調整可能なナノ細孔を介してナノ粒子の転ベロシティを経由してゼータ電位の決意：例として、DNA修飾された粒子を用いました

この手順の全体的な目標は、Tunable Resistant Post Sensing(TRPS)を使用してナノ粒子の表面化学を特徴付け、材料のゼータ電位を決定することです。これは、DNA修飾ナノ粒子の特性評価によって実証されています。この方法は、ナノマテリアルの特性評価とバイオアッセイの開発における重要な質問に答えるのに役立ちます。

この手法の主な利点は、粒子ごとに分析を完了できることです。各DNA粒子信号はゼータ電位測定に変換され、分析対象のサンプルの全体像を提供します。最も古い方法では、材料の特性評価に関する洞察が得られる可能性があります。

また、細胞、ウイルス、DNA、タンパク質を検出するためのバイオアッセイの開発など、他のアプリケーションにも適用できます。一般的に、この方法に不慣れな個々の人は、サンプを注入して答えを待つだけではないため、苦労します。科学者からのインプットが必要です。

この手順を開始するには、モノ分散を確保するために、80ワットで2分間超音波処理する前に、ストレプトアビジン被覆粒子を30秒間ボルテックスします。ストレプトアビジン被覆粒子をPBSTバッファーで100分の1に希釈して、1ミリリットルあたり10〜9個の粒子の1倍の濃度を達成します。次に、粒子を30秒間ボルテックスします。

10、20、30、40、47、95、140、および210ナノモルの濃度の結果として生じる粒子へのDNAの適切な濃度で、ミリグラムあたり4、352ピコモルの結合容量に基づいています。サンプルを10秒間ボルテックスした後、室温で30分間回転ホイールに置き、DNAがストレプトアビジンビオチン相互作用を介して粒子表面に結合します。捕捉したDNAを添加し、粒子とインキュベートしたら、サンプルを磁気ラックに30分間置いて、余分なDNAと溶液を磁気分離によって除去します。

これに続いて、磁石に最も近い新しく形成された粒子のクラスターを乱さないように注意しながら、上清を取り除きます。次に、上清を同量の新しいPBSTバッファーと交換します。次に、必要な量のターゲットDNAを各サンプルに添加して、可能な限り最大のターゲット結合に到達したことを確認します。

サンプルを10秒間ボルテックスします。そして、室温で30分間回転ホイールに置きます。ハイブリダイゼーションが完了したら、サンプルを磁気ラックに30分間置くことにより、磁気分離によって余分な標的DNAを除去します。

次に、磁石に最も近い新しく形成された粒子のクラスターを乱さないように注意しながら、上清を取り除きます。次に、上清を同量の新しいPBSTバッファーと交換します。重複するサンプルについて前の手順を繰り返した後、サンプルを室温で16時間回転ホイールに置き、DNAハイブリダイゼーション時間を調査します。

この時点で、ソフトウェアが配置されたコンピュータシステムにTRPS機器を接続します。キャリパーを使用して、2つの平行なジョーの外側の間の距離を測定します。機器設定タブのストレッチフィールドに距離を入力し、タブの下にあるキャリブレーションストレッチをクリックします。

これに続いて、ナノポアID番号が上を向くようにして、分析に適したサイズのポリウレタンナノポアメンブレンを顎に横方向に取り付けます。次に、装置の側面にあるストレッチ調整ハンドルを使用して、分析に必要なストレッチまでジョーを伸ばします。ナノポアの下の下部流体セルに80マイクロリットルのPBSTバッファーを配置し、測定に影響を与える可能性のある気泡が存在しないことを確認します。

次に、上部の流体セルを所定の位置にカチッとはめ込み、40マイクロリットルのバッファーを追加して、気泡が存在しないことを確認します。次に、ファラデーケージをシステム上に置き、テキストプロトコルで説明されているように外部圧力を加えます。40マイクロリットルのキャリブレーション粒子を上部流体セルに入れた後、3つの印加電圧でTRPS測定を完了します。

電圧を変更するには、ソフトウェアの機器設定タブにある電圧スケールのプラスボタンとマイナスボタンをクリックします。3つの電圧が適切なバックグラウンド電流を返すことを確認します。また、中電圧では、キャリブレーション粒子が少なくとも0.3ナノアンペアの平均遮断マグニチュードを生成することを確認します。

テキストプロトコルで概説されている条件を達成したら、データ集録タブのソフトウェアで開始をクリックして実行を開始します。測定を完了するには、データ集録タブの停止をクリックし、データファイルを保存します。キャリブレーション粒子をPBSTバッファーを含む40マイクロリットルに交換して、上部流体セルに数回交換してシステムを洗浄します。

また、封鎖イベントがなくなるまでさまざまな圧力をかけ、残留粒子や相互汚染がないことを確認します。適切なベースライン電流が達成されたら、上部流体セルの電解液を40マイクロリットルのサンプルと交換します。データ集録タブで開始をクリックして、サンプルランを開始します。

500 個以上のパーティクルを記録し、実行時間が 30 秒以上であることを確認します。測定を完了するには、データ集録タブの停止をクリックし、データファイルを保存します。ここでは、修飾のないストレプトアビジン被覆粒子と、表面に一本鎖DNAで飽和したストレプトアビジン被覆粒子のサイズとゼータ電位解析の例を示します。

両方のサンプルは同様のサイズでしたが、DNAが粒子表面に官能基化されたとき、ゼータ電位は有意に異なり、はるかに大きかった。ここには、ストレプトアビジン被覆粒子にハイブリダイズされたDNAの濃度が最も低いサンプルと最も高い濃度のサンプルで示されたサイズとゼータ電位のデータが表示されます。高濃度のDNAとハイブリダイズされた粒子では、より大きなゼータ電位値が記録されます。

ここでは、捕捉プローブされたDNAのみ、完全相補的なDNAターゲット、中間結合DNAターゲット、末端結合DNAターゲット、およびオーバーハングDNAターゲットについて測定されたゼータ電位の変化を示します。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば20分で完了します。この手順を試行する際には、各キャリブレーションとサンプルの間でナノポールを徹底的に洗浄して、サンプル間の相互汚染がないようにし、ナノポールのブロッキングを防ぐことを忘れないでください。

その開発後、この技術は、バイオセンスの分野の研究者がマルチプレックスアッセイでタンパク質-タンパク質およびタンパク質-DNA相互作用を探索する道を開きました。このビデオを見れば、TRPSを使用してゼータ電位を得る方法と、バイオアッセイ用のDNA修飾粒子を調製する方法を十分に理解できるはずです。