Name: 成体マウスから洞房結節筋細胞の単離、培養、および機能解析のための方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: 学ぶ洞房結節筋細胞の単離と培養法。成体マウスから自発的に活動する洞房結節筋細胞を単離し、電気生理学やイメージング実験に利用する方法を解説。心臓のペースメーカー機構やイオン電流の研究に応用可能。

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原稿を批判的に読んでくださったクリスチャン・リッカート博士に感謝します。この研究は、National Heart Lung and Blood Institute(R01-HL088427)からCPへの助成金によって支援AG000279されました。内容は著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

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</ol>

何一つ。

本論文では、成体マウスから完全に分化洞房結節筋細胞の単離および培養のための詳細なプロトコルを提示します。分離プロトコルは確実に即時の電気生理学的解析やその後の培養のいずれかに適した自然発生的にアクティブなマウスのSAMを生成します。同様のプロトコル（例えば、11,12,10,13-17参考文献を参照）、他の多くのグループによって報告されています。しかし、in vitroで成体マウスのSAMを維持するための我々のプロトコルは、特徴的な形態、自発的活動、および細胞の電気生理学的特性を保持し、タンパク質9のアデノウイルス送達を可能にします。 プロトコルの変更やトラブルシューティングのために、いくつかの重要なステップは、注意すべきです。最初の重要な要因は、劇的にSAMの数と質が与えられたpreparで単離し変更することができる消化酵素（ステップ1.4）の活性の有意なロット間変動であり、エーション。この変動は、典型的には、細胞数と健康を最大化するために、濃度および暴露時間は、いくつかの準備の過程でブラケットすべき多くの固有の最適化...

ペースメーカー、心臓の洞房結節における筋細胞（洞房筋は、「SAMは」）、各ハートビートを開始するために、心筋を介して伝播自発的な、リズミカルな活動電位（APを）を生成します。多くの種から急性単離されたSAMを用いた実験は、ペースメーカー活性の発生に寄与メカニズムの解明のために不可欠でした。 SAMは、形態、機能、およびタンパク質発現の観点から、心房と心室の心筋での対応と実質的に異なる専門性の高い心筋細胞です。 SAMの中の自発的なAPの顕著な特徴は次のAP 1,2をトリガーするしきい値に膜電位を駆動する拡張期に自発的な脱分極です。この「ペースメーカー電位」は、「おかしな電流」（I f）は 、T-およびL型カルシウム電流、およびナトリウム-カルシウム交換体CURRを含む多くの異なった膜電流の協調活性に依存します筋小胞体3,4からのCa 2+放出によって駆動されるENT（I NCX）、。 急性単離したマウスのSAMはペースメーキングの研究に不可欠な実験の準備ですが、マウスSANの不明瞭な解剖学と小さいサイズが微妙な顕微解剖と組み合わせた酵素的および機械を必要とするため、マウスからのSAMの単離は、採用する挑戦的な方法することができます細胞の解離は慎重な最適化が必要。 ここでは正常にパッチクランプ記録5-8のための成体マウスからのSAMを単離するために使用されているプロトコルの詳細なデモビデオを提供しています。我々の知る限りでは、他のソースから入手できるそのような視覚的なデモンストレーションではありません。また、新たな方法は、成体マウスからのSAMの単離された実証される遺伝的にエンコードされ、それによってタンパク質の導入を可能にする、数日間インビトロで維持することができアデノウイルス感染9を介してレポーター分子またはRNAi。

<table><tbody><tr><td>Sylgruard/エラストマーキット</td><td>ダウ コーニング</td><td>184 SIL エラストキット 0.5KG</td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸 9インチパスツールピペット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>小型、丸底培養チューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>352059</td><td></td></tr><tr><td>大型、丸底培養チューブ</td><td>コーニング</td><td>14-959-11B</td><td></td></tr><tr><td>エラスターゼ</td><td>ワージントン生化学</td><td>LS002279</td><td></td></tr><tr><td>リベラーゼTM</td><td>ロシュ</td><td>5401119001</td><td>組織解離液</td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>SAGENT ファーマシューティカルズ&nbsp;</td><td>NDC 25021-400-10</td><td></td></tr><tr><td>マウスラミニン</td><td>コーニング</td><td>CB-354232</td><td></td></tr><tr><td>12 mm丸型ガラスカバースリップフィ</td><td>ッシャー&nbsp;</td><td>12-545-80</td><td></td></tr><tr><td>24ウェル培養プレート</td><td>フィッシャー</td><td>08-772-1</td><td></td></tr><tr><td>Ad-mCherry</td><td>ベクター バイオラボ</td><td>1767</td><td></td></tr><tr><td>Ad-eGFP</td><td>ベクター バイオラボ</td><td>1060</td><td></td></tr><tr><td>プラスチック、使い捨てトランスファーピペット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロハサミ</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>17-467-496</td><td></td></tr><tr><td>デュモン #4鉗子</td><td>Robozの器械</td><td>RS-4904</td><td></td></tr><tr><td>ティッシュ鉗子</td><td>Robozの器械</td><td>RS-8164</td><td></td></tr><tr><td>の解剖の虹彩はさみ</td><td>WPI、Inc.</td><td></td><td></td>501264</tr><tr><td>解剖ピン</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>シグマ</td><td>71376</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>シグマ</td><td>60128</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>60353</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>54457</td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td><td>シグ</td>マ <td>G0350500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl<サブ>2</サブ>シ</td><td>グマ</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>CaCl<サブ>2</サブ></td><td>シグマ</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>タウリン</td> シ<td>グマ</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>シグマ</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>K-グルタミン酸</td><td>シグマ</td><td>G1501</td><td></td></tr><tr><td>K-アスパラギン酸</td><td>シグマ</td><td>A6558</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>クレアチン</td><td>Sigma</td><td>C0780</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Mg-ATP Σ</td><td></td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>アムホテリシンB</td><td>Fisher Scientific</td><td>1397-89-3</td><td></td></tr><tr><td>イソプロテレノール</td><td>カルバイオケム</td><td></td> 420355 <td></td></tr><tr><td>Media199</td><td>Σ</td><td>M4530</td><td></td></tr><tr><td>2,3-ブタンジオン一基 (BDM)</td><td>Σ</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>シグマ</td><td>SH30071</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>Σ</td><td>A5611</td><td></td></tr><tr><td>インスリン&nbsp;&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>I3146</td><td></td></tr><tr><td>トランスフェリン</td><td>シグマ</td><td>I3146</td><td></td></tr><tr><td>セレン</td><td>シグマ</td><td>I3146</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン</td><td>GE ヘルスケア</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトマイシン</td><td>ハイクロン</td><td>SV30010</td><td></td></tr></tbody></table>

成体マウスから洞房結節筋細胞の単離、培養、および機能解析のための方法

Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

洞房結節筋細胞（SAMは）自発的な活動電位（APを）を生成することにより、ビートそれぞれの心を開始し、心臓の自然のペースメーカーとして機能します。これらのペースメーカーAPは多数の膜電流と細胞内カルシウムサイクリングの協調活動を反映しています。しかし、SAMの中で自発的なペースメーカー活性を駆動する正確なメカニズムは、とらえどころのないまま。急性孤立したSAMは、心臓ペースメーカーの分子的基礎を分析するための実験のための不可欠な準備です。しかし、不明瞭な解剖学、複雑な顕微解剖、および気難しい酵素消化条件は急性孤立したSAMの普及を妨げてきました。また、方法は、タンパク質発現の研究​​のためにSAMの長期培養を可能にするために、最近まで利用できませんでした。ここでは、成体マウスからのSAMの単離のためのステップバイステップのプロトコルおよびビデオデモンストレーションを提供しています。この方法はまた、in vitroおよびin expressiのための成体マウスのSAMを維持するために実証されていますアデノウイルス感染を介した外因性タンパク質の上。これらの方法を介して調製急性単離し、培養したSAMは、電気生理学とイメージング研究の多様に適しています。

ここで説明するプロトコルは、以前に別のパッチクランプ研究5-8種々のに適している成体マウスから自発的に活性のSAMを単離するために使用されてきました。また、プロトコルは、最大1週間培養物中に維持することができる単離されたSAMを可能にします。培養細胞への遺伝子導入は、アデノウイルス感染9を介して達成することができます。このセクションに示された結果は、我々の以前の研究から派生し、急性単離し、培養したSAMの特性の例として示されています。 図2に示されるように 、自然発生的に活性なSAMは、最大6日間培養物中に維持することができます。培養した細胞は、有意な平均的な長さ、幅の変化、断面積、または培養の膜容量で、急性孤立したSAMのものと非常に類似している全体的な形態を保持します細胞は急性単離された細胞（ - E ...

方法は、パッチクランプ電気生理学やイメージング研究のための成体マウスから洞房結節筋細胞（のSAM）の単離のために実証されています。単離された細胞を直接使用することができ、またはそのような遺伝的にコードされたレポーターとして、関心対象のタンパク質の発現を可能にするために、培養物中に維持することができます。

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). ...

本手順の総合的な目的は、短期的または中期的な電気生理学的実験およびイメージング実験のために、マウスから自発的に活動する洞房結節心筋細胞を単離することです。単離した洞房結節心筋細胞は、心臓のペースメーカーメカニズム、特に特定のイオン電流や細胞内カルシウム放出のタイミングの研究において重要です。しかし、書面による方法だけでは手順を習得することが非常に困難であるため、マウスの単離洞房結節心筋細胞を使用している研究室は比較的少数にとどまっています。分離に必要なすべての溶液を調製した後、はさみを用いて動物の胸部の毛を除去します。次に、外部組織鉗子と解剖用はさみを使用して肋骨を切断し、胸腔を露出させます。胸腔を、ヘパリンを含む加温した完全Tyrode液 2 mLで洗浄します。解剖顕微鏡下で、内部用剪刀と解剖用ピンセットを用いて、肺と胸腺を慎重に除去します。心尖部をそっと保持しながら、下大静脈と大動脈を慎重に切断し、胸腔から心臓を取り出します。その後、心臓をシリコン製解剖皿のいずれかに移し、加温したヘパリン添加完全Tyrode液 2～4 mL で洗浄します。後方の血管が見え、上を向くように心臓を配置します。次に、心尖部からシリコン解剖皿にピンで固定して、心臓を不動にします。その後、心室と心房の間の溝を確認します。内部解剖用鋏を用いて、心室に沿うように溝に切開を加えます。心房と弁を明確に観察できるよう、必要に応じて温めたヘパリン添加Tyrode完全液を溝と切開部位に洗浄します。その後、溝に沿って切開を続け、心房を心室から分離します。続いて、心房組織を2つ目のシリコン解剖皿に移し、加温したヘパリン入り完全Tyrode液 3 mLで洗浄します。その後、組織を軽く伸ばしながら、下大静脈を通してピンで固定します。次に、動物の右心房が実験者の左側に、左心房が実験者の右側にくるように組織を反転させます。正しい組織を単離するためには、方向を確認し認識することが非常に重要です。上大静脈、次いで右心房および左心房の耳状突起を通して組織をピンで固定します。作製物を明確に観察できるよう、残っている脂肪やその他の組織を除去します。続いて、大静脈を切断して心房の前壁を開きます。必要に応じてシャーレを回転させ、上大静脈と下大静脈の両方を解剖します。心房中隔を視認できるように、必要に応じてピンの位置を調整します。次に、心房中隔に沿って切開し、左心房を取り除きます。標本をピンで固定し直し、ゆっくりと広げて、洞房結節の背後にある脂肪を除去します。その後、右心房耳を切り離し、心房耳の縁に沿って濃いオレンジ色の線状に見える末端稜に沿って切開することで、洞房結節を遊離させます。結節組織をピンで留め直すか、あるいはピンを外し、側方向に切断して同じ大きさのストリップを3本作成します。この手順では、細い火炎研磨ピペットを用いて、洞房結節組織のストリップ3本を、2.5 millilitersの低カルシウム・マグネシウムTyrode液を含む3本の小型丸底チューブのうちの1本目に移し、5分間インキュベートします。5分後、組織ストリップを2.5 millilitersの低カルシウム・マグネシウムTyrode液を含む2本目の小型丸底チューブに移します。チューブを静かに回旋させるか、細いピペットで緩やかにピペッティングして、組織片を洗浄します。チューブを転倒させないでください。その後、組織片を2.5 millilitersの低カルシウム・マグネシウムTyrode液が入った3本目の小型ラウンドボトムチューブに移し、洗浄工程を繰り返します。その後、ストリップを、酵素を含む2.5 millilitersの低カルシウム・マグネシウムTyrode液が入った大型の丸底チューブに移します。5分ごとにチューブを静かに回旋させて混合します。酵素消化後、細い火研磨ピペットを用いて、組織ストリップを、修正KB溶液が入った3本の小型丸底チューブのうちの1本目に静かに移します。次に、組織を洗浄するため、ストリップを2番目と3番目の小型ラウンドボトムチューブへと順に移動させ、その後にKB溶液が入った大型ラウンドボトムチューブに移します。より太い火炎滅菌済みピペットを用い、大型ラウンドボトムチューブ内の細胞を絶えずトリチュレーション（ピペッティング）して分散させます。その際、分散用のチューブを35 °Cの恒温水槽に浸したままにし、溶液中に気泡が入らないように注意してください。溶液を1秒間に約1回（1 Hz）の頻度で力強く押し出す方法が最適であることがわかっています。次に、組織に塩化ナトリウム・塩化カルシウム適応溶液を75 µL加えます。静かに回旋させて混ぜ、5分間インキュベートします。書面によるプロトコルに記載されている通り、カルシウムを段階的に添加し続けてください。カルシウム再適応後、細胞を約10分間静置するか、2,000 ×gで3分間遠心分離して、洞房結節心筋細胞を回収します。急性に単離した細胞の場合、転送ピペットを用いて上清を約5 mL慎重に取り除き、廃棄します。その後、パッチクランプ実験のために、細胞を室温で最大8時間まで保存します。その後、単離した洞房結節心筋細胞の機能評価は、自発的な活動電位および膜電流のパッチクランプ記録を用いて行うことができます。自発的に活動する洞房結節心筋細胞は、最長6日間まで培養で維持することが可能です。培養細胞は、急性に単離した洞房結節心筋細胞と非常に類似した全体的な形態を保持しており、急性に単離した細胞と比較して、培養細胞の平均的な長さ、幅、断面積、または膜容量に有意な変化は見られません。これらの細胞は、電流クランプおよび電位クランプ記録などの幅広い実験的研究に適しています。ここでは例として、自発的な活動電位とfunny電流を示しています。洞房結節の摘出、単離、およびカルシウムの再導入に習熟すれば、約2時間で完了できるため、実験に使用できる細胞を迅速に準備することが可能です。本手順を実施する際は、良好な解剖を行うために組織の向きが極めて重要であること、および酵素的・機械的な解離ステップを本文の記載に従って最適化すべきであることを念頭に置いてください。本手順で単離した洞房結節心筋細胞は、単一細胞電気生理学、カルシウムイメージング、免疫細胞化学など、さまざまな実験に使用できます。また、遺伝子操作やレポーター分子の発現を必要とする実験のために、これらの細胞を培養状態で維持することも可能です。このビデオを視聴することで、成マウスから洞房結節心筋細胞を単離する方法について十分に理解していただけるはずです。皆様の実験の成功を願っております。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオでは、マウスの心臓から洞房結節またはSANを分離する手順を示しています。SANは、自発的な活動電位を生成することによって心拍を開始する洞房細胞を収容します。...

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ここでは、成体マウスおよびラット心筋細胞の分離、トランスフェクション、および長期培養のためのプロトコルを提示する。...

成人マウスおよびラット心筋細胞の分離、トランスフェクション、長期培養

単成マウス心臓の心房と心室の両方から筋細胞と非筋細胞を同時に分離する方法について説明する。このプロトコルは、高生存性心筋細胞および非筋細胞の一貫した収量をもたらし、フェノタイピングおよびインビトロ分析のための最適な細胞特異的培養条件を詳述する。...

心房筋細胞、心室筋細胞、および非筋細胞の同時分離と培養

前向き灌流法により、高品質のマウスの心臓細胞を単離するためのシンプルe...

マウスからの心筋細胞分離のための前向きの灌流法

マウスモデルは、不整脈形成の重要なメカニズムを研究することを可能にする。そのためには、パッチクランプ測定を行うために高品質の心筋細胞が必要です。ここでは、カルシウム一過性物質とL型カルシウム電流を同時に測定できる逆行性酵素ベースのランゲンドルフ灌流を介してマウス心房筋細胞と心室筋細胞を分離する方法について説明します。...

Ca2+過渡現象とL型カルシウム電流の同時測定のための高品質マウス心房および心室筋細胞の分離

ここで紹介するプロトコルは、マウス心臓の洞房結節(SAN)および房室結節(AVN)領域から心臓常在マクロファージを単離するための段階的なアプローチを提供します。...

マウス洞房・房室結節からの常在型心臓マクロファージの単離と培養

このプロトコルは、成体マウスからの心房および心室筋細胞の同時分離のための大歯カンヌレーションの深さを含むランゲンドルフ法の修飾を記述する。...

成体マウスからの心房と心室筋細胞の同時分離のためのランゲンドルフ法の改変

学ぶ洞房結節筋細胞の単離と培養法。成体マウスから自発的に活動する洞房結節筋細胞を単離し、電気生理学やイメージング実験に利用する方法を解説。心臓のペースメーカー機構やイオン電流の研究に応用可能。

成体マウスから洞房結節筋細胞の単離、培養、および機能解析のための方法

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