細胞とNKT細胞におけるIFN-γについて分析した一つの実験で得られたいくつかの代表的なデータを示しています。この図は、IS001を用いた治療は、病原体に感染した後、NK細胞、NKT細胞によるIFN-γ応答をブーストではなく、ことを示しています。 図5は、熱殺菌PAでのex vivoでの再刺激後7日目の脾臓CD4 +およびCD8 <...

このプロトコルは、 リステリア・モノサイトゲネスのEGD株と（リステリア菌）を C57BL / 6Jマウスに接種すると、ナチュラルキラー（NK）細胞、ナチュラルキラーT（NKT）細胞によるインターフェロンγ（IFN-γ）反応を測定する方法を説明しますそして、適応Tは、感染後のリンパ球。このプロトコルは、病原体の改変されたLD 50用量での感染後のマウスの生存の研究を実施する方法について説明します。

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

本プロトコルの全体的な目的は、C57 blacksixマウスを飼育し、Listeria monocytogenesのEGG株を感染させ、細菌量、インターフェロンガンマ応答、およびこの病原体による感染に対する生存率と応答を測定することである。本プロトコルは、細菌感染後のインターフェロンガンマ応答および動物の生存率に影響を与える薬剤や遺伝子のスクリーニングに役立つ。この手法の主な利点は、ラボでのセットアップが比較的簡単であることである。細菌の培養経験が少ない方にとっても分かりやすく解説します。また、私の研究室の大学院生であるJennifer Ahnが、手順の実演を行います。まず、室温で解凍したL. monocytogenes EGG株のグリセロールストックに、滅菌済みのピペットチップを浸すことから始めてください。そして、すぐにピペットチップの先端を brain heart infusion または BHI プレートの一部分で前後にストリークします。これが一次ストリークです。プレートを 90 度回転させ、新しいピペットチップで一次ストリーク部分を通過するように引きずり、菌株をプレートの次の 4 分の 1 領域に広げます。これが2次画線です。次に、プレートを回転させ、2次画線から3番目の領域に画線を広げて3次画線を作成します。その後、プレートを倒置し、37 °Cで一晩培養します。16時間から24時間後、最後のストリーク領域に単一の均一なコロニーが見られるはずです。コロニーが出現したら、滅菌済みの通気性50 milliliterチューブに10 millilitersの滅菌BHI brothを分注し、滅菌済みのピペットチップを使用して、プレートから1つのL. monocytogenesコロニーをbrothに転移させます。接種したbrothを、OD600が1になるまで、オービタルシェイキングインキュベーターを用いて37 °C、225 rpmで一晩培養します。実験用の L monocytogenes 感染接種液を調製するため、バイオセーフティキャビネット内で、BHI培地が入ったチューブに100 µLのオーバーナイト培養液を接種します。目的のOD600に達するまで37 °Cで振盪培養した後、培養液の内容物を滅菌遠心チューブに移して遠心分離を行います。そして、漂白剤を入れたトラップフラスコに接続された真空吸引装置を用いて、上清を吸引除去します。同じ遠心分離条件で、ペレットをPBSで2回洗浄します。2回目の洗浄後、細菌をPBSで再懸濁し、適切な濃度に希釈します。これにより、各マウスに目的のCFUを200 microliterの容量で投与します。次に、細菌が均一に分散するように、滅菌済みのピペットチップで懸濁液を十分に混ぜ合わせます。その後、25ゲージの針を装着した1 mLの安全設計シリンジで、接種液を200 µL吸引します。次に、利き手ではない方の手で、マウスの肩周辺の緩い皮膚をつかんで固定（スクラフ）します。そして、動物ごとに新しい針とシリンジを使用し、200 µLすべての接種液を、膀胱を避けるため正中線からわずかに外側の腹部下限に注射します。ピーク時の感染細菌量を測定するため、感染後3日目に、実験動物の四肢を解剖台の上で仰臥位に固定します。そして、皮膚を70%エタノールで消毒します。滅菌済みのタフカット鋏を用い、胸部から鼠径部にかけて切開します。次に、鼠径部の中央から各膝に向かって、および胸部の中央から各肘に向かって切開します。鈍的に剥離して皮膚を翻転させ、25Gの針で固定します。70% エタノールでさらに筋肉層を消毒します。次に、滅菌済みの微細剪刀を用いて、腹壁に正中切開を加えます。ピンセットで剣状突起を把持してください。剣状突起から開始し、両側に沿って外側に腹壁を切開します。肋骨に沿って横隔膜の直下まで切開することで、肝臓が露出します。次に、滅菌鋏を用いて、片方の葉から約100ミリグラムの組織を切り出します。この組織を、0.2～0.3グラムの1.5～2ミリメーターの酸洗浄済み滅菌ガラスビーズを入れた、あらかじめ重量を量っておいた1.5ミリリッター マイクロ遠心チューブに入れます。そして、ピンセットを用いて腹腔の左側にある臓器をそっと脇に寄せ、脾臓を視認できるようにします。ピンセットを用いて脾臓をそっと掴み、周囲の結合組織を切り離して臓器を腹腔から取り出します。脾臓を肝臓とは別のチューブに入れ、組織を氷を入れた漏れのない容器に入れて研究室に運搬します。ビーズミルホモジナイザーを使用し、周波数を30 hertzに設定してチューブを3分間振盪します。次に、0.1% Triton X-100含有PBSを用いて、ホモジネートの10倍段階希釈系列を調製します。続いて、滅菌スプレッダーを用いて、各希釈ホモジネート100 µLをBHI寒天平板に塗布します。そして、プレートを37 °Cのインキュベーターに移し、一晩培養します。1プレートあたり最大300コロニーまで含まれるプレートを保持します。各プレートのコロニー数を数えます。CT8 T細胞のインターフェロンガンマ応答におけるCD4を測定するため、先に示した通り、病原体を2/4 CFU接種したマウスから脾臓を採取します。脾臓を処理して、単一の赤血球懸濁液を作成します。そして、ペレットをFCSを含む完全RPMI培地を用いて、4 × 10⁶ cells/mLの濃度で再懸濁します。次に、解凍し熱死させたL. monocytogenesと同量の容量の細胞懸濁液1 mLを24ウェルプレートの各ウェルに播種し、冷温の培養物を37 °Cのインキュベーターに入れます。20時間後、各ウェルに1 mLあたり0.66 µLのタンパク質輸送阻害剤を添加し、プレートをインキュベーターに戻します。4時間後、バイオセーフティキャビネット内で500 µLの培養上清を回収し、後でELISA法を用いてinterferon gammaを測定するため、サンプルを-80 °Cで凍結保存します。その後、細胞を1本の滅菌済み15 milliliterチューブに移します。その際、ウェルをPBSで洗浄し、洗浄液を回収した細胞と合わせてフローサイトメトリーによる染色および解析に供します。細菌負荷のピークは、感染から2〜3日後に脾臓で発生します。また、感染前にPPAR Alphaアンタゴニストを投与することで、この負荷を劇的に減少させることができます。感染から7日後、脾臓のCD4陽性およびCD8陽性T細胞を加熱死滅させた病原体を用いてex vivoで再刺激すると、フローサイトメトリーで検出されるように、CD4陽性細胞およびCD8陽性細胞から陽性のインターフェロンガンマ反応が誘導されます。感染前にPPARαアンタゴニストで処理すると、CD4細胞およびCD8細胞によるインターフェロンガンマ反応が促進されます。さらに、PPARαアンタゴニスト処理は、病原体のLD50投与量による感染後の生存率を向上させます。このことは、インターフェロンガンマ反応を調節する新薬が感染後の動物の生存に及ぼす影響を調査する上で、本モデルが有用であることを示しています。これらの手順を習得し、適切に実施すれば、数週間で目的のデータを取得することが可能です。また、モデル抗原を発現する Listeria monocytogenes 株をマウスに感染させ、これらの抗原に特異的な MHC クラス I および II テトラマー試薬を用いることで、本手法をさらに応用できます。これにより、感染後の T 細胞の増殖を測定することが可能になります。開発後、この手法は細胞内病原体に対する宿主免疫におけるインターフェロンガンマの役割を解明するための重要なモデルとなりました。このビデオを視聴することで、C57bl/6マウスの飼育およびlisteria monocytogenesの感染方法について、十分な理解を得ることができます。また、細菌負荷量および感染に対するインターフェロンガンマ応答の測定方法についても習得できます。Listeria monocytogenesを扱うことは、妊婦、乳幼児、高齢者などの免疫不全の方にとって危険であることに留意してください。したがって、本病原体は、バイオセーフティーレベル2の条件下で、免疫能を有する者のみが取り扱う必要があります。

experimental-infection-with-listeria-monocytogenes-as-model-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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出典: Radulovic, K. ほか 腸のバリア突破後に微生物由来産物の進入を模倣するためにマウスにリポポリサカリドを注射すること。 J. Vis.

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Source: Ahn, J. J., et al., Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the preparation of mouse splenocyte cultures from Listeria monocytogenes-infected mice for downstream cytokine analysis. It includes ex vivo bacteria-derived antigen stimulation and sample processing to study T cell responses.

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と実験感染

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