成体マウスから洞房結節筋細胞の単離、培養、および機能解析のための方法

この手順の全体的な目標は、短期または中期の電気生理学的またはイメージング実験のために、マウスから自発的に活動的な洞房結節筋細胞を分離することです。単離された洞房結節筋細胞は、心臓のペースメイキングメカニズムの研究、特に特定のイオン電流の研究や細胞内カルシウム放出のタイミングの研究にとって重要です。しかし、マウスから単離された洞房筋細胞を使用する研究室は比較的少なく、その理由の一つは、書かれた方法だけで手順を学ぶのが非常に難しいためです。

隔離に必要なすべての解決策を準備した後、はさみで動物の胸から毛皮を取り除きます。次に、胸郭を横断して、外部組織鉗子と解剖ハサミを使用して胸腔を露出させます。ヘパリンで温めた完全なTyrode'sの2ミリリットルで胸腔をすすぎます。

解剖顕微鏡で、内部のはさみと解剖鉗子を使用して肺と胸腺を慎重に取り除きます。心臓の頂点を優しく握りながら、下大静脈と大動脈を丁寧に切開して胸腔から心臓を取り出します。次に、心臓をシリコン解剖皿の1つに移し、2〜4ミリリットルの温めたヘパリン処理された完全なタイロードですすいでください。

後部血管が見え、上を向くように心臓を向けます。次に、心臓を頂点からシリコン解剖皿に固定して固定します。その後、心室と心房の間の溝を見つけます。

内部解剖ハサミを使用して、溝を心室に近づけたまま溝を切開します。必要に応じて、追加の温めたヘパリン処理された完全なTyrode'sで溝と切開部を洗い流し、心房とバルブがはっきりと見えるようにします。次に、溝に沿って切断を続けて、心房を心室から分離します。

続いて、心房組織を2番目のシリコーン解剖皿に移し、3ミリリットルの温めたヘパリン処理された完全なタイロードですすいでください。その後、製剤を優しく伸ばしながら、下大静脈に組織を固定します。次に、組織を裏返して、動物の右心房が実験者の左側に、左心房が実験者の右側になるようにします。

正しい組織を分離するためには、向きを取得して認識することが非常に重要です。上大静脈、次に左右の心房付属器を通して組織を固定します。残りの脂肪やその他の組織をすべて取り除き、製剤がはっきりと見えるようにします。

その後、大静脈を切開して心房の前壁を開きます。必要に応じて皿を回転させて、上大静脈と下大静脈の両方を解剖します。必要に応じてピンの位置を変えて、心房中隔を視覚化します。

次に、心房中隔に沿って切断して、左心房を切除します。調製物を再度ピンで固定し、優しく伸ばし、洞房結節の後ろから脂肪を取り除きます。その後、右心房付属器を切除し、心房付属器に接する濃いオレンジ色の縞として現れるクリスタ終末に沿って切断することにより、洞房結節を解放します。

節部組織を再度ピン留めまたはピン留め解除し、横方向に切断して、同じサイズの3つのストリップを作成します。この手順では、ナローファイヤーポリッシュピペットを使用して、洞房結節組織の3つのストリップを、2.5ミリリットルの低カルシウムマグネシウムチロードを含む3つの小さな丸底チューブの最初のものに移し、5分間インキュベートします。5分後、ティッシュストリップを2.5ミリリットルの低カルシウムマグネシウムチロードが入った2番目の小さな丸底チューブに移します。

ティッシュストリップを洗浄するには、チューブを静かに回転させるか、細いピペットで優しくピペッティングします。チューブを反転させないでください。次に、ティッシュストリップを2.5ミリリットルの低カルシウムマグネシウムチロードが入った3番目の小さな丸底チューブに移し、洗浄手順を繰り返します。

その後、2.5ミリリットルの低カルシウムマグネシウムチロードと酵素を含む大きな丸底チューブにストリップを移します。チューブを静かに渦巻かせて5分ごとに混ぜます。酵素消化後、細いファイヤーポリッシュピペットを使用して、組織ストリップを修飾KB溶液を含む3つの小さな丸底チューブの最初のチューブに穏やかに移します。

次に、ストリップを2番目と3番目の小さな丸底チューブに通して組織を洗浄し、KB溶液を含む大きな丸底チューブに移します。大型のファイヤーポリッシュピペットを使用して、解離チューブを摂氏35度のウォーターバスに沈め、溶液に気泡が入らないように注意しながら、一定のトリチュレーションにより大きな丸底チューブ内の細胞を解離します。私たちは、約1秒あたりまたは1ヘルツの頻度で溶液を強制的に排出するのが最も効果的であることがわかりました。

次に、75マイクロリットルの塩化ナトリウム塩化カルシウム適応溶液を組織に加えます。穏やかに渦を巻いて混ぜ合わせ、5分間インキュベートします。書かれたプロトコルに概説されているように、カルシウムを段階的に追加し続けます。

カルシウムの再適応に続いて、それらを約10分間落ち着かせるか、または2, 000倍gで3分間遠心分離することにより、洞房筋細胞を収集します。急性単離細胞の場合は、トランスファーピペットを使用して約5ミリリットルの上清を静かに除去して廃棄します。その後、パッチクランプ実験のために細胞を室温で最大8時間保存します。

その後、単離された洞房筋細胞の機能評価は、自発的な活動電位と膜電流のパッチクランプ記録を使用して行うことができます。自発的に活動的な洞房筋細胞は、最大6日間培養中に維持できます。培養細胞は、急性単離された洞房筋細胞と非常によく似た全体的な形態を保持しており、急性単離細胞と比較して、培養細胞の平均長さ、幅、断面積、または膜容量に大きな変化はありません。

このセルは、電流および電圧クランプ記録など、さまざまな実験的研究に適しています。ここでは、自発的な活動電位と面白い電流を例として示しています。習得すると、洞房結節の解剖、単離、およびカルシウムの再導入を約2時間で完了できるため、実験に使える細胞を準備できます。

この手順を試みる際には、組織の向きが良好な解剖にとって重要であり、酵素的および機械的解離ステップはテキストで概説されているように最適化する必要があることを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、単離された洞房結節筋細胞は、シングルセル電気生理学、カルシウムイメージング、免疫細胞化学などのさまざまな実験に使用できます。また、遺伝子操作やレポーター分子の発現を必要とする実験のために、細胞を培養液に保持することもできます。

このビデオを見た後、成体マウスから洞房筋細胞を分離する方法をよく理解しているはずです。あなたの実験に幸運を祈ります。