マウス空腸および結腸セグメントにおける腸間膜求心性神経活動のin vitro記録で

この手法の全体的な目的は、ランプ状の拡張および化合物の投与に応答して、単一の空腸または結腸の神経束から、in vitroで内臓感覚神経（内臓求心性神経）の活動を記録することです。この方法は、胃腸管を支配する求心性神経が、さまざまな疾患状態で過敏化または脱感作しているかなど、神経科学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この手法の主な利点は、in vitroで神経放電の記録が可能であること、および中枢神経系の調節や入力なしに神経活動を定量化できることです。

神経感作が病態形成に重要な役割を果たすため、本手法の意義は、過敏性腸症候群などのいくつかの疼痛症候群の治療や診断へと広がります。一般的に、この方法に不慣れな者は、神経束の解剖と記録された信号のシングルユニット解析に相当な訓練時間を要するため、習得に苦労することになります。本手順を開始するために、犠牲にしたマウスを仰臥位にしてください。

メスを用いて、剣状突起から恥骨まで、皮膚および腹筋層を通して腹部正中切開を行います。その後、腹腔内組織の乾燥を防ぐため、冷たいKrebs溶液で腹腔内を洗浄します。次に、十二指腸空腸曲から直ちに、小腸を約20cm切除し、鋭い鋏を用いて空腸全体を速やかに摘出します。

周囲の組織を損傷させないよう注意し、空腸の血管と求心性神経を含む腸間膜を温存してください。次に、摘出した空腸を氷上の冷たいKrebs溶液に入れ、Carbigenで継続的に酸素供給を行います。その後、空腸を約3cmの長さのループ状に切断します。

記録槽へのループの固定を容易にするため、各ループの中央付近にある血管と内臓神経を含む腸間膜束を確認します。続いて、鈍端カテーテルを用いて各セグメントをKrebs溶液で洗浄し、管腔内容物と乳糜を除去します。これらには消化酵素が含まれており、in vitroで組織サンプルの劣化を促進させるためです。その後、求心性神経活動を測定するためのセグメントを選択し、シリコンエラストマー層でコーティングされた記録槽に設置します。

記録チャンバー内のKrebs液の温度を34°Cに維持します。次に、空腸セグメントを臓器浴に固定し、口側端を管腔内フローを供給するシリンジドライバーに、肛門側端を流出口に接続します。セグメントをわずかに伸展させますが、過度な張力がかからないように注意してください。

シルクリガチャーを用いて、両端を流入ポートと流出ポートにしっかりと固定します。その後、口腔側にシリンジドライバーを取り付け、空腸セグメントの管腔内にKrebs溶液を10 milliliters per hourで灌流させます。固定した腸管セグメントの腸間膜を、シリコンエラストマーの下層に沿って平らにピンで固定します。

次に、腸間膜束の視認性を最適化するために、腸間膜を伸ばします。続いて、装着した分節から腸管内Krebs溶液が漏出していないことを確認するため、腸管分節内の内圧が60 mmHgに達するまで流出ポートを閉じて、ランプ拡張試験を行います。内圧が中断なく緩やかに上昇することを確認してください。

初期の拡張段階では、セグメントに小さな収縮が生じることが予想されます。必要に応じて、Krebs溶液に1 µmolのL型カルシウムチャネル遮断薬であるニフェジピンを添加し、蠕動運動を抑制してください。実体顕微鏡下で、2本の小型ピンセットを用いて脂肪組織をそっと引っ張り、腸間膜から慎重に剥離させます。この際、脂肪組織に埋もれている血管や求心性神経を損傷させないよう注意してください。

空腸から離れた位置にある脂肪組織を剥離し始め、腸間膜束内の両方の血管を露出させます。両方の血管の間にある、脂肪組織に包まれた細い白い糸状の構造物を、求心性空腸神経として特定します。次に、ピンセットを用いて脂肪組織を慎重に剥離しながら、空腸方向のより近位へと切離していきます。

次に、神経に付着している脂肪組織を除去し、その部位の空腸腸間膜神経を解剖します。鋭い組織用ハサミを用いて神経を切断してください。必要に応じて、軽く引っ張りながら、残っている脂肪、結合組織、および神経外膜鞘を剥離します。

本手順では、マイクロマニピュレーターを使用して、吸引電極の先端を器官バス内に降ろします。次に、電極の先端がKrebs溶液に浸るように、器官バスからKrebs溶液を緩やかに吸引します。吸引電極内部のワイヤ電極がKrebs溶液で覆われていることを確認してください。

次に、吸引電極の先端を切断した求心性神経束のすぐ隣に配置し、切断された神経束の全長をキャピラリー内に吸い込みます。電極の先端を脂肪組織に向け、プランジャーを用いて脂肪組織をガラスキャピラリー内に吸引し、これにより神経をキャピラリー内で機械的に密閉して、器官浴の内容物から遮断します。周囲の脂肪組織をキャピラリー内に吸引して、記録室からガラスキャピラリーを適切に密閉することは、最終的な解析の妨げとなる不要な背景ノイズを最小限に抑えるために極めて重要です。

求心性神経活動の記録を確認するために、出力ポートを閉じて腸管セグメント内の圧力を徐々に上昇させ、ランプ拡張誘発性の求心性発火の増加を行わせます。3回連続のランプ拡張で再現性のあるマルチユニット放電が得られた場合にのみ、目的の実験プロトコルを実施してください。神経の単離後、実際の実験を行う前に、安定した自発的な求心性神経活動を得るため、プレパレーションを15分間安定させてください。

ここでは、機械受容プロファイルに基づいた異なる求心性線維ユニットの模式図を示します。低閾値線維は主に低い拡張圧で神経活動の亢進を示し、その結果、LTの割合が55%を超えます。対照的に、高閾値ユニットは有害な圧力においてのみ発火率の上昇を示します。広ダイナミックレンジ線維は、拡張全体を通じて神経活動が緩やかに上昇するのに対し、機械的に不感な線維は拡張圧の上昇に反応しません。

この図は、ランプ拡張中の野生型マウスにおける腸間膜求心性神経の放電を示しています。二相性の拡張プロファイルにおいて、神経放電の初期上昇は低閾値および広ダイナミックレンジ線維によるものである一方、高閾値および広ダイナミックレンジ線維が2回目の放電増加に寄与していることに注意してください。習熟すれば、適切に実施することで、空腸神経の単離と初期ベースライン記録を1時間以内に完了させることができます。

器官浴に投与した化合物の効果を検討する場合、より多くの時間を要します。この手順を行う際は、すべての実験において同一のセグメントを一貫して特定するなど、十分に標準化されたアプローチを維持することが重要です。本手順に続き、後根神経節の単離とその後のカルシウムイメージングなどの他の手法を実施することで、多くの疾患の病態形成に胃腸神経系のどのリレーステーションが関与しているかを評価することが可能です。

本手法の開発により、神経科学分野の研究者は、胃腸研究における複数の疼痛症候群の発症機序を探索することが可能となりました。このビデオを視聴することで、マウスの胃腸管から空腸求心性神経を単離し、ランプ伸展（ramp distension）中の神経活動を記録する方法について十分に理解することができます。