の測定インビトロ HIV-1プレインテグレーション複合体の統合活動

この手順の全体的な目標は、HIV-1感染したSupT1細胞から単離されたプレインテグレーション複合体(PIC)のin vitroインテグレーション活性を測定することです。この方法は、HIV生物学におけるいくつかの重要な問題、特に特定の宿主因子やウイルス因子(ウイルスカプシドなど)がHIV-1 DNAの統合にどのように関与しているかに答えるものであり、そうすることで、抗レトロウイルス療法の新規標的を設計または特定するのに役立ちます。この方法の主な利点は、in vitroでの統合活性を測定するために、比較的少量のPre Integration複合体(PIC)調製物を必要とすることです。

この技術の意味は、HIV-1エイズの診断だけでなく治療にも及ぶ可能性があり、これは、この技術の初期のバージョンが、今日臨床で使用されている主要な抗HIV薬の1つであるHIV-1インテグラーゼ阻害剤の発見に重要であったため、この方法はHIV-1の統合を理解するためだけでなく、 しかし、RSVやMLVなどの他のレトロウイルスの研究にも適用できます。このプロトコルを実証するのは、研究室のポスドクフェローであるMuthukumar Balasubramaniam博士です。SupT1をHIV-1に感染させるには、BSL-2ラボで、ロズウェルパークメモリアルインスティテュートまたは10%FBSとペン連鎖球菌を補充したRPMI培地で、SupT1細胞を1ミリリットルあたり1〜2倍10〜6番目の細胞に維持します。

テキストプロトコルに従って感染性HIV-1の高力価を生成した後、培養フラスコからSupT1細胞をプールし、ピペッティングでよく混合し、血球計算盤でトリパンブルー排除染色を使用して生存細胞数を決定します。50ミリリットルの円錐形遠心分離管でウイルス感染ごとに106個の細胞を8倍分し、次にスイングバケットローターで細胞を500倍g、摂氏25度で5分間遠心分離します。細胞培養培地を取り出さずに、ペレット化された細胞を含むチューブをBSL-3ラボに移してさらに処理し、ペレットを乱さずにチューブから培地を慎重に吸引します。

次に、30ミリリットルのDNase I処理ウイルス接種物を細胞に加え、穏やかにピペッティングして混合し、混合物を2つの6ウェル組織培養プレートに均等に分配します。スピノキュレーションの場合は、培養プレートをプレートキャリアに入れ、スイングバケットローターで480 g、摂氏25度で2時間遠心分離し、細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%で5時間インキュベートします。感染した細胞を採取して溶解するには、各感染に対応する細胞を50ミリリットルの円錐形遠心分離チューブにプールします。

細胞を300倍g、摂氏25度で10分間遠心分離し、上清を慎重に吸引またはピペットで分注します。残留ウイルス粒子を除去するには、各ペレットにバッファーKマイナスマイナス2ミリリットルを加えて洗浄し、再度サンプルを回転させた後、ペレットを乱さないように、吸引またはピペットで上清を慎重に除去してから、再度洗浄を繰り返します。マイクロピペットで残留バッファーを慎重に取り除いた後、氷冷溶解バッファーK plus plusを使用して各ペレットを穏やかに再懸濁し、2ミリリットルの微量遠心チューブに移します。

細胞質プレインテグレーション複合体(PIC)を調製するには、サンプルを室温で10分間揺とり、次にチューブを摂氏4度に予冷したローターに入れ、1,500倍のgと摂氏4度で4分間遠心分離します。ペレットを乱すことなく、上清を新鮮な微量遠心チューブに慎重に移し、16, 000倍のgと摂氏4度で1分間回転させます。上清を新しい微量遠心チューブに慎重に移し、RNase Aを最終濃度の20μg/mLまで加え、内容物を30分間揺さぶらずに室温でインキュベー

スクロースを最終濃度7%まで加え、穏やかにピペッティングしてよく混合し、マイクロ遠心チューブにPICのアリコートを調製します。液体窒素で急速凍結し、マイナス80°Cの冷凍庫に入れて長期保存します。in vitro integrationまたはIVIアッセイで使用する標的DNAを調製するには、カスタムメイドのプライマーphiX174-ForwardおよびphiX174-Reverseを使用して、phiX174プラスミドDNAから2.0キロベース領域を増幅するPCR混合物を組み立て、テキストプロトコルに従ってプログラムを使用してPCRを実施します。

サンプルをゲル精製して分注した後、600ナノグラムのターゲットDNAを200マイクロリットルのPICに添加します。よく混ぜ合わせ、摂氏37度で45分間インキュベートします。SDS、EDTA、プロテイナーゼKを添加してIVI反応を停止させた後、反応内容物を十分に混合し、56°Cで一晩インキュベートします。

翌日、IVI反応から全DNAを精製するために、除タンパクしたサンプルに同量のフェノールを加えます。ボルテックスと遠心分離により2分間激しく混合します。フェノール抽出を繰り返す前に、上部水相を慎重に取り除き、新しいチューブに移してから、等量の1対1のフェノールクロロホルムを追加します。

チューブをボルテックスしてサンプルを2分間遠心分離して混合し、その後、上部水相を新しいチューブに移します。テキストプロトコルに従ってクロロホルムで抽出した後、グリコーゲンのマイクロリットルあたり0.1マイクログラム、0.3モルの酢酸ナトリウム、および2.5容量の氷冷100%エタノールを添加して、水相からDNAを沈殿させます。チューブを摂氏マイナス80度に一晩置きます。

翌日、サンプルを16, 000倍のgと摂氏4度で30分間遠心分離し、ペレットを乱さずに上清を慎重に取り除きます。PIC活性を定量するためのPCRを実施するには、ウイルスLTRとphiX174 DNAを標的とするプライマーを使用して、統合されたHIV-1 DNAの接合部を増幅する従来のPCRの最初のラウンドから始めます。ここで概説されているように、マスターミックスからテンプレートDNAを除いたものを組み立て、次に45マイクロリットルのアリコートを別々のPCRチューブに分注し、5マイクロリットルのテンプレートDNAまたはヌクレアーゼフリー水をコントロールとして追加します。

テキストプロトコルに概説されているプログラムを使用してサーモサイクラーで反応を実行し、次に2回目の定量PCRを実施し、テキストプロトコルに従ってデータを分析します。このIVIアッセイでは、SupT1をDNAse Iで処理したHIV-1と、HIV-1インテグラーゼ阻害剤であるRaltegravirの有無または存在で棘化しました。インキュベーション後、PICを単離し、精製したDNAを分析してウイルスDNAの組み込みを行いました。

ここに示すように、HIV-1 PICは、関連するウイルスDNAを標的DNAに強固に統合し、PICのIVI効率は、Raltegravirを添加した反応で大幅に低下し、このアッセイで測定されたHIV-1インテグラーゼへの組み込み活性を強く示唆しています。対照反応は、統合活性を示さなかった。さらに、PCR の 1 回目のラウンドで Taq ポリメラーゼを除外したコントロールは、組み込み産物を増幅しませんでした。

特に、PIC単独のコントロールからのデータは、ネステッドqPCR戦略が統合されたウイルスDNAを特異的に測定したが、PIC関連ウイルスDNAは測定しなかったことを示しました。まとめると、これらのデータはPICに関連付けられた統合アクティビティを示しています。一度習得すれば、PIC活性を定量化するためのウイルス調製とPCRアッセイを1週間で完了することができます。

SupT1細胞の感染と感染細胞からのPICの単離は1日で行うことができます。このビデオを見れば、HIV-1 PICの単離方法とin vitro統合活性の測定方法について十分に理解できるはずです。感染性HIV-1の高力価での作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を実行する際には、エプロンやガウンなどの防護服、二重手袋、保護眼鏡などの適切な予防策を常に講じる必要があることを忘れないでください。