Name: 調整可能なナノ細孔を介してナノ粒子の転ベロシティを経由してゼータ電位の決意：例として、DNA修飾された粒子を用いました (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: 学ぶ 調整可能な抵抗パルスセンシング（TRPS）を用いてDNA修飾ナノ粒子のゼータ電位を測定する方法。個別粒子の表面化学特性を解析し、バイオアッセイ開発に応用可能なナノ材料分析技術を習得できます。

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著者は彼らのサポートのためにIZONサイエンス株式会社に感謝します。仕事は研究（PCIG11-GA-2012から321836 Nano4Bio）のために欧州委員会によってサポートされていました。

1.のTween-20（PBST）緩衝液でリン酸緩衝生理食塩水を作ります<ol><li> 200ml中に脱イオン水（18.2MΩセンチ）を一度PBS錠（0.01 Mリン酸緩衝液、0.0027 M塩化カリウム、0.137 M塩化ナトリウム、pH7.4）に溶解します。 </li><li>界面活性剤として200ミリリットルの緩衝溶液に100μlの（0.05（v / v）の％）のTween-20を追加します。 </li></ol> 2.カルボキシルポリスチレン粒子基準の準備<ol><li>粒子の単分散性を作り出す80ワットで2分間超音波処理の前に30秒間の較正粒子を渦。 </li><li> 30秒間PBST緩衝ボルテックスで1×10 10粒子/ mlの濃度に校正粒子100 1を希釈。 </li></ol> 3.準備ストレプトアビジン被覆粒子<ol><li>単分散性を確保するため、80ワットで2分間超音波処理の前に30秒間の粒子を渦。 </li><li>交流のPBST緩衝液中に100でストレプトアビジン被覆粒子1を希釈30秒間得1×10 9粒子/ mlの濃度と渦をhieve。 注：典型的なサンプルの容量は200μlです。例えば、調査している場合5 DNA濃度は、希釈したストレプトアビジンでコーティングされた粒子の1ミリリットルを用意します。 </li></ol>オリゴヌクレオチドの4準備<ol><li> 100μMの結果の濃度になるように脱イオン水を有するオリゴヌクレオチドを再構成します。 </li></ol>ストレプトアビジン被覆粒子に捕捉プローブ（CP）DNAの5追加<ol><li> DNA結合に先立って、渦80ワットで2分間の超音波処理に続いて30秒間、ストレプトアビジンでコーティングされた粒子（200μlのサンプル容量）。 </li><li>供給業者によって提供される結合能力（4,352ピコモル/ mgで）に基づいて、10、20、30、40、47、95、140、および210 nmのDNAの濃度を生じるために粒子にDNAの適切な濃度を加えます。 </li><li>室温で回転ホイール上で10秒と場所のためのサンプルをボルテックス30分には、ストレプトアビジン - ビオチン相互作用を介して粒子表面に結合するDNAを可能にするため。 </li><li>キャプチャDNAは、ストレプトアビジンでコーティングされた粒子を添加してインキュベートした後、30分間磁気ラック上にサンプルを置くことにより、磁気分離を介して、溶液中の余分なDNAを除去。 </li><li>磁石に最も近い粒子の新たに形成されたクラスタを乱さないように注意しながら、上清を除去し、新しいPBST緩衝液の同量と交換してください。 </li></ol>前記CP粒子に相補的なDNAにハイブリダイズ<ol><li>到達した最大結合可能な標的を確実にするために（500 nmでの過剰で）標的DNAの必要量を加えます。 </li><li>ボルテックス室温で30分間回転ホイール上で10秒と場所のためのサンプル。 </li><li>ハイブリダイゼーションが完了すると、30分間磁気ラック上にサンプルを置くことにより、磁気分離を介して過剰の標的DNAを除去。 </li><li>上清を除去、磁石に最も近い粒子の新たに形成されたクラスタを乱し、そして新しいPBST緩衝液の同量と交換しないように注意して。 </li><li>繰り返しは6.1二連のサンプル6.4に段階的に説明し、DNAハイブリダイゼーション時間を調査するために16時間室温で回転ホイール上でこれらのサンプルを配置します。 </li></ol> 7. TRPSのセットアップ<ol><li>代わりにソフトウェアを備えたコンピュータシステムに楽器を接続します。 </li><li>キャリパーを使用して初期ストレッチを調整します。 <ol><li>二つの平行な顎の外側との間の距離を測定します。 </li><li> 「機器の設定」タブで「ストレッチ」フィールドにストレッチを入力し、タブの下に「ストレッチをキャリブレーション」をクリックして、ソフトウェアに入力します。 </li></ol></li><li>横方向に上向きにナノ細孔のID番号を持つ顎に分析するための適切なサイジングのポリウレタンナノ細孔膜にフィット。次に、使用して分析に必要なストレッチに顎を伸ばします楽器側のストレッチ調整ハンドル。 43と48ミリメートルの間に顎を伸ばします。 注意：その校正粒封鎖のサイズは、少なくとも0.3 nAにあるので、ストレッチの正確な値は、印加電圧と一緒に決定されます。ストレッチは既にステップ7.2でソフトウェアに入力され、ジョーが引き伸ばされるように自動的に調整されます。 </li><li>確実に、ナノ細孔の下に、下の流体セルにPBST緩衝液の80μLを置き、測定に影響を与える可能性が存在する気泡はありません。見ての気泡がある場合は、バッファを取り外して交換。 </li><li>所定の位置に上部流体セルをクリックして、そこにバッファ40μlのを置き、再び確保気泡が存在はありません。気泡が上部流体セル内に存在する場合、液体を交換することによってそれらを除去します。 </li><li>再現性のあるベースライン電流は緩衝液で上部流体セルを交換するから到達したときに、「目をクリックすることで、上部流体セルと対策への試料の40μlを添加しますソフトウェア画面上のデータ収集」タブ」の「アート。 注：これは（ &#39;解析設定」と「抵抗封鎖」の下で）「Analyseをデータ」タブを介してソフトウェアを使用して変更することができるが、データの取得は、0.05 nAのの封鎖の大きさの下限値と周波数50kHzで完了する。 </li><li>測定上の電気バックグラウンドノイズを低減するために、流体セルシステムの上にファラデーケージを置きます。 </li><li>サンプルに圧力または真空を適用するために可変圧力モジュール（VPM）を使用します。 <ol><li>外部圧力が上位流体セルにノズルを接続し適用するには、その後、圧力アームを回転させ、（正圧（PRE）または真空（VAC）が適用されるかどうかに応じて）所定の位置にクリックします。 </li><li> VPMの上に位置する圧力ステージノブを使用して、「センチ」や「ミリメートル」のスケールに圧力を適用します。 T &#39;センチ&#39;規模で圧力を適用し、上方向に引っ張ってダウンノブを押しO &#39;ミリメートル&#39;規模で圧力をかけます。 </li></ol></li></ol> TRPS解析のための8の準備のサンプル<ol><li> 80ワットで2分間30秒、超音波処理のための渦サンプルTRPS分析の前に。 </li></ol> 9.ゼータ分析のためのナノ細孔のキャリブレーション<ol><li>上部流体セルに40μlの校正粒子（1×10 10粒子/ ml）を配置した後、3は印加電圧で（セクション7のようにセットアップ）TRPSの測定を完了。 「+」をクリックすることで、電圧を変化させ、 &#39; - &#39;ソフトウェアの「機器の設定」タブ内の電圧スケール上のボタン。 </li><li> NAは3電圧は約140、110のバックグラウンド電流を返すことを確認し、80。中電圧で校正粒子は少なくとも0.3 nAの平均封鎖の大きさを生成することを確認してください。 </li><li>校正粒子の平均半値全幅（FWHM）の期間は、少なくともあるように圧力を適用します0.15ミリ秒。可変圧力モジュールに取り付けられた圧力アームを使用して手動でこれを行います。それが所望の位置にクリックし、ステップ7.8.2での設定の指示に従って、それに応じて適用するまで、アームを回転させることにより、選択圧（PRE）または真空（VAC）。これらの条件が達成されたら、「データ収集」タブにソフトウェア上の「スタート」をクリックして実行を開始します。 </li><li>少なくとも500個の粒子を測定した（測定時のソフトウェア画面の下部にある「粒子数」を参照）、ランが30秒を超えた場合に「データ収集」タブで「停止」を押すことで実行を完了します（参照 &#39;また、画面の下に向かって実行時間」）。 </li><li>新しいナノ細孔は、ステップ9.1から9.4を完了することによって導入されるか、または分析の各新しい一日のためにされるたびに説明したように、キャリブレーションの実行を完了することによって、システムのキャリブレーションを行います。 </li></ol> 10.サンプルの実行<ol><li>最高でサンプルを実行しますか、同様の（±10 NA）を確保することで、キャリブレーションサンプルとしての第2の最大電圧、そうでない場合と同じ、ベースラインの電流。 <ol><li>適切なベースライン電流が達成されると、サンプルの40μlの上部流体セル内の電解液を交換してください。試料が導入されると、封鎖は、信号トレースに見られるであろう。 「ファイル名を指定して実行を参照してください（「データ収集」タブで「開始」および500個の粒子の最小値を記録（信号トレースの下に位置する「粒子数」を確認してください）と実行時間を確保クリックして実行したサンプルは、30秒の最小値です開始また、信号トレースの下に位置する時間 &#39;）。 </li><li>測定を完了するためには、「データ収集タブ」で「停止」をクリックして、データファイルを保存します。 </li></ol></li><li>ファイル、次の形式で入力ファイル情報を保存するには、 「調査」は、ファイルが保存されるフォルダで、「ナノポアID」は、使用されている細孔のシリアル番号である「パーツ＃ &#39;Iそれはキャリブレーションやサンプル測定であるかどうかを「キャリブレーションまたはサンプル」の詳細、気孔のタイプ（ すなわち 、NP150 / NP200）、「サンプルID」は、サンプルの名前です。■サンプルを希釈した場合、「希釈は&#39;（使用されています（cm単位でサンプルを100倍に希釈した場合は100を入力し）、「圧力」は、サンプルに加えられた圧力である - セクション7.8を参照）、「電解IDが &#39;&#39;バッファサンプルがで構成されているの名前であり、注意事項は、「サンプルまたは実行に関する個人的なメモです。 </li><li>各サンプル実行の間に、上部流体セルに数回PBST緩衝液の40μLを配置し、様々な圧力を適用することによって、システムを洗浄（通常、-10 -5センチ（真空）、および5〜10センチ（正圧））までこれ以上の封鎖イベントがシステム内に残っていない残留粒子とサンプル間のためノークロスコンタミネーションがない確実に、存在しています。 WELとして実行する各繰り返し試料の間に完成し、この洗浄工程を三連で実行したサンプル異なるサンプル間としてリットル。 </li></ol>

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<html>ゼータ電位の計算はArjmandi らが仕事に関連するキャリブレーションに基づく方法を使用する。21。それらはナノ細孔を横切るように、粒子の移動の持続時間は、通常、円錐形細孔の全体にわたる平均電界及び粒子速度を使用し、印加電圧の関数として測定されます。電気泳動移動度は、検知ゾーンの長さの二乗、Lを乗じた電圧に対して1 / Tの誘導体（Tは遮断期間である）、です。検知ゾーンを通る複数の基準点の平均速度は、この方法を用いてゼータ電位を計算する際に最小の誤差を許容するために測定されます。 細孔の較正は、検知ゾーン内の各基準点の電圧、V、対1 / Tの線形性に基づいています。キャリブレーションサンプルの粒子の動電粒子速度、&quot;/&gt; / 54577 / 54577eq2.jpgをアップロードし、 <img alt="式3" src="/files/ftp_upload/54577/54577eq3.jpg" />それぞれ、それらのゼータ電位に関連しています、 <img al...

官能化ナノ粒子は、両方の医療や環境分野におけるバイオセンサーとしてますます人気が高まっています。 DNAと、ナノ粒子の表面の化学的性質を変化させる能力は、例えば、標的化薬物送達システム1のために有用な証明及びDNAタンパク質相互作用2-4を監視しています。バイオアッセイおよび治療薬の送達に利用されてますます一般的ナノ粒子の宿泊施設には、超常5です。超常磁性粒子（のSPP）は、複雑な混合物から特定の検体を識別し、除去するのに非常に有用であり、単一の磁石の簡単な使用して行うことができます。一旦除去、分析物結合粒子の特徴及び目的に適合して分析することができます。 ナノ粒子の検出および特徴付けのために使用される従来の方法は、そうでなければ、光子相関分光法として知られているような、動的光散乱（DLS）のような光学技術を含みます。ハイテクが、GHスループット技術は、DLSは、平均に基づく技術であることに制限され、専門のソフトウェアを追加することなくマルチモーダルサンプルを分析する場合、より大きな粒子が6,7完全に気づか小さな粒子の一部を残して、はるかに支配的な信号を生成します。粒子によって粒子特性評価技術は、ナノ粒子と、官能化ナノ粒子システムを解析することがはるかに有利です。 RPSベースの技術は、試料に電界を印加し、合成または生物学的ナノポアを通って粒子の輸送機構を監視周りに基づいています。 RPSに基づいて、比較的最近のナノ粒子検出および特性評価技術は、波長可変抵抗パルスセンシング（TRPS）8-16です。 TRPSは、エラストマー、調整可能な細孔膜によって分離された2つの電極システムです。形状17と大きさの範囲の検体は、それらのトランスを介して測定するための調整可能なポア方法が可能に細孔を通してポートメカニズム。調整可能な細孔は、以前に、このような透過電子分光法（TEM）10のような他の技術に匹敵する結果を生成する小さい粒子（70〜95 nmの直径）の検出のために使用されてきました。電界が印加されると、イオン電流が観測された粒子/分子が細孔を通過するように、それらは、一時的に「遮断事象」と定義することができる電流の減少を引き起こし、細孔をブロックします。試料中の各粒子が封鎖振幅、Δに基づいて個別に特徴づけることができるように、それぞれの遮断イベントは、単一粒子の代表であります<img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/54577/54577eq1.jpg" /> 、および全幅半値、FWHM、ならびに他の封鎖特性。 TRPSとしてマルチモーダルサンプルが正常にかつ効果的にアモンのサイズの粒子の範囲を識別することができるために、彼らはナノ細孔を通過する個々の粒子を分析することが有利です単一のサンプルをGST。調整可能な抵抗パルスセンシングは、単一の実行で同時にサイズ10、ゼータ電位12,18と濃度15測定を完了し、したがって、依然として同様のサンプルを区別、そうでない場合は、それらの表面電荷19によって同じサイズすることができます。代替サイジング技術に勝る利点。 ゼータ電位は、剪断20の面に静電電位として定義され、そしてそれらは、細孔19を通過するように粒子速度から算出されます。個々の粒子のゼータ電位測定は、このように転座のメカニズムと溶液中のナノ粒子系、応用範囲のためのナノ粒子アッセイ設計の未来のための貴重な情報の挙動への洞察を提供します。このような性質の粒子によって粒子分析はまた、より多くの情報oを可能にする、探求するサンプル集団の中でゼータ電位値の普及と流通を可能にします溶液中のn個の反応速度論（例えば、二本鎖DNAを一本鎖）と粒子安定性が達成されます。 ここでは、非修飾およびDNA修飾両方SPP面を検出し特徴付ける技術が記載されています。本明細書に記載されたプロトコルは、無機および生物学的ナノ粒子の範囲に適用可能であるが、我々はアプリケーションの彼らの広い範囲のためにDNA修飾された表面を使用して手順を示しています。技術は、ユーザは、このように粒子転位細孔系を介して速度およびそれらのゼータ電位に基づいて、ナノ粒子表面上に一本鎖および二本鎖DNA標的を区別することを可能にします。

<table><tbody><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>P4417</td><td>1錠 200°C&nbsp;緩衝液を作るためのml脱イオン水。</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>P1379</td> 界<td>面活性剤としてのPBS緩衝液中の0.05% (v/v)</td></tr><tr><td></td><td>Bangs Laboratories, US</td><td>CPC200</td><td>公称直径220&nbsp;nm、生濃度 1 x 1012 粒子/mL、比表面電荷 86 & μ;eq/g(表面電荷密度3.2×1019C/nm2に相当。</td></tr><tr><td>ストレプトアビジン被覆ナノ粒子</td><td>Ademtech、フランス</td><td>3121</td><td>バッチは、1.1 x 1011粒子/ mlの生濃度で4,352 pmol/mg(188 nM理論上のDNA結合能)の結合容量を有していました。</td></tr><tr><td>ビオチン化オリゴヌクレオチド</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>VC00001</td><td>サプライヤー仕様: 逆フェーズ 1 精製 (0.05 スケール);3'末端のビオチン修飾;凍結乾燥粉末を100に再構成&nbsp;&マイクロ;脱イオン水を使用してMし、必要に応じて希釈します。配列: CP 5'ATGGTTAAACCTCACTAC
GCGTGGC[Btn]3'</td></tr><tr><td>標準オリニョヌクレオチド</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>VC00001</td><td>サプライヤー仕様: 逆フェーズ 1 精製 (0.05 スケール);凍結乾燥粉末を100&microに再溶解;脱イオン水を使用してMし、必要に応じて希釈します。DNAターゲットの配列:完全相補的-5'GCCACGCGTAGTGA
GGTTTAACCAT3'、ミドルバインディング - 5'GTAGTGAGGT3'、エンドバインディング - 5'GTTTAACCAT3'、部分的に補完的なオーバーハング - 5'GTGAGGTTTAACCAT
TTTTTTTTTTTTTTT3'。</td></tr><tr><td>Izon qNano</td><td>Izon Science, NZ</td><td></td><td>47&nbsp;Pa</td></tr><tr><td>Izon 可変圧力モジュール (VPM)</td><td>Izon Science, NZ</td><td></td><td>各「cm」圧力は約100 Paに相当します。</td></tr><tr><td>ポリウレタンナノ細孔膜</td><td>Izon Science, NZ</td><td>NP150</td><td>分析物サイズ範囲 60-480 nm, 細孔径は45 mmストレッチで799 nmと計算されています。&nbsp;</td></tr><tr><td>Magrack 6</td><td>GE Healthcare, UK</td><td>28-9489-64</td><td></td></tr><tr><td>Sonic Bath</td><td>Fisher Scientific, UK</td><td>10692353</td><td>80 Watts</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>IKA, Germany</td><td>0003365000</td><td></td></tr><tr><td>ロータリーホイール&nbsp;</td><td>ラブネットインターナショナル、US</td><td>H5500-230 V</td><td></td></tr></tbody></table>

調整可能なナノ細孔を介してナノ粒子の転ベロシティを経由してゼータ電位の決意：例として、dna修飾された粒子を用いました

Determination of Zeta Potential via Nanoparticle Translocation Velocities through a Tunable Nanopore: Using DNA-modified Particles as an Example

抵抗パルスセンサ（RPS）と総称ナノポア技術は、検出、定量化、およびタンパク質分子とナノ粒子を特徴付けるために使用されています。調整可能な抵抗パルスセンシング（TRPS）がリアルタイムに変化させることができる調整可能な細孔を組み込んRPSへの比較的最近の適応です。それらは、DNA濃度および構造の関数として調整可能なポアメンブレンを横切るようにここでは、DNA修飾ナノ粒子の移動時間を監視するためにTRPSを使用する（ すなわち 、一本鎖、二本鎖DNAに）。 TRPSは、印加された電界に応じて安定したイオン電流を確立エラストマー細孔膜で分離された2つのAg / AgCl電極、に基づいています。様々な光学ベースの粒子特性評価技術とは異なり、TRPSは、マルチモーダルサンプルを容易に分析することを可能にする、サンプル集団の中で個々の粒子を特徴づけることができます。ここでは、ゼータ電位測定を実証します既知の標準粒子転速度を介して、したがって、それらの分析物のゼータ電位を測定し、その結果、検体転時間をサンプリングするためにこれらを適用します。 同様に、平均ゼータ電位の値を取得するなど、サンプルが全て例えば、サンプル母集団の分布を介して与えられたサンプルについての詳細を示す粒子ごとの粒子の視点を用いて測定されます。そのような中で、この方法は、医療や環境分野の両方のためのセンシングアプリケーション内で可能性を示しています。

<img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54577/54577fig1.jpg" /> 磁気精製およびTRPS測定の方法の 1 模式図を 図 。 A）過剰な、未結合の捕捉プローブDNAを含む試料で開始サンプルの磁気精製の例。B）TRPS測定例をi）は、粒子がナノポアを通過すると、ii）粒子から製造遮断イベントが一時的に一時的な低下を引き起こす細孔中のイオンを吸蔵現在で;粒子転速度を計算するために使用された情報です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54577/54577fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> いずれも報告...

ここでは、個々のナノ粒子のゼータ電位を決定するために用いることができる粒子転速度の測定を介してナノ粒子表面化学を特徴づけるために、抵抗パルスセンシング技術に一体化ポリウレタン可変ナノポアを使用します。

調整可能なナノ細孔を介してナノ粒子の転ベロシティを経由してゼータ電位の決意：例として、DNA修飾された粒子を用いました

Nanopore technologies, known collectively as Resistive Pulse Sensors (RPS), are being used to detect, quantify and characterize proteins, molecules and ...

本手順の全体的な目的は、可変抵抗ポストセンシング（TRPS）を用いてナノ粒子の表面化学的特性を評価し、材料のゼータ電位を決定することです。ここでは、DNA修飾ナノ粒子の特性評価を通じてこれを実証します。この手法は、ナノ材料の特性評価およびバイオアッセイの開発における重要な課題を解決するのに役立ちます。この手法の主な利点は、粒子ごとの分析を完了できることです。各DNA粒子の信号がゼータ電位の測定値に変換されるため、分析対象サンプルの全体像を把握することが可能です。従来の手法では、材料の特性評価に関する知見を得ることができました。また、細胞、ウイルス、DNA、およびタンパク質の検出のためのバイオアッセイの開発など、他のアプリケーションにも適用可能です。一般的に、この手法に不慣れな方は、単にサンプルを注入して結果を待つだけではないため、習得に苦労する可能性があります。科学者による一定の操作的な介入が必要です。この手順を開始するには、まずストレプトアビジンコート粒子を30秒間ボルテックスし、次いで80 Wで2分間ソニケーションして単分散性を確保します。ストレプトアビジンコート粒子をPBSTバッファーで100倍に希釈し、最終濃度を1×10⁹ particles/mLにします。その後、粒子を30秒間ボルテックスします。粒子に対するDNAの適切な濃度に基づき、結合容量を1mgあたり4,352 picomolsとして、最終濃度が10、20、30、40、47、95、140、および210 nanomolarとなるように調製します。サンプルを10秒間ボルテックスした後、室温で30分間回転ミキサーに設置し、ストレプトアビジンとビオチンの相互作用を介してDNAを粒子表面に結合させます。捕捉したDNAを粒子に添加し、インキュベーションした後、サンプルをマグネットラックに30分間静置し、磁気分離によって過剰なDNAと溶液を除去します。続いて、磁石に最も近い位置に形成された粒子クラスターを乱さないように注意しながら、上清を除去します。その後、上清と同量の新鮮なPBSTバッファーを加えて置換します。次に、ターゲットの結合を最大限に確保するため、各サンプルに規定量のターゲットDNAを添加します。サンプルを10秒間ボルテックスします。その後、室温のロータリーホイールに置き、30分間静置します。ハイブリダイゼーションが完了したら、サンプルをマグネットラックに30分間置いて磁気分離を行い、過剰なターゲットDNAを除去します。次に、磁石に最も近い位置に形成された新しい粒子クラスターを乱さないように注意しながら、上清を除去します。その後、上清と同量の新しいPBSTバッファーと置換します。重複サンプルについても同様の手順を繰り返した後、DNAハイブリダイゼーション時間を検討するため、サンプルを室温のロータリーホイールに16時間設置します。ここで、ソフトウェアがインストールされたコンピュータシステムにTRPS装置を接続します。ノギスを用いて、2つの平行なジョーの外側間の距離を測定します。装置設定タブのストレッチフィールドにその距離を入力し、タブの下にある「calibrate stretch」をクリックします。次に、分析に適したサイズのポリウレタンナノポア膜を、ナノポアID番号が上を向くようにしてジョーに側面から装着します。続いて、装置側面のストレッチ調整ハンドルを使用して、分析に必要な伸展量までジョーを伸ばします。ナノポア下の下部流体セルに80 µLのPBST緩衝液を注入し、測定に影響を与える気泡がないことを確認してください。次に、上部流体セルをカチッとはめ込み、気泡が入らないように注意しながら40 µLの緩衝液を加えます。その後、システムにファラデーケージを被せ、テキストプロトコルに従って外圧を加えます。上部流体セルに40 µLの校正粒子を導入した後、3つの印加電圧でTRPS測定を行います。ソフトウェアの機器設定タブにある電圧スケールのプラスボタンとマイナスボタンをクリックして、電圧を変更します。3つの電圧において、適切なバックグラウンド電流が返されることを確認してください。また、中程度の電圧において、キャリブレーション粒子が少なくとも0.3 nanoamperesの平均ブロッキング強度を生成することを確認してください。テキストプロトコルに記載された条件が整ったら、データ収集タブ内の「start」をクリックしてランを開始します。測定を完了するには、データ収集タブの「stop」をクリックし、データファイルを保存してください。キャリブレーション粒子を40 µLのPBSTバッファーに置き換え、上部流体セルに数回注入してシステムを洗浄します。残存粒子がなく、交差汚染がないことを確認しながら、ブロッキングイベントが見られなくなるまでさまざまな圧力を加えます。適切なベースライン電流が得られたら、上部流体セルの電解質を40 µLのサンプルに交換します。データ収集タブの「start」をクリックして、サンプルの測定を開始します。最低500個の粒子を記録し、測定時間が最低30秒になるようにしてください。測定を完了するには、データ収集タブのストップをクリックし、データファイルを保存します。ここでは、未修飾のストレプトアビジンコート粒子と、表面に一本鎖DNAを飽和させたストレプトアビジンコート粒子のサイズおよびゼータ電位分析の例を示します。どちらのサンプルも同様のサイズでしたが、粒子表面にDNAを機能化させた場合、ゼータ電位は有意に異なり、大幅に増大しました。ストレプトアビジンコーティング粒子にハイブリダイズさせたDNAの濃度が最も低いサンプルと最も高いサンプルのサイズおよびゼータ電位のデータをここに示します。より高濃度のDNAをハイブリダイズさせた粒子ほど、より大きなゼータ電位の値が記録されています。キャプチャー用プローブDNAのみ、完全相補的なDNAターゲット、中間結合DNAターゲット、末端結合DNAターゲット、およびオーバーハングDNAターゲットについて測定したゼータ電位の変化をここに示します。この手法を習得すれば、適切に実施することで20分で完了できます。本手順を行う際は、サンプルの相互汚染を防ぎ、ナノポールの閉塞を防止するため、各キャリブレーションおよびサンプルの間にナノポールを十分に洗浄することが重要です。この技術の開発により、バイオセンサ分野の研究者がマルチプレックスアッセイを用いてタンパク質-タンパク質およびタンパク質-DNA相互作用を探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、TRPSを用いてゼータ電位を取得する方法と、バイオアッセイ用のDNA修飾粒子を調製する方法について深く理解することができます。

determination-zeta-potential-via-nanoparticle-translocation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

無機表面へのタンパク質の非特異的吸着を監視するための固体ナノ細孔を用いる方法が説明されています。方法は、リアルタイムで、単一分子レベルで検出対象にする吸着を可能に、抵抗パルスの原理を採用しています。単一タンパク質吸着のプロセスがはるかに平衡からなので、我々は同様にタンパク質吸着の定数見かけ一次反応速度の定量測定と一定のラングミュア吸着のために可能にする、合成ナノ細孔の並列配列の雇用を提案する。...

ソリッドステートナノ細孔を持つ監視タンパク質吸着

ナノ粒子トラッキング解析（NTA）とポリマー遺伝子送達ナノ粒子を評価するためのハイスループットフローサイトメトリーのためのプロトコルが記載されている。国税庁は、ナノ粒子の粒度分布およびプラスミド当たり粒子分布を特徴付けるために利用される。ハイスループットフローサイトメトリーは、遺伝子送達バイオマテリアルのライブラリの定量的なトランスフェクション効率の評価を可能にします。...

ナノ粒子トラッキング分析とハイスループットフローサイトメトリーによる高分子遺伝子デリバリーナノ粒子の評価

生体分子転位実験のために、溶液中の固体ナノ細孔を製造するための方法が提示される。高電界の短いパルスを印加することにより、ナノ細孔径がサブナノメートルの精度で制御可能に大きくすることができ、その電気的なノイズ特性が大幅に改善。この手順は、実験条件下で標準的な実験装置を用いてその場で実行される。...

サイズを微調整すると固体ナノ細孔のノイズを最小限

提示されたプロトコルは、細孔スパンの溶媒を含まない脂質二重層を使用した単一トランスポーターレベルでの膜タンパク質媒介輸送の分析を説明しています。これは、大量生産されたナノポアアレイチップの作成と、高度に並列化されたデータ取得および分析を組み合わせることで達成され、膜タンパク質エフェクタースクリーニングの将来の確立が可能になります。...

単一のタンパク質解像度で高並列ナノ細孔チップシステムにより分析膜輸送プロセス

ポリジメチルシロキサン(PDMS)の2つのマイクロチャネル間にナノ流体接合を作成するためのシリカコロイドナノ粒子の簡単な自己組織化技術を提案します。この技術を使用して、細孔径が~45...

コロイド粒子の自己組織化プロセスを介して、PDMSマイクロ流体チップ内のサブ50 Nmのナノ流体ジャンクショ​​ンを作成します

セミフレキシブル高分子は、生きているシステムで広く適用されているユニークな力学特性を表示します。ただし、ポリマーの剛性などのプロパティにはアクセスできませんので、生体高分子に関する体系的な研究は制限されます。本稿では、プログラム可能な DNA...

セミフレキシブル高分子を研究する多目的ツールとして DNA ナノチューブ

このプロトコルでは、磁性粒子の合成と DNA 結合の動的・電気泳動光散乱法による評価について説明します。粒子サイズ、彼らの多分散性の変化の監視に焦点を当てこのメソッドとを担う粒子表面のゼータ電位の主要な DNA...

バインドの動的・電気泳動光散乱による解析 DNA 磁性粒子

ここでは、生物学的ナノポアベースの電子プラットフォームを用いて、単一分子限界で離散金属酸素クラスター、ポリオキソメタレート(POM)を検出するプロトコルを提示する。この方法は、これらの分子の研究に使用される従来の分析化学ツールに対する補完的なアプローチを提供する。...

単一金属ナノ粒子の高解像度物理特性評価

ここでは、密閉型無線ナノポア電極の作製と単一ナノ粒子の衝突のそれに続く電気化学的測定のためのプロトコルを提案する.

単一ナノ粒子を分析するための密閉型無線ナノポア電極

ここでは、力に敏感な生体分子を最大1.2kHzの速度でナノメカニカル測定を行う高速磁気ピンセットのセットアップについて説明します。モデル系としてDNAヘアピンやSNARE複合体への応用を紹介しますが、メカノバイオイベントに関与する他の分子にも応用できます。...

力に敏感な素子のナノメカニカル測定のための高速磁気ピンセット

プラズモニックナノピンセットは、金ナノ構造の局在化表面プラズモン共鳴を利用して、ナノメートルスケールの光学場内にタンパク質を含む単一のナノ粒子をトラップします。散乱シグナルの変化により、タンパク質の存在とコンフォメーションダイナミクスが明らかになり、フルオロフォアの修飾や表面テザリングなしでのモニタリングが可能になります。...

プラズモニックナノピンセットを用いた単一非修飾タンパク質のコンフォメーションダイナミクスのモニタリング

学ぶ 調整可能な抵抗パルスセンシング（TRPS）を用いてDNA修飾ナノ粒子のゼータ電位を測定する方法。個別粒子の表面化学特性を解析し、バイオアッセイ開発に応用可能なナノ材料分析技術を習得できます。

調整可能なナノ細孔を介してナノ粒子の転ベロシティを経由してゼータ電位の決意：例として、DNA修飾された粒子を用いました

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