Name: Adenofection：枯渇-レスキュー実験によって細胞Morphodynamicsにおける分子シャペロンの役割を研究するための方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 34 s
Description: 学ぶアデノフェクション法による枯渇-レスキュー実験で、細胞形態動態における分子シャペロンの役割を単一細胞レベルで解析する方法です。細胞恒常性を保ちながらタンパク質機能を詳細に研究できます。

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この作業は、カナダ衛生研究所（助成金番号7077）、およびベリーニ財団とロビー・フォンダツィオーネの支援を受けました。

<ol><li>Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+with+engineered+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome editing with engineered zinc finger nucleases.</a> Nat Rev Genet. 11 (9), 636-646 (2010).</li>
<li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).</li>
<li>Boettcher, M., McManus, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choosing+the+Right+Tool+for+the+Job%3A+RNAi%2C+TALEN%2C+or+CRISPR%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Choosing the Right Tool for the Job: RNAi, TALEN, or CRISPR.</a> Mol Cell. 58 (4), 575-585 (2015).</li>
<li>Natarajan, K., Rajala, M. S., Chodosh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+IL-8+expression+following+adenovirus+infection+is+mediated+by+c-Src+activation+in+human+corneal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Corneal IL-8 expression following adenovirus infection is mediated by c-Src activation in human corneal fibroblasts.</a> J Immunol. 170 (12), 6234-6243 (2003).</li>
<li>Yousuf, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveolin-1+associated+adenovirus+entry+into+human+corneal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Caveolin-1 associated adenovirus entry into human corneal cells.</a> PLoS One. 8 (10), e77462(2013).</li>
<li>Morton, P. E., Hicks, A., Nastos, T., Santis, G., Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+regulates+epithelial+cell+junction+stability+through+control+of+E-cadherin+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">CAR regulates epithelial cell junction stability through control of E-cadherin trafficking.</a> Sci Rep. 3, 2889(2013).</li>
<li>Carra, S., Seguin, S. J., Lambert, H., Landry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HspB8+chaperone+activity+toward+poly%28Q%29-containing+proteins+depends+on+its+association+with+Bag3%2C+a+stimulator+of+macroautophagy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">HspB8 chaperone activity toward poly(Q)-containing proteins depends on its association with Bag3, a stimulator of macroautophagy.</a> J Biol Chem. 283 (3), 1437-1444 (2008).</li>
<li>Fuchs, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+key+structural+motifs+involved+in+HspB8%2FHspB6-Bag3+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Identification of the key structural motifs involved in HspB8/HspB6-Bag3 interaction.</a> Biochem J. 425 (1), 245-255 (2010).</li>
<li>Rosati, A., Graziano, V., De Laurenzi, V., Pascale, M., Turco, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAG3%3A+a+multifaceted+protein+that+regulates+major+cell+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">BAG3: a multifaceted protein that regulates major cell pathways.</a> Cell Death Dis. 2, e141(2011).</li>
<li>Guilbert, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGuilbert%2C+SM+%22The+Big+Book+of+Small+Heat+Shock+Proteins%22">The Big Book of Small Heat Shock Proteins</a>. Tanguay, R. M., Hightower, L. E. , Springer International Publishing AG. 435-456 (2015).</li>
<li>Fasbender, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexes+of+adenovirus+with+polycationic+polymers+and+cationic+lipids+increase+the+efficiency+of+gene+transfer+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Complexes of adenovirus with polycationic polymers and cationic lipids increase the efficiency of gene transfer in vitro and in vivo.</a> J Biol Chem. 272 (10), 6479-6489 (1997).</li>
<li>Toyoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+polymer+and+lipids+enhance+adenovirus-mediated+gene+transfer+to+rabbit+carotid+artery%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Cationic polymer and lipids enhance adenovirus-mediated gene transfer to rabbit carotid artery.</a> Stroke. 29 (10), 2181-2188 (1998).</li>
<li>Fasbender, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+adenovirus+in+calcium+phosphate+precipitates+enhances+gene+transfer+to+airway+epithelia+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Incorporation of adenovirus in calcium phosphate precipitates enhances gene transfer to airway epithelia in vitro and in vivo.</a> J Clin Invest. 102 (1), 184-193 (1998).</li>
<li>Fuchs, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Role+for+the+Chaperone+Complex+BAG3-HSPB8+in+Actin+Dynamics%2C+Spindle+Orientation+and+Proper+Chromosome+Segregation+during+Mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A Role for the Chaperone Complex BAG3-HSPB8 in Actin Dynamics, Spindle Orientation and Proper Chromosome Segregation during Mitosis.</a> PLoS Genetics. 11 (10), e1005582(2015).</li>
<li>Champagne, C., Landry, M. C., Gingras, M. C., Lavoie, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+adenovirus+type+2+early+region+4+ORF4+cytoplasmic+death+function+by+direct+binding+to+Src+kinase+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Activation of adenovirus type 2 early region 4 ORF4 cytoplasmic death function by direct binding to Src kinase domain.</a> J Biol Chem. 279 (24), 25905-25915 (2004).</li>
<li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifeact%3A+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).</li>
<li>Takahashi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+Akt+signaling+regulates+blood+vessel+recruitment+during+myofiber+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Myogenic Akt signaling regulates blood vessel recruitment during myofiber growth.</a> Mol Cell Biol. 22 (13), 4803-4814 (2002).</li>
<li>Murray, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-apoptotic+role+for+caspase-9+in+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A non-apoptotic role for caspase-9 in muscle differentiation.</a> J Cell Sci. 121 (Pt 22), 3786-3793 (2008).</li>
<li>Terada, K., Misao, S., Katase, N., Nishimatsu, S., Nohno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+Wnt+Signaling+with+BMP%2FSmad+Signaling+during+the+Transition+from+Cell+Proliferation+to+Myogenic+Differentiation+in+Mouse+Myoblast-Derived+Cells%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Interaction of Wnt Signaling with BMP/Smad Signaling during the Transition from Cell Proliferation to Myogenic Differentiation in Mouse Myoblast-Derived Cells).</a> Int J Cell Biol. 2013, 616294(2013).</li>
<li>Hindi, S. M., Tajrishi, M. M., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+mechanisms+in+mammalian+myoblast+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Signaling mechanisms in mammalian myoblast fusion.</a> Sci Signal. 6 (272), re2(2013).</li>
<li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+%283rd+edition%29%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition).</a> Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここでは、化学量論およびタンパク質複合体と高分子構造の動力学に影響を与えるタンパク質の過剰発現に特に感受性である細胞生物学的過程の機能的分析にも適用可能であるデプレッションレスキュー実験を行うことができる方法を記載しました。有糸分裂細胞分裂は、細胞の全体的な構造の中で最も劇的な壮大な変化を伴う細かく調整された細胞morphodynamicsの極端な例です。細胞イメージングのためのアクチンとチューブリンマーカーの低いが検出可能な量を導入するために、市販のBacMamによって試薬と組み合わせadenofectionを使用して、適切な有糸分裂細胞のリモデリングへのシャペロン複雑BAG3-HSPB8の寄与を明確に示すことができました。フックスらによる最近の研究では、BAG3の枯渇ができないことに関連している主軸方位の欠陥は、剛性有糸分裂アクチン皮質を確立し、アクチン豊富な組み立てになり示されています後退繊維14。適切なスピンドルダイナミクスもBAG3サイレンシング時のHSPB8レベルで見られる減少を補正し、野生型BAG3-GFPの再導入によって回復することができました。これはadenofectionは、ス...

哺乳動物細胞における遺伝子発現の機能的不活性化は、タンパク質の機能を分析するためのゴールドスタンダードです。新たにこのようなジンクフィンガーヌクレアーゼなどの部位特異的ヌクレアーゼの使用に基づくゲノム編集の技術を開発し、クラスタ化され、定期的にinterspaced短いパリンドローム反復（CRISPR）は/ CAS9は現在、標的遺伝子の欠失突然変異1,2を有する細胞株の生成を可能にします。これらの新規のアプローチは、我々は、タンパク質の機能およびヒト疾患の遺伝学の我々の理解を勉強している方法に革命を起こす必要があります。いくつかの例では、しかしながら、長期的または完全な遺伝子ノックアウトは望ましくなく、二次電池の補償機構を誘発することができます。遺伝的に改変された細胞株の生成は、限られた増殖能を有する初代細胞培養物を扱う場合にも制限することができ、または様々な細胞型における変異の大規模なセットのスクリーニングが求められている場合。これは、多くの場合、セルbの依存性を決定するために必要とされますタンパク質の構造要件にiologicalプロセス。そのために、様々な細胞背景の一過性の枯渇、レスキュー実験を可能にするRNA干渉による可逆的ノックダウンは、まだ構造機能が関心3のタンパク質の解析を実行するためにシンプルで強力なアプローチのまま。しかし、このアプローチの主な欠点は困難効率的なサイレンシングを達成するために、細胞集団の大部分の近生理的レベルで目的のタンパク質またはその変異体を再導入することです。これは、タンパク質 - タンパク質相互作用上のインスタンスのために、細胞集団ベースのアッセイに見られるもので、単一細胞（低形質の表現型）のレベルで見られる機能的効果を相関しようとする総合的な研究を可能にすることが重要です。 古典的なトランスフェクション法を使用して、1はほとんどの細胞の大集団での外因性タンパク質の均質かつ低発現を達成することはできません。組換えウイルスによる細胞の形質導入アデノウイルスのように、多くの場合、外因性タンパク質のより多くの正規化された発現を可能にします。しかし、アデノウイルスの取り込みは、非ヒト細胞に存在しないか、または弱くしかいくつかのヒト細胞型において発現されるCAR受容体によって制限されます。さらに、アデノウイルスの細胞侵入は、細胞の形状および接着4-6を制御するシグナル伝達経路を活性化させます。セルmorphodynamicsの調節機構を研究するとき、これは明らかに望ましくありません。我々は細胞分裂とアクチンダイナミクスに、シャペロン複合体、BAG3-HSPB8の機能解析を行ったとき、私たちはこの問題に直面していました。先駆的な仕事はストレス7,8間のタンパク質の品質管理とオートファジーで、このシャペロン複合体の役割を説明していました。これらの研究のほとんどは、しかし、シャペロンは、通常、ストレスの間にアップレギュレートされていると仮定すると、タンパク質の過剰発現に依存していました。これはBAG3は、HSPB8との複合体で、目を発現する分裂細胞の正常な動作に寄与することができるかどうかの質問を開いたままにしています多くの癌細胞タイプ9のようなESEシャペロン。具体的には、シャペロン複合体は、HSPBシャペロンおよび細胞骨格のダイナミクス10との間に新興の接続与えられた非常に興味深いした有糸分裂の進行を制御するアクチンベースの構造のリモデリングに寄与するかどうか。この問題に対処するために、我々は、有糸分裂の進行又は細胞形態を妨害しない、および細胞形状変化を調節する高分子複合体の力学の二次摂動を回避するために、タンパク質恒常性を維持することになる空乏レスキュー実験のための効率的な方法を開発しようとしました。 。このように理想的には、目的の遺伝子の枯渇-追加バックが同時に行われるべきです。 カチオン性ポリマーまたは脂質とアデノウイルスとの複合体の使用は、 インビトロおよびインビボ 11,12 における遺伝子導入を促進するために記載されています。例えば、リン酸カルシウム（CAPI）を、沈殿物を形成するように見えますCAR非依存的経路13を介してウイルス結合エントリを向上させるアデノウイルス。実際、我々は、カチオン性化合物を用いて、アデノウイルスベースの細胞形質導入およびトランスフェクションを組み合わせること枯渇レスキュー実験の効率を高めることができることを見出しました。これは、大部分の近内因性レベルで外因性タンパク質の発現を調節するために細胞株を、目的の遺伝子に応じて、我々は20倍に3によりウイルス量を低下させ、より広い窓から利益細胞形態への影響を最小限に抑えながら、目的の細胞集団の。このような条件下では、我々はまた、内因性タンパク質の発現（&gt; 75％）の高効率ノックダウンを達成することができました。我々はここ生理ROの機能解析のための方法が適して、ステップによって方法ステップを説明し、熱ショックタンパク質ファミリーのストレス誘発シャペロンの不変のレベルによって評価されるようなタンパク質の恒常性が著しく乱されていないという証拠を提供しますタイムラプスビデオ顕微鏡による分子シャペロンのル。プロトコルは、有糸分裂の進行中に、通常のアクチンベースとスピンドルダイナミクスとの干渉が最小で、セル同期手続きへと蛍光マーカーの低レベルの共発現のために市販のバキュロウイルスの使用に適しています。我々はさらに、in vitroで筋管への筋芽細胞分化に有意な影響を与えたマウスC2C12細胞を、「形質導入するためにハード」に適用される方法の汎用性を示しています。

<table><tbody><tr><td>C2C12 マウス筋芽細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>アデノウイルス カスタムデザイン</td><td>Welgen</td><td>カスタムデザイン</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>CellLight&reg;Actin-GFP, BacMam 2.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>C10582</td><td></td></tr><tr><td>CellLight&reg;チューブリン-RFP、BacMam 2.0</td><td>サーモフィッシャー</td><td>C10614</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ'修正されたイーグル」s medium (DMEM), High Glucose</td><td>Thermo Fisher</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>ガラス底皿, 35 mm</td><td>MatTek Corperation</td><td>P35G-1.5-20-C Case</td><td></td></tr><tr><td>HeLa-RFP-H2B</td><td>Sabine Elowe 博士の親切な贈り物,クアキュート;bec, Canada</td><td></td><td>Klebig C et al. 2009</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>Horse Serum, New Zealand</td><td>Thermo Fisher</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>Scientific BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Thermo</td><td>Fisher 25030081</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine&reg;RNAiMAX トランスフェクション試薬</td><td>サーモフィッシャー</td><td>13778-150</td><td></td></tr><tr><td>ミニマルエッセンシャルメディウム(MEM)アルファ</td><td>ウィセント</td><td>310-101-CL</td><td></td></tr><tr><td>ミニマルエッセンシャルメディウム(MEM)アルファ(デオキシリボヌレオシド/リボヌクレオシドなし</td><td>) サーモフィッシャー</td><td>12000-022</td><td></td></tr><tr><td>ミニマルエッセンシャルメディウム(MEM)アルファ(フェノールなし</td>) <td>サーモフィッシャー</td><td>41061-029</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</sub</td><td>>Biobasic</td><td>S0404</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>Scientific BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>rAVCMV-LifeAct-TagGFP2</td><td>IBIDI</td><td>60121</td><td></td></tr><tr><td>siRNA二本鎖</td><td>Dharmacon</td><td>カスタムデザイン</td><td></td></tr><tr><td>チミジン</td><td>シグマ</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン2.5%</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャー15090-046</td><td></td></tr></tbody></table>

adenofection：枯渇-レスキュー実験によって細胞morphodynamicsにおける分子シャペロンの役割を研究するための方法

Adenofection: A Method for Studying the Role of Molecular Chaperones in Cellular Morphodynamics by Depletion-Rescue Experiments

このような有糸分裂および細胞分化などの細胞プロセスは、主に細胞の細胞骨格構造の適切な改造に依存している細胞形状の変化によって支配されています。これは、与えられた時間と場所での高次高分子構造の組立・分解、タンパク質の過剰発現によって引き起こされる摂動に特に敏感であるプロセスを含みます。タンパク質恒常性を維持し、周辺対正常な細胞形態を維持することができる方法は、細胞プロセスの広い範囲で、目的のタンパク質の機能的寄与を決定することが非常に望ましいです。 RNA干渉に基づいて、過渡枯渇-レスキュー実験は、タンパク質の機能と構造要件を分析するための強力なアプローチです。しかし、その生理学的レベルからの最小偏差で標的タンパク質の再導入は、本当の挑戦です。ここでは、分子シャペロンの役割を研究するために開発された方法と呼ばれるadenofectionを説明D分裂細胞の正常な動作のパートナーとアクチンリモデリングとの関係。 HeLa細胞は、3&#39;UTR領域を標的とするsiRNA二重鎖とBAG3を枯渇させました。 GFPタグBAG3タンパク質は、トランスフェクション試薬に結合された組換えアデノウイルスを用いた細胞の&gt; 75％の中に同時に再導入しました。 Adenofectionはストレス応答の不存在下で、BAG3枯渇HeLa細胞における近生理学的レベルでBAG3-GFPタンパク質を発現することが可能。効果は、内因性熱ショックタンパク質シャペロン、タンパク質ホメオスタシスの主なストレス誘導性調節因子のレベルで観察されませんでした。さらに、細胞の形質導入、トランスフェクションの時に蛍光マーカーの発現を駆動するバキュロウイルスを追加することによって、我々は、タイムラプス顕微鏡によって有糸分裂細胞動態を分析できた通常の有糸分裂の進行の最小摂動と分析しています。 Adenofectionは、ハードに感染さマウスの細胞にも適用し、筋芽細胞デフの機能解析に適しています筋管にerentiation。したがってadenofection高次の細胞骨格の動態に依存感受性生物学的プロセスに関与するタンパク質の分析構造機能を実行するための多用途の方法を提供します。

カチオン性脂質を用いて、BAG3-GFPプラスミドDNAのトランスフェクションは、いくつかの細胞が非常に高いBAG3レベル（ 図2A）を有するタンパク質及びその他のかろうじて検出可能なレベルを示す、HeLa細胞における異種の発現と関連していました。これらの細胞において、タンパク質ホメオスタシスの喪失は核周囲凝集体（ 図2A、矢印）にBAG3-GFPの蓄積により証明されました。これとは対照的に、BAG3-GFPを運ぶアデノウイルスと細胞形質導入は、より均質な低発現とBAG3-GFP（ 図2B、単独の感染症）の正確な局在を示しました。それが細胞（ 図2B、Adenofection）の大部分で均質な表現を維持許さながら驚くべきことに、アデノウイルス形質導入（ すなわち 、アデノウイルス粒子のトランスフェクション）中のカチオン性脂質の添加は著しく、同様のMOIで細胞あたりのBAG3-GFPの発現を増加させました。 <p ...

私たちは、細胞の完全性とタンパク質の恒常性を維持する枯渇救済実験の方法を説明しています。アデノフェクションは、有糸分裂細胞分裂や筋形成など、アクチンベースの微細なダイナミクスに依存する生物学的プロセス内のタンパク質を単一細胞レベルで機能解析することを可能にします。

Adenofection：枯渇-レスキュー実験によって細胞Morphodynamicsにおける分子シャペロンの役割を研究するための方法

Cellular processes such as mitosis and cell differentiation are governed by changes in cell shape that largely rely on proper remodeling of the cell ...

この手法の全体的な目的は、単一細胞レベルでの生物学的プロセスの機能解析に向けて、細胞の完全性とタンパク質のホメオスタシスを維持した条件下で、枯渇レスキュー実験を可能にすることです。この手法は、有糸分裂や細胞分化などの細胞動態におけるタンパク質の機能や構造要件に関する重要な疑問を解決するのに役立ちます。本手法の主な利点は、標的タンパク質を枯渇させると同時に、細胞集団の大部分において、そのタンパク質の変異体を生理的レベルに近い状態で再導入できることです。まず、ガラス底ディッシュをフィブロネクチンでコーティングします。1 mg/mLのフィブロネクチンストック溶液を、滅菌PBSで100倍に希釈して使用します。表面全体を覆うように、各35 mLディッシュに1 mLずつ加えます。37 °C、5% CO2条件下で1時間インキュベートします。インキュベーションの間、10% FBSを添加したalpha MEMと、0.05% trypsin EDTAの分注液を37 °Cに予熱しておきます。45分間のインキュベーション後、細胞溶液の調製を開始します。HeLa-RFP-H2B細胞を培養した10 centimeterプレートから培地を吸引します。その後、0.05% trypsin EDTA 1.5 millilitersを用いて、緩やかに2回洗浄します。最後に吸引した後、プレートに0.5 millilitersのtrypsin EDTAを残し、37 °C、5% carbon dioxideで2～3分間、細胞をインキュベートします。プレートを軽く叩き、顕微鏡下で細胞層を観察して、すべての細胞が剥離したことを確認します。次に、10 millilitersの培地を加え、緩慢に数回ピぺッティングして細胞を分散させ、細胞懸濁液を15 milliliterチューブに移します。ヘモサイトメーターを用いて、細胞懸濁液の10 µLサンプルを計数します。次に、ガラスボトムディッシュからフィブロネクチン溶液を吸引します。細胞を播種する前に、フィブロネクチンを乾燥させないようにしてください。2 mLの培地を用いて、35 mmディッシュ1枚あたり1.5×10⁵個の細胞を播種するための細胞懸濁液を調製します。ウイルス導入前の細胞数をカウントするため、条件数に加えてさらに1枚の35 mmプレートを播種します。30〜45分間インキュベートします。インキュベート時間が経過した後、顕微鏡下で細胞を確認し、ここに見られるように細胞が十分に分散していることを確認します。プレートをインキュベーターに戻し、翌日まで細胞を培養します。播種した翌日に、細胞密度が少なくとも50%に達していることを確認します。細胞密度が50%を下回ると、ウイルスの導入効率が低下し、細胞あたりのタンパク質発現のばらつきが増大し、細胞毒性が高まります。次に、以前と同様に、予備の播種皿から細胞を回収して細胞数をカウントします。細胞を効率的に導入するために必要なウイルスの量を算出します。各条件ごとに1.5 milliliterのマイクロセントリフュージチューブにラベルを貼り、400 microlitersの温めたalpha MEM minusを加えます。氷上でウイルスの分注量をゆっくりと融解させた後、必要な量の各ウイルスをチューブに加え、ピペッティングで穏やかに混合します。次に、細胞から培地を吸引した後、ウイルス混合液をゆっくりと滴下します。細胞を37 degrees Celsius、5%carbon dioxideの条件下でインキュベートします。1時間のあいだ15分おきに、滅菌フード内でプレートを慎重に揺らし、細胞全体がウイルスで覆われるようにします。少量の培地を用いることで、ウイルスと細胞の接触を促進させます。インキュベーション後、各プレートに1.6 millilitersのalpha MEM minusを緩やかにピペッティングし、合計容量を2 millilitersにします。次に、2 millimolarのチミジンを添加して細胞周期の同期を開始し、さらに2時間インキュベートします。その間に、マイクロチューブに滅菌水 139 µL、1 M 塩化カルシウム 50 µL、および 20 µM siRNA 11 µL を加え、siRNAトランスフェクションミックスを調製します。siRNAが不要な場合は、siRNAと同量を滅菌水に置き換えて、空のトランスフェクション（コントロール）を行います。塩化カルシウムsiRNA混合液に、HBSS-2X溶液をゆっくりと滴下します。200 µLピペットを用いて空気注入により2回緩やかに混合します。沈殿が小さいほどトランスフェクション効率が向上するためです。その後、この混合液を室温で30分間インキュベートします。インキュベーション後、各プレートに 200 µL をゆっくりと滴下し、撹拌して混ぜ合わせます。プレートを 37 °C、5% CO2 下で16時間インキュベートします。翌日、ディッシュをインキュベーターから取り出し、組織培養フードへ移動させます。温めたHEPESで細胞を2回、2 mLずつ洗浄した後、2 mLのalpha MEM minusを添加し、再びインキュベーターに戻します。7時間後、プレートに2 mMのチミジンを添加し、インキュベーターに戻します。温度変化が細胞周期の長さに影響するため、一度に操作する細胞プレートは4枚までとしてください。翌日、siRNAのトランスフェクションおよびウイルス感染から48時間後に、温めたPBS 2 mLで細胞を2回洗浄し、ライブセルイメージング用にフェノールレッド不含の$\alpha$-MEM 2 mLを添加します。そのまま7時間インキュベートします。加湿された5%二酸化炭素制御の温度調節チャンバーを備えた倒立顕微鏡を用いて、有糸分裂期の細胞の短期的ライブセルイメージング実験を行います。撮影前に、チャンバーが適切な温度である37 °Cに達していることを確認してください。培地を適切に平衡化させ、温度変化によるフォーカスのドリフトを防ぐため、イメージングの1時間前に培養皿を顕微鏡チャンバー内に設置します。細胞の有糸分裂の状態を確認してください。この時点で、細胞の10〜15%が有糸分裂の初期段階にある必要があります。平衡化の時間に、先行実験で決定したイメージ取得パラメータを設定します。フォトブリーチングは細胞損傷を引き起こし、有糸分裂の進行を妨げるため、適切な解像度を確保しつつ、フォトブリーチングを回避することが重要です。取得間隔を超えない範囲で十分な解析細胞数を確保できるよう、条件ごとに、有糸分裂期に進入した細胞を含む視野をいくつか選択します。すべての視野を選択したら、フォーカスを再調整し、速やかに取得を開始してください。回転ディスク共焦点システムを用いた一般的なセットアップでは、4つの異なる条件、1プレートあたり7つの視野、2つのカラーチャンネルを使用し、75分間にわたって1.5〜2分の間隔で撮影を行います。使用する蛍光マーカーに応じて、細胞の有糸分裂表現型を解析するための明確な基準を決定してください。左側に示すBAG3-GFPのプラスミドDNAによるトランスフェクションとは対照的に、右側に示す組換えアデノウイルスを用いたアデノフェクションでは、低い感染多重度において細胞集団の大部分で、より均一かつ効率的なBAG3-GFPの発現が可能になります。この代表的なウェスタンブロットは、BAG3特異的siRNAおよび組換えアデノウイルスBAG3-GFPによるアデノフェクションによって、内因性BAG3の効率的な枯渇と、内因性レベルに近いレベルでのBAG3-GFPタンパク質の再導入が可能であることを示しています。ここで示されているように、プロテотоキシックストレス誘導剤であるMG132で処理したHeLa細胞とは異なり、アデノフェクションしたHeLa細胞ではストレス誘導性熱ショックタンパク質のレベルに検出可能な上昇が見られないため、アデノフェクションはタンパク質の恒常性を維持できることがわかります。ここでは、コントロールsiRNAおよびBacMam-GFP alpha Tubulin、BacMam-RFP ActinをアデノフェクションしたHeLa細胞の共焦点タイムラプス画像に示されるように、細胞の有糸分裂の進行がアデノフェクションによって著しく妨げられないことがわかります。このグラフは、有糸分裂に異常が見られる細胞の割合を示しています。赤色のバーで示されるように、BAG3特異的siRNAのみをアデノウイルス導入した細胞では、有糸分裂の欠損レベルがおよそ2倍に増加しましたが、黒色のバーで示されるBAG3-GFPの再導入により、コントロール細胞に近いレベルまで回復しました。このビデオを視聴することで、アデノフェクションを用いた枯渇レスキュー実験の実施方法について十分に理解できるはずです。この手法は、複数の細胞背景において構造機能解析のためのハイポモルフィック・ノックダウンを構築するための、迅速かつ簡便なシステムを提供します。この方法に従うことで、特定の機能における目的タンパク質の重要な構造的要件を特定することが可能です。その後、ゲノム編集の他のアプローチを用いることで、関与するメカニズムをさらに深く究明することができます。

adenofection-method-for-studying-role-molecular-chaperones-cellular

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Biology

生物学

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学ぶアデノフェクション法による枯渇-レスキュー実験で、細胞形態動態における分子シャペロンの役割を単一細胞レベルで解析する方法です。細胞恒常性を保ちながらタンパク質機能を詳細に研究できます。

Adenofection：枯渇-レスキュー実験によって細胞Morphodynamicsにおける分子シャペロンの役割を研究するための方法

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