Name: マウス空腸および結腸セグメントにおける腸間膜求心性神経活動のin vitro記録で (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: 学ぶマウス空腸・結腸の腸間膜求心性神経活動のin vitro記録法。機械・化学刺激への神経応答を定量化し、過敏化や脱感作を評価することで、過敏性腸症候群などの疼痛症候群の病態解明と治療開発に貢献します。

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SNは上記の実験を行い、データ解析を行い、原稿を起草しました。ADとJDMは、この技術を当社の研究施設に導入し、データ分析を支援しました。HCは実験の実施を支援しました。WJ、CK、DGは、私たちの研究室での求心性測定技術の実装、データ分析、結果の解釈を支援しました。SF、JDM、BDWが研究を設計しました。すべての著者が最終的な原稿を批判的に読み、承認しました。SNは、フランダース(11G7415N)の科学研究基金(FWO)の志願者です。この作業は、FWO(G028615NおよびG034113N)によって財政的に支援されました。

<ol><li>Donovan, J., Grundy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocannabinoid+modulation+of+jejunal+afferent+responses+to+LPS%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol+Motil%22%5BJournal%5D)">Endocannabinoid modulation of jejunal afferent responses to LPS.</a> Neurogastroenterol Motil. 24 (10), 956-e465 (2012).</li>
<li>Gregersen, H., Jiang, W., Liao, D., Grundy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+stress-dependent+mechanoreceptors+linking+intestinal+biomechanics+and+sensory+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Evidence for stress-dependent mechanoreceptors linking intestinal biomechanics and sensory signal transduction.</a> Exp Physiol. 98 (1), 123-133 (2013).</li>
<li>Keating, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Afferent+hypersensitivity+in+a+mouse+model+of+post-inflammatory+gut+dysfunction%3A+role+of+altered+serotonin+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Afferent hypersensitivity in a mouse model of post-inflammatory gut dysfunction: role of altered serotonin metabolism.</a> J Physiol. 586 (18), 4517-4530 (2008).</li>
<li>Liu, C. Y., Jiang, W., Muller, M. H., Grundy, D., Kreis, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitization+of+mesenteric+afferents+to+chemical+and+mechanical+stimuli+following+systemic+bacterial+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol+Motil%22%5BJournal%5D)">Sensitization of mesenteric afferents to chemical and mechanical stimuli following systemic bacterial lipopolysaccharide.</a> Neurogastroenterol Motil. 17 (1), 89-101 (2005).</li>
<li>Deiteren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+contributing+to+visceral+hypersensitivity%3A+focus+on+splanchnic+afferent+nerve+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol+Motil%22%5BJournal%5D)">Mechanisms contributing to visceral hypersensitivity: focus on splanchnic afferent nerve signaling.</a> Neurogastroenterol Motil. 27 (12), 1709-1720 (2015).</li>
<li>Nullens, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+prolonged+CLP-induced+sepsis+on+mesenteric+afferent+nerve+activity+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol+Motil%22%5BJournal%5D)">The effect of prolonged CLP-induced sepsis on mesenteric afferent nerve activity in mice.</a> Neurogastroenterol Motil. 27 (Suppl 2), 22(2015).</li>
<li>Brierley, S. M., Jones, R. C. III, Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splanchnic+and+pelvic+mechanosensory+afferents+signal+different+qualities+of+colonic+stimuli+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice.</a> Gastroenterology. 127 (1), 166-178 (2004).</li>
<li>Feng, B., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+functional+characterization+of+mouse+colorectal+afferent+endings%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro functional characterization of mouse colorectal afferent endings.</a> J Vis Exp. (95), e52310(2015).</li>
<li>Travis, L., Spencer, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+stretch-activated+firing+of+spinal+afferent+nerve+endings+in+mouse+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Imaging stretch-activated firing of spinal afferent nerve endings in mouse colon.</a> Front Neurosci. 7, 179(2013).</li>
<li>De Schepper, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+receptor+signaling+mediates+afferent+nerve+sensitization+during+colitis-induced+motility+disorders+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">TRPV1 receptor signaling mediates afferent nerve sensitization during colitis-induced motility disorders in rats.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G245-G253 (2008).</li>
<li>Sengupta, J. N., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+mechanosensitive+pelvic+nerve+afferent+fibers+innervating+the+colon+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of mechanosensitive pelvic nerve afferent fibers innervating the colon of the rat.</a> J Neurophysiol. 71 (6), 2046-2060 (1994).</li>
<li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First-in-man%27%3A+characterising+the+mechanosensitivity+of+human+colonic+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">First-in-man': characterising the mechanosensitivity of human colonic afferents.</a> Gut. 60 (2), 281-282 (2011).</li>
<li>Peiris, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+visceral+afferent+recordings%3A+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Human visceral afferent recordings: preliminary report.</a> Gut. 60 (2), 204-208 (2011).</li>
<li>Brookes, S. J., Spencer, N. J., Costa, M., Zagorodnyuk, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrinsic+primary+afferent+signalling+in+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Extrinsic primary afferent signalling in the gut.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (5), 286-296 (2013).</li>
<li>Bulmer, D. C., Grundy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Achieving+translation+in+models+of+visceral+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Achieving translation in models of visceral pain.</a> Curr Opin Pharmacol. 11 (6), 575-581 (2011).</li>
<li>De Winter, B. Y., De Man, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+inflammation%2C+immune+system+and+neuronal+pathways%3A+effect+on+gastrointestinal+motility%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Interplay between inflammation, immune system and neuronal pathways: effect on gastrointestinal motility.</a> World J Gastroenterol. 16 (44), 5523-5535 (2010).</li>
<li>Akbar, A., Yiangou, Y., Facer, P., Walters, J. R., Anand, P., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+capsaicin+receptor+TRPV1-expressing+sensory+fibres+in+irritable+bowel+syndrome+and+their+correlation+with+abdominal+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Increased capsaicin receptor TRPV1-expressing sensory fibres in irritable bowel syndrome and their correlation with abdominal pain.</a> Gut. 57 (7), 923-929 (2008).</li>
<li>De Schepper, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+receptors+on+unmyelinated+C-fibres+mediate+colitis-induced+sensitization+of+pelvic+afferent+nerve+fibres+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">TRPV1 receptors on unmyelinated C-fibres mediate colitis-induced sensitization of pelvic afferent nerve fibres in rats.</a> J Physiol. 586 (21), 5247-5258 (2008).</li>
<li>Vermeulen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+TRPV1+and+TRPA1+in+visceral+hypersensitivity+to+colorectal+distension+during+experimental+colitis+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Role of TRPV1 and TRPA1 in visceral hypersensitivity to colorectal distension during experimental colitis in rats.</a> Eur J Pharmacol. 698 (1-3), 404-412 (2013).</li>
<li>Booth, C. E., Shaw, J., Hicks, G. A., Kirkup, A. J., Winchester, W., Grundy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+the+pattern+of+jejunal+distension+on+mesenteric+afferent+sensitivity+in+the+anaesthetized+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol+Motil%22%5BJournal%5D)">Influence of the pattern of jejunal distension on mesenteric afferent sensitivity in the anaesthetized rat.</a> Neurogastroenterol Motil. 20 (2), 149-158 (2008).</li>
<li>Hughes, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+neuro-immune+interactions+differ+between+irritable+bowel+syndrome+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Sensory neuro-immune interactions differ between irritable bowel syndrome subtypes.</a> Gut. 62 (10), 1456-1465 (2013).</li>
<li>Hughes, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+derived+opioidergic+inhibition+of+viscerosensory+afferents+is+decreased+in+Irritable+Bowel+Syndrome+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">Immune derived opioidergic inhibition of viscerosensory afferents is decreased in Irritable Bowel Syndrome patients.</a> Brain Behav Immun. 42, 191-203 (2014).</li>
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<li>Wouters, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histamine+Receptor+H1-mediated+Sensitization+of+TRPV1+Mediates+Visceral+Hypersensitivity+and+Symptoms+in+Patients+With+Irritable+Bowel+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Histamine Receptor H1-mediated Sensitization of TRPV1 Mediates Visceral Hypersensitivity and Symptoms in Patients With Irritable Bowel Syndrome.</a> Gastroenterology. , (2016).</li>
<li>Brenn, D., Richter, F., Schaible, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitization+of+unmyelinated+sensory+fibers+of+the+joint+nerve+to+mechanical+stimuli+by+interleukin-6+in+the+rat%3A+an+inflammatory+mechanism+of+joint+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Sensitization of unmyelinated sensory fibers of the joint nerve to mechanical stimuli by interleukin-6 in the rat: an inflammatory mechanism of joint pain.</a> Arthritis Rheum. 56 (1), 351-359 (2007).</li>
<li>Christianson, J. A., Liang, R., Ustinova, E. E., Davis, B. M., Fraser, M. O., Pezzone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+of+bladder+and+colon+sensory+innervation+occurs+at+the+primary+afferent+level%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Convergence of bladder and colon sensory innervation occurs at the primary afferent level.</a> Pain. 128 (3), 235-243 (2007).</li>
<li>Daly, D. M., Chess-Williams, R., Chapple, C., Grundy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inhibitory+role+of+acetylcholine+and+muscarinic+receptors+in+bladder+afferent+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Urol%22%5BJournal%5D)">The inhibitory role of acetylcholine and muscarinic receptors in bladder afferent activity.</a> Eur Urol. 58 (1), 22-28 (2010).</li>
<li>Minagawa, T., Wyndaele, M., Aizawa, N., Igawa, Y., Wyndaele, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+pelvic+organ+cross-talk%3A+2.+Impact+of+colorectal+distention+on+afferent+nerve+activity+of+the+rat+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of pelvic organ cross-talk: 2. Impact of colorectal distention on afferent nerve activity of the rat bladder.</a> J Urol. 190 (3), 1123-1130 (2013).</li>
<li>Wyndaele, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+pelvic+organ+crosstalk%3A+1.+Peripheral+modulation+of+bladder+inhibition+by+colorectal+distention+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of pelvic organ crosstalk: 1. Peripheral modulation of bladder inhibition by colorectal distention in rats.</a> J Urol. 190 (2), 765-771 (2013).</li>
<li>Keating, C., Nocchi, L., Yu, Y., Donovan, J., Grundy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ageing+and+gastrointestinal+sensory+function%3A+Altered+colonic+mechanosensory+and+chemosensory+function+in+the+aged+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ageing and gastrointestinal sensory function: Altered colonic mechanosensory and chemosensory function in the aged mouse.</a> J Physiol. , (2015).</li>
<li>Valdez-Morales, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitization+of+Peripheral+Sensory+Nerves+by+Mediators+From+Colonic+Biopsies+of+Diarrhea-Predominant+Irritable+Bowel+Syndrome+Patients%3A+A+Role+for+PAR2%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Sensitization of Peripheral Sensory Nerves by Mediators From Colonic Biopsies of Diarrhea-Predominant Irritable Bowel Syndrome Patients: A Role for PAR2.</a> Am J Gastroenterol. 108 (10), 1634-1643 (2013).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

本論文ではプロトコルは、当社グループおよびその他3,4,7,8,12,20,21,31によって使用されるようなげっ歯類で腸間膜求心性神経活動を研究するために、再現実験室の技術が記載されています。プロトコル内の重要なステップは、キャピラリーに、周囲の脂肪組織を吸引することにより、吸引電極および器官槽からガラスキャピラリーの適切な「シール」に組織の迅速な単離、神経ストランドの吸引が含まれます。ガラスキャピラリーの開口部は正確に決定する必要があります。広すぎ開口が冗長で、その結果、脂肪組織と毛細血管の「シール」を妨げになるのに対し、小さすぎる開口部は、電極に神経ストランドの吸引が複雑になります分析を妨げるであろうバックグラウンドノイズ（低い信号対雑音録音）。信頼性の高い単一ユニットの分類を可能にするために、内臓求心性神経を削減するために、異なる鎖に分割する必要があります記録中のユニット数。各記録には5台 - 一般的に、我々は4の最大値を持つことを目指してお勧めします。研究者は、したがって、関心の繊維に基づいて絞り、および適用されるラボ動物を調整するべきです。 別の重...

感覚シグナリングおよび疼痛知覚は、求心性神経、脊髄神経細胞、昇順と降順促通と抑制性経路およびいくつかの異なる脳領域間の複雑な相互作用から生じる複雑なプロセスです。このように、これらのレベルの一つ以上における変化は、変化した感覚シグナリングおよび疾患状態における内臓痛をもたらすことができます。感覚シグナリング複数の技術のすべてのこれらのさまざまな側面を研究するために、単一細胞実験に至るまで開発されている（ 例えば、神経細胞上のカルシウムイメージング）は、全体の動物モデルに（ 例えば、内臓運動応答として行動反応）。この論文に記載された技術は、研究者は、具体的にげっ歯類において小腸または結腸の孤立したセグメントからin vitroでの求心性神経活動を評価することができます。要するに、孤立した胃腸のセグメントは、（通常は空腸または結腸）生理Kで灌流専用記録チャンバー内に搭載されていますrebsソリューション。内臓神経は自由解剖し、内臓や骨盤の求心性神経における求心性神経活動の登録を可能にする電極に接続されています。神経活動は、求心性放電1-6に対する効果を評価するために、基底にまたは直接記録チャンバー（serosally）に適用することができる管腔内圧力および/または薬理学的化合物の増加に応じて記録された、または腔内灌流（粘膜）を介してすることができます。注目すべきは、内臓神経はまた、求心性感覚神経に加えて、遠心性繊維とviscerofugal求心性神経が含まれています。 ex vivoで内臓神経の記録の主要な利点の一つは、研究者が、神経活動に局所的に適用される化合物の直接の効果を研究するために、1つを可能にする、中枢神経系からの変調または入力なしで神経活動を定量化することができるという事実です。さらに、 インビボでのアプローチを使用して必要であるとして重要なパラメータの監視は、（下記参照）、nはO長く関連する。 インビトロ内臓記録は最終的にはるかに少ない時間がかかり、そのin vivoでの対応を超えています。 このような粘膜なでるなどの他の刺激、フォン・フレイ毛を使用したプロービングまたはセグメントの延伸に応じて、求心性神経活動は、腸組織が釘付けとは対照的である（縦方向に開放された修正された実験で研究することができます前号7,8で説明したように、無傷のセグメントを使用して私たちのセットアップ）、。また、ごく最近になって、技術が再び縦方向にセグメント9を開いて、釘付け使用して、カルシウムイメージングを介した結腸壁自体に結腸求心性神経の活性化を研究するために説明しました。 このin vivoでの技術の代替バージョンは、脊髄への求心性のエントリの近くに神経活動を測定するの外に構成されています。要するに、鎮静させた動物は、腹臥位で電子を配置されています、椎弓切除術による関心のプロジェクトの求心性神経に腰仙脊髄をxposingパラフィンで満たされただけでなく、切開部の皮膚を使用して、白金双極電極10,11の上に背細根を立体裁断を構築します。この技術は、さらに、研究者が彼らの伝導速度に基づいて、繊維を特徴付けることができ、薄く有髄Aδ線維から無髄C線維を区別する。また、背側根は、排他的に前述の混合求心性と遠心性内臓神経とは対照的に、感覚求心性繊維を含んでいます。 2つの研究グループが独立して人間の切除標本12,13における結腸求心性神経活動を記録するファースト・イン・マン写本を公開している、単離された腸セグメントからのin vitroでの求心性神経放電を記録することは、人間の標本を使用しても行うことができます。この技術の実装がより容易にtranslatiにつながる可能性人道的な状態にネズミのデータの上に、と研究者が容易に増感知覚神経を標的とする薬剤を同定する可能性があります。求心性神経活動を特徴づけるの臨床的重要性だけでなく、法外な求心性神経活動を標的とする新しい治療薬の発見、精巧フィールド14-19で多くの専門家によって議論されてきました。 上記のインビトロ技術は、より一般的に求心性神経活動のin vivoでの測定で知られて補完します。 インビボでのニューロンの活性測定の間、神経活動は、目的のセグメントが識別され、続いて挿管し、そして液体よくパラフィン充填されている間鎮静動物において直接測定することができる齧歯類20の腹壁および皮膚を用いて構成されています。関心の求心性神経は、その後、神経活動のmeasuremenを可能にする、双極白金電極上に切断し、置かれ、識別されトン。この技術は、鎮静動物いえ生きで求心性神経活動を調節するために研究を可能にします。以下のような、1は、このような管腔膨満または化合物の静脈内投与などの干渉に応答するニューロンの活動を学ぶことができます。 トランスレーショナル研究は、最近、主にヒト由来の上清のアプリケーションに焦点を当てて（ 例えば 、結腸生検、栽培末梢血単核細胞などからの）空腸および/または結腸マウスの求心性神経21,22上。粘膜アプリケーションに対する漿膜の差動効果が求心性神経放電に研究することができるので、研究者は直接、臓器浴にまたは腸セグメントを灌流管腔内溶液中にいずれかの上清を適用することができます。このように、それは過敏性腸症候群の患者からの結腸粘膜生検supernatansは、マウス結腸求心性神経、モルモット粘膜下神経細胞とマウスの後根に過敏症を引き起こすことができることが示されました神経節ニューロン21,23,24。 最後に、神経活動を記録することは腸間膜に制限および/または骨盤神経細胞は、胃腸管を支配されていません。他の人が他の人が26-28と同様の膀胱求心性神経活動を特徴とし、膀胱から骨盤の求心性神経だけでなく、消化管が収束することを証明し、おそらく神経細胞が得られているのに対し、神経録音は、25膝関節を供給求心性神経で実行することができることを実証しましたクロストーク29。

<table><tbody><tr><td>塩化ナトリウム (NaCl)</td><td>VWR Chemicals</td><td>27,810,295</td><td>化合物 クレブス溶液</td></tr><tr><td>塩化カリウム (KCl)</td><td>Acros 有機物</td><td>196770010</td><td>化合物 クレブス溶液</td></tr><tr><td>リン酸二水素ナトリウム (NaH2PO4)</td><td>VWR Chemicals</td><td>1,063,461,000</td><td>化合物 クレブス溶液</td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム (NaHCO3</サブ>)</td><td>メルク</td><td>1,063,291,000</td><td>化合物 クレブス溶液</td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム (MgSO4)</td><td>メルク</td><td>1,058,861,000</td><td>化合物 クレブス溶液</td></tr><tr><td>塩化カルシウム (CaCl2)</td><td>メルク</td><td>23,811,000</td><td>化合物 クレブス溶液</td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>VWR ケミカルズ</td><td>1011175P</td><td>化合物 クレブス溶液</td></tr><tr><td>蒸留水</td><td></td><td></td><td>化合物 クレブス溶液</td></tr><tr><td>PVCチューブ</td><td>科学研究所用品</td><td></td><td>腸セグメントはPVCチューブの上に取り付ける必要があります</td></tr><tr><td>シリコーンチューブ</td><td>科学実験室用品</td><td></td><td>チューブの残りの部分、理想的にはシリコーンベース-チューブ内の破片をより簡単に取り除く</td></tr><tr><td>絹糸</td><td>Pearsall Limited</td><td>10B15S220</td><td>PVCチューブ上のセグメントの取り付け</td></tr><tr><td>シリンジドライバー</td><td>ハーバード装置</td><td>55-2222</td><td>クレブス双眼鏡の管腔内注入</td></tr><tr><td>- 眼球の10倍の倍率を含む</td><td>ツァイス STEMI 2000</td><td></td><td>求心性神経の解剖に最適な可視化</td></tr><tr><td>ホメオサーミックブランケットコントロールユニット</td><td>ハーバード装置</td><td>507214</td><td>臓器室の加熱</td></tr><tr><td>Sylgardで覆われた底</td><td></td><td></td><td></td>のカスタムメイドオルガンバス</tr><tr><td>Spike2ソフトウェア</td><td></td><td></td><td>データの記録と分析</td></tr><tr><td>昆虫ピン、500個、ステンレス鋼、直径0.2mm</td><td>Austerlitz昆虫ピンの細部</td><td></td><td>求心性神経の解剖</td></tr><tr><td>Tweezer Dumont #5 inox 11 cm</td><td>World Precision Instrument</td><td>500341</td><td>求心性神経</td></tr><tr><td>の解剖はさみ、スプリング、14 cm</td><td>World Precision Instrument</td><td>15905</td><td>求心性神経の解剖</td></tr><tr><td>DBディジティメータ&nbsp;</td><td>NL 108T2/10</td><td></td><td>圧力変換器</td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>成重</td><td>M-3333</td><td>吸引電極の3D操作</td></tr><tr><td>マイクロマニピュ</td><td>レーターX-4 回転ブロック</td><td></td><td>吸引電極の3D操作</td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>GJ-8 マグネットスタンド</td><td></td><td>吸引電極の3D操作</td></tr><tr><td>LightSource</td><td>Euromex Microscopes HollandEK-1</td><td></td><td>求心性神経の解剖に最適な可視化</td></tr><tr><td>CED 1401 記録装置</td><td></td><td></td><td>求心性神経活動の記録</td></tr><tr><td>Humbug 50/60 Hz ノイズエリミネーター</td><td>Quest 科学機器</td><td></td><td>バックグラウンドノイズの除去</td></tr><tr><td>輸液ポンプ</td><td>Gibson Minipuls 2</td><td></td><td>セグメントが取り付けられている</td></tr><tr><td>臓器室の注入微小電極ホルダー ハーフセル 1.5 mm</td><td>World Precision Instrument</td><td>MEH2SW</td><td>求心性線維を分離するための吸引電極</td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス 毛細血管、300 個; 1.5/0.84 OD/ID</td><td>World Precision Instrument</td><td>1B150-4</td><td>求心性神経の分離のための毛細血管</td></tr></tbody></table>

マウス空腸および結腸セグメントにおける腸間膜求心性神経活動のin vitro記録で

In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments

求心性神経は正常な生理機能に関する情報を伝えるだけでなく、中枢神経系に向かって周囲から乱れ恒常性と異なる器官系の病態生理学的プロセスを知らせるだけでなく。このように、腸間膜求心性神経の活性の増加または「感作」は、内臓過敏症と腹部の疼痛症候群の病態生理に重要な役割を割り当てられています。 腸間膜求心性神経活動は、専用の器官浴中に取り付けられ、そこから内臓神経は、研究者が直接消化管セグメントに隣接する神経活動を評価することを可能にする、単離されている単離された腸セグメントにおいてインビトロで測定することができます。活動は、セグメントの膨満または管腔内またはserosally配信薬理学的化合物の添加後の間に、標準化された状態で、ベースラインで記録することができます。この技術は、可能研究者は、簡単コントロール検体における末梢神経系を標的とする薬剤の効果を研究します。他にも、それは病気の間に変更されている方法ニューロン活動に関する重要な情報を提供します。 例えば、後根神経節、脊髄または中枢神経系（求心性ニューロンの発火活性を測定することのみシグナル伝達カスケードの複雑な神経で1つの中継局を構成し、研究者は他のレベルでの神経活動を見落とさないように心に留めなければならないことに留意すべきです）完全に健康と病気における複雑な神経生理学を解明するためです。 一般的に使用されるアプリケーションは、リポ多糖の投与に応答した神経活動の研究、および過敏性腸症候群の動物モデルでの求心性神経活動の研究が含まれます。より翻訳アプローチでは、単離されたマウスの腸セグメントは、IBS患者の結腸の上清に曝露することができます。また、修正この技術の最近のヒト結腸検体において適用可能であることが示されています。

空腸求心性神経活動は、ベースラインで測定し、応答してOF-1マウス9 8週齢の雄で膨満をランプします。水と通常の飼料をタップする無制限のアクセスを持つ動物は、標準化された条件（50％、12時間の明暗サイクル - - 22°C、湿度40ケージ当たり6匹、20）のグループに収容しました。マウスの空腸セグメントは0 mmHgの（自発的活動11.47±3.31悪童/秒を意味する）の管腔内圧力でベースライン時の不規則な自発的な求心性神経放電を示しました。 空腸の求心性神経活動は、60 mmHgでまでランプ膨満を行う際に増加しました。一般的に、管腔内圧力の上昇を次求心性神経活性の増加は、管腔内の圧力が20 mmHgのに達するまでまで発火活性における初期の急激な増加からなる、二相性応答（ 図5）によって特徴付けられ、whicHは、主に低閾値繊維の増加発火率に帰することができます。次いで、これを焼成活性の第二の...

腸間膜求心性神経は、正常な恒常性と病態生理学に関する情報を消化管から脳に伝えます。胃腸求心性神経活動は、求心性神経が付着した孤立した腸管セグメントを臓器浴に取り付け、神経を分離し、基礎活動と刺激活動を評価することで評価できます。

Afferent nerves not only convey information concerning normal physiology, but also signal disturbed homeostasis and pathophysiological processes of the ...

この手法の全体的な目的は、ランプ状の拡張および化合物の投与に応答して、単一の空腸または結腸の神経束から、in vitroで内臓感覚神経（内臓求心性神経）の活動を記録することです。この方法は、胃腸管を支配する求心性神経が、さまざまな疾患状態で過敏化または脱感作しているかなど、神経科学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この手法の主な利点は、in vitroで神経放電の記録が可能であること、および中枢神経系の調節や入力なしに神経活動を定量化できることです。神経感作が病態形成に重要な役割を果たすため、本手法の意義は、過敏性腸症候群などのいくつかの疼痛症候群の治療や診断へと広がります。一般的に、この方法に不慣れな者は、神経束の解剖と記録された信号のシングルユニット解析に相当な訓練時間を要するため、習得に苦労することになります。本手順を開始するために、犠牲にしたマウスを仰臥位にしてください。メスを用いて、剣状突起から恥骨まで、皮膚および腹筋層を通して腹部正中切開を行います。その後、腹腔内組織の乾燥を防ぐため、冷たいKrebs溶液で腹腔内を洗浄します。次に、十二指腸空腸曲から直ちに、小腸を約20cm切除し、鋭い鋏を用いて空腸全体を速やかに摘出します。周囲の組織を損傷させないよう注意し、空腸の血管と求心性神経を含む腸間膜を温存してください。次に、摘出した空腸を氷上の冷たいKrebs溶液に入れ、Carbigenで継続的に酸素供給を行います。その後、空腸を約3cmの長さのループ状に切断します。記録槽へのループの固定を容易にするため、各ループの中央付近にある血管と内臓神経を含む腸間膜束を確認します。続いて、鈍端カテーテルを用いて各セグメントをKrebs溶液で洗浄し、管腔内容物と乳糜を除去します。これらには消化酵素が含まれており、in vitroで組織サンプルの劣化を促進させるためです。その後、求心性神経活動を測定するためのセグメントを選択し、シリコンエラストマー層でコーティングされた記録槽に設置します。記録チャンバー内のKrebs液の温度を34°Cに維持します。次に、空腸セグメントを臓器浴に固定し、口側端を管腔内フローを供給するシリンジドライバーに、肛門側端を流出口に接続します。セグメントをわずかに伸展させますが、過度な張力がかからないように注意してください。シルクリガチャーを用いて、両端を流入ポートと流出ポートにしっかりと固定します。その後、口腔側にシリンジドライバーを取り付け、空腸セグメントの管腔内にKrebs溶液を10 milliliters per hourで灌流させます。固定した腸管セグメントの腸間膜を、シリコンエラストマーの下層に沿って平らにピンで固定します。次に、腸間膜束の視認性を最適化するために、腸間膜を伸ばします。続いて、装着した分節から腸管内Krebs溶液が漏出していないことを確認するため、腸管分節内の内圧が60 mmHgに達するまで流出ポートを閉じて、ランプ拡張試験を行います。内圧が中断なく緩やかに上昇することを確認してください。初期の拡張段階では、セグメントに小さな収縮が生じることが予想されます。必要に応じて、Krebs溶液に1 µmolのL型カルシウムチャネル遮断薬であるニフェジピンを添加し、蠕動運動を抑制してください。実体顕微鏡下で、2本の小型ピンセットを用いて脂肪組織をそっと引っ張り、腸間膜から慎重に剥離させます。この際、脂肪組織に埋もれている血管や求心性神経を損傷させないよう注意してください。空腸から離れた位置にある脂肪組織を剥離し始め、腸間膜束内の両方の血管を露出させます。両方の血管の間にある、脂肪組織に包まれた細い白い糸状の構造物を、求心性空腸神経として特定します。次に、ピンセットを用いて脂肪組織を慎重に剥離しながら、空腸方向のより近位へと切離していきます。次に、神経に付着している脂肪組織を除去し、その部位の空腸腸間膜神経を解剖します。鋭い組織用ハサミを用いて神経を切断してください。必要に応じて、軽く引っ張りながら、残っている脂肪、結合組織、および神経外膜鞘を剥離します。本手順では、マイクロマニピュレーターを使用して、吸引電極の先端を器官バス内に降ろします。次に、電極の先端がKrebs溶液に浸るように、器官バスからKrebs溶液を緩やかに吸引します。吸引電極内部のワイヤ電極がKrebs溶液で覆われていることを確認してください。次に、吸引電極の先端を切断した求心性神経束のすぐ隣に配置し、切断された神経束の全長をキャピラリー内に吸い込みます。電極の先端を脂肪組織に向け、プランジャーを用いて脂肪組織をガラスキャピラリー内に吸引し、これにより神経をキャピラリー内で機械的に密閉して、器官浴の内容物から遮断します。周囲の脂肪組織をキャピラリー内に吸引して、記録室からガラスキャピラリーを適切に密閉することは、最終的な解析の妨げとなる不要な背景ノイズを最小限に抑えるために極めて重要です。求心性神経活動の記録を確認するために、出力ポートを閉じて腸管セグメント内の圧力を徐々に上昇させ、ランプ拡張誘発性の求心性発火の増加を行わせます。3回連続のランプ拡張で再現性のあるマルチユニット放電が得られた場合にのみ、目的の実験プロトコルを実施してください。神経の単離後、実際の実験を行う前に、安定した自発的な求心性神経活動を得るため、プレパレーションを15分間安定させてください。ここでは、機械受容プロファイルに基づいた異なる求心性線維ユニットの模式図を示します。低閾値線維は主に低い拡張圧で神経活動の亢進を示し、その結果、LTの割合が55%を超えます。対照的に、高閾値ユニットは有害な圧力においてのみ発火率の上昇を示します。広ダイナミックレンジ線維は、拡張全体を通じて神経活動が緩やかに上昇するのに対し、機械的に不感な線維は拡張圧の上昇に反応しません。この図は、ランプ拡張中の野生型マウスにおける腸間膜求心性神経の放電を示しています。二相性の拡張プロファイルにおいて、神経放電の初期上昇は低閾値および広ダイナミックレンジ線維によるものである一方、高閾値および広ダイナミックレンジ線維が2回目の放電増加に寄与していることに注意してください。習熟すれば、適切に実施することで、空腸神経の単離と初期ベースライン記録を1時間以内に完了させることができます。器官浴に投与した化合物の効果を検討する場合、より多くの時間を要します。この手順を行う際は、すべての実験において同一のセグメントを一貫して特定するなど、十分に標準化されたアプローチを維持することが重要です。本手順に続き、後根神経節の単離とその後のカルシウムイメージングなどの他の手法を実施することで、多くの疾患の病態形成に胃腸神経系のどのリレーステーションが関与しているかを評価することが可能です。本手法の開発により、神経科学分野の研究者は、胃腸研究における複数の疼痛症候群の発症機序を探索することが可能となりました。このビデオを視聴することで、マウスの胃腸管から空腸求心性神経を単離し、ランプ伸展（ramp distension）中の神経活動を記録する方法について十分に理解することができます。

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JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオは、ex-vivoラット結腸の結腸求心性神経の活動を記録する方法を示しています。このビデオは、両端にカニューレを挿入し、生理食塩水を注入して管腔内圧を上昇させる方法を示しています。圧力が上昇すると、神経信号が上昇し、その刺激を示します。...

Ex Vivoラット結腸における結腸求心性神経からの電気生理学的記録

このビデオは、解剖されたマウス空腸セグメントで腸間膜求心性神経からの電気信号を記録するプロセスを示しており、組織の圧力と運動の変化が求心性神経活動に及ぼす影響を研究しています。...

Ex Vivoマウス空腸セグメントにおける腸間膜求心性神経活動の記録

出典:Fried, D. E., Gulbransen, B. D.In Situ Ca2+ 腸神経系のイメージング J. Vis. Exp.

マウス大腸筋神経叢における腸内ニューロンとグリア活性のカルシウムイメージング

腸神経系のニューロンおよびグリア成分を直接研究するための細胞培養プロトコルを実演します。成体マウスの筋神経叢から、電気生理学、免疫組織化学などにより個々のニューロンとグリアの機能を調べる能力を提供する、カバースリップ上のニューロン/グリア混合培養物。...

不定冠詞<em&gt;インビトロ</em成体マウスの筋層間神経叢から分離腸ニューロンとグリアの&gt;準備

このビデオは、in vitroマウスの結腸直腸神経製剤で単繊維電気生理学的記録を行うためのプロトコルを示しています。...

マウス大腸求心性終末の体外機能解析では、

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マウスにおける胃腸の運動を分析するためにビデオ画像と時空間マップ

感覚機能の異常は、内臓の痛みや機能および炎症性腸病気の他の症状に基づいています。に備えて、前のヴィヴォラット大腸結腸求心性神経の電気生理学的記録のためのプロトコルを次に示します。...

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ローカスの神経活動を特徴づけるためにマルチユニット記録方法（<em&gt; Schistocercaアメリカーナ</em&gt;）嗅覚回路

学ぶマウス空腸・結腸の腸間膜求心性神経活動のin vitro記録法。機械・化学刺激への神経応答を定量化し、過敏化や脱感作を評価することで、過敏性腸症候群などの疼痛症候群の病態解明と治療開発に貢献します。

マウス空腸および結腸セグメントにおける腸間膜求心性神経活動のin vitro記録で

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