マウス空腸および結腸セグメントにおける腸間膜求心性神経活動のin vitro記録で

この技術の全体的な目標は、ランプの膨張と化合物の適用に応答して、単一の空腸または結腸神経束からのin vitro内臓求心性神経活動を記録することです。この方法は、消化管に供給する求心性神経がさまざまな病状で過敏になるか脱感作になるかなど、神経科学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、in vitroで神経放電の記録を可能にすることと、中枢神経系の調節や入力なしに神経活動を定量化できることです。

この技術の意味は、神経感作が病因に大きな役割を果たすため、過敏性腸症候群などのいくつかの疼痛症候群の治療または診断にまで及びます。一般に、この方法に不慣れな個人は、神経束の解剖と記録された信号の単一ユニット分析にかなりの量のトレーニングが必要なため、苦労するでしょう。この手順を開始するには、犠牲にしたマウスを仰臥位に置きます。

剣状突起から恥骨まで伸びるメスを使用して、皮膚と腹筋層を通じて腹部正中線切開を行います。その後、腹腔内組織が乾燥するのを防ぐために、冷たいクレブス溶液で腹腔をすすぎます。次に、鋭利なハサミを使用して、十二指腸空腸の屈曲からすぐに小腸の約 20 センチメートルを取り除き、空腸全体を急速に切除します。

周囲の構造を傷つけないように注意し、空腸血管や求心性神経を含む腸腸間膜を無傷に保ちます。次に、切除した空腸を氷上の冷たいクレブス溶液に入れ、カルビゲンで連続的に酸素を供給します。次に、空腸を約3センチメートルの長さのループに切ります。

血管と内臓神経を含む腸間膜束をそれぞれのループの中心近くに配置して、記録チャンバーへのループの取り付けを容易にします。その後、鈍いカテーテルを使用して各セグメントをクレブス溶液で洗い流し、管腔内容物と粥液(in vitro)で組織サンプルの劣化を促進する消化酵素が含まれているため、それらを取り除きます。その後、求心性神経活動を測定するためのセグメントを選択し、シリコーンエラストマー層でコード化された記録チャンバーに入れます。

記録チャンバー内のクレブス温度を摂氏34度に保ちます。次に、空腸セグメントをオルガンバスに取り付けて、口腔端が管腔の流れを提供するシリンジドライバーに接続され、口端が流出に接続するようにします。セグメントを少し伸ばしますが、過度の張力をかけないように注意してください。

両端をシルクリガチュールを使用してインポートとアウトフローポートにしっかりと取り付けます。その後、シリンジドライバーを口腔端に取り付け、空腸セグメントをクレブス溶液で1時間あたり10ミリリットルで腔内灌流します。.取り付けられた腸セグメントの腸間膜をシリコンエラストマーの底層に対して平らに固定します。

次に、腸間膜束の視覚化を最適化するために、腸間膜を伸ばします。次に、腸セグメントの管腔内圧が60ミリメートル水銀柱に達するまで出力ポートを閉じてランプ膨張のテストを行い、マウントされたセグメントから管腔内クレブス溶液が漏れていないことを確認します。管腔内圧の滑らかな上昇を中断することなく観察します。

初期膨張期には、セグメントの小さな収縮が予想されます。必要に応じて、L型カルシウムチャネル遮断薬ニフェジピンの1マイクロモルをクレブス溶液に追加して、蠕動活性をブロックします。.実体顕微鏡下で、脂肪組織に埋もれている血管と求心性神経を傷つけないように注意しながら、2つの小さなピンセットで腸間膜から脂肪組織をそっと剥がし始めます。

空腸から離れたところで脂肪組織を剥がし始め、腸間膜束の両方の血管を露出させます。両方の血管の間にある求心性空腸神経を、脂肪組織にカプセル化された細い白い糸として特定します。次に、ピンセットを使用して脂肪組織をそっと剥がすことにより、空腸に向かってより近位に解剖します。

次に、神経に付着している脂肪組織を切除することにより、セグメントの空腸腸間膜神経を解剖します。鋭利な組織ハサミを使用して神経を切断します。必要に応じて、残りの脂肪と結合組織、および心幹鞘をそっと引っ張って剥がします。

この手順では、マイクロマニピュレーターを使用して、吸引電極の先端を臓器浴に下げます。次に、オルガンバスからクレブス溶液を静かに吸引し、電極の先端がクレブス溶液に浸るようにします。クレブス溶液が吸引電極内のワイヤー電極を覆っていることを確認します。

次に、吸引電極の先端を切断された求心性神経鎖のすぐ隣に配置し、切断された神経鎖をその全長にわたって毛細血管に引き込みます。電極の先端を脂肪組織に向かって操作し、プランジャーでガラス毛細血管に吸引し、それによって毛細血管内の神経を臓器浴の内容物から機械的に密封します。周囲の脂肪組織の一部をキャピラリーに吸引することにより、記録チャンバーからガラスキャピラリーを適切に密閉することは、最終的に最終分析を妨げる冗長なバックグラウンドノイズを最小限に抑えるために極めて重要です。

求心性神経活動の記録を確認するには、出力ポートを閉じて求心性発火の増加を誘発するランプ拡張を実行し、腸セグメントの圧力を徐々に上昇させます。目的の実験プロトコルは、3回連続したランプ膨張により再現性のあるマルチユニット放電が得られる場合にのみ行ってください。神経分離後、実際の実験を行う前に、安定した自発的な求心性神経活動を得るために、調製物を15分間安定させます。

ここに示されているのは、機械感受性プロファイルに基づくさまざまな求心性線維ユニットの概略図です。低閾値繊維は、主に低膨張圧で神経活動の増加を示し、その結果、LTパーセンテージが55%を超えます。広いダイナミックレンジのファイバーは、全膨張中に神経活動が徐々に増加しますが、機械的に鈍感なファイバーは、膨張圧力の増加に反応しません。

この図は、野生型マウスのランプ膨満時の腸間膜求心性神経の放電を示しています。二相性膨張プロファイルでは、神経放電の初期増加は低い閾値と広いダイナミックレンジの線維によるものであるのに対し、高い閾値と広いダイナミックレンジの線維は放電の2番目の増加に寄与することに注意してください。習得すると、空腸神経の分離と最初のベースライン記録は、適切に実行すれば1時間未満で行うことができます。

臓器浴に投与される化合物の効果を研究するには、より多くの時間が必要です。この手順を試行する際には、すべての実験で同じセグメントを一貫して特定するなど、十分に標準化されたアプローチを維持することを忘れないようにすることが重要です。この手順に続いて、胃腸神経系のどの中継ステーションがいくつかの疾患の病因に関与しているかを評価するために、後根神経節の分離とその後のカルシウムイメージングなどの他の方法を実行できます。

その開発後、この技術は、神経科学の分野の研究者が胃腸研究におけるいくつかの疼痛症候群の病因を探求する道を開きました。このビデオを見た後、マウスの胃腸管から空腸求心性神経を分離する方法と、ランプの膨張中にそこから活動を記録する方法についてよく理解できるはずです。