Name: の測定インビトロ HIV-1プレインテグレーション複合体の統合活動 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: 学ぶHIV-1プレインテグレーション複合体のインビトロ統合活性測定法。SupT1細胞を用いてウイルスDNA統合を定量し、抗レトロウイルス治療の新規標的探索に貢献する技術です。

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この研究の一部は、CDにNIDA / NIHからの助成金DA024558、DA30896、DA033892、およびDA021471によってサポートされています。また、ヴァンダービルトCTSAはUL1RR024975、NCRR / NIH、NIMHD / NIHからU54グラントMD007593、およびテネシーCFARグラントP30のAI110527からMeharryトランスレーショナルリサーチセンター（MeTRC）CTSAグラントU54のRR026140を付与し、RCMIグラントG12MD007586を認めます。

1.ウイルス産生注：、感染性HIV-1の高力価を生成する活性化されたデンドリマーベースのトランスフェクション試薬を用いて、感染性HIV-1分子クローンによるヒト胎児腎臓（HEK）細胞株293Tをトランスフェクトします。リン酸カルシウムトランスフェクション法は、同等の結果が得られることが観察されています。 <ol><li>バイオセーフティレベル2（BSL2）ラボでは、シード8 10cmの皿当たり3×10 6 293T細胞mLの10％ウシ胎児血清（FBS）、ペニシリン、およびストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）の。培養物を37℃に設定したインキュベーター中で細胞を、5％CO 2、O / N。 </li><li>次の日は、各10cmの皿に細胞をトランスフェクトするために、血清および抗生物質を欠くDMEMの300μLの最終容量まで（ 材料表を参照）pNL4-3プラスミドDNAの8μgのを薄めます。 、トランスフェクション試薬の80μLを加え、ピペッティングによりよく混ぜ、そして室温でインキュベート5 - トランスフェクション複合体形成のための10分。 </li><li>吸引により皿から培地を除去し、血清および抗生物質を含む新鮮なDMEMのディッシュあたり7 mLを加え。 </li><li> 、トランスフェクション複合体に血清および抗生物質を含むDMEMの1 mLを加え、ピペッティングにより混合し、細胞に、この混合物を追加します。静かにトランスフェクション複合体の均一な分布を容易にするための皿を旋回。 </li><li>すぐにBSL3実験室、37℃に設定したインキュベーター内の場所および5％CO 2、および文化に48時間細胞を細胞を移します。 </li><li>ピペットを使用してウイルスを含む組織培養上清を回収した後、遠心分離管に移します。 5分間、300×gで遠心分離し、細胞および破片をペレット化し、その後、0.45μmの細孔サイズのシリンジフィルターを通して上清をフィルタリングします。 </li><li>この無細胞ウイルス調製物中の任意のキャリーオーバーのプラスミドDNAを除去するために、1時間、37℃でDNアーゼ1（20μg/ ml）で処置します。 </li><li>定量化するために、HIV-1力価、それは日常的な使用22ための迅速かつ適した方法であるように、p24の固有の酵素免疫測定法（ELISA）を使用します。 注：p24のELISAは、物理的な力価（ウイルス粒子の数）を測定することに留意すべきです。また、ウイルス関連RT活性（外因性RTアッセイ）またはウイルス感染性（TZM-BL指標細胞ラインベース感染性アッセイ）を測定すると、感染性ウイルス粒子の排他的な読み出しを提供します。 </li></ol>燮-T1細胞の2.ウイルス感染（BSL3研究室） <ol><li> BSL2ラボでは、10％の熱不活性化FBS、ペニシリン、および1のストレプトマイシン（スプリット比を補っロズウェルパーク記念研究所（RPMI）培地中に1.0×10 6及び2.0×10 6細胞/ mLの間のSup-T1細胞を維持します：2毎に2から3 D）。 、培養フラスコから燮-T1細胞をプールピペットでよく混和し、血球計およびトリパンブルー排除STを使用することにより生細胞数を決定しますメソッドをaining。 <ol><li> 50 mLのコニカル遠心管中の（ウイルス感染当たり）80×10 6細胞のアリコートの必要数を準備します。 </li><li> 500×gで、スイングバケットローターで細胞を遠心分離し、5分間25℃。細胞培養培地を除去することなく、さらなる処理のためBSL3実験室にペレット化した細胞を含むチューブに移します。慎重に細胞ペレットを乱すことなくチューブから細胞培養培地を吸引します。 </li></ol></li><li>チューブ中の細胞にDNアーゼI処理したウイルス接種物の適切な量を追加し、穏やかにピペッティングによりよく混ぜます。 80×10 6細胞について、DNアーゼI処理ウイルス（P24-同等のウイルスの50μgの）の30ミリリットルを使用します。 注：機能のPICの単離は、感染の非常に高い多重度（MOI）で標的細胞に感染する必要があります。 </li><li> 2 6ウェル組織培養プレートの間で均等に混合物を分配する（ すなわち、12×2.5-mLのアリコートを、未感染あたり2プレートを使用イオン）。 </li><li>スピノキュレーションのために、2時間、480×gでスイングバケットローターを用いてプレートキャリアと遠心分離機で培養プレートに置き、25℃。 </li><li> 5時間spinoculated 37℃で細胞を、5％CO 2でインキュベートします。 </li></ol>感染細胞の3収穫や溶解（BSL3ラボ） <ol><li>細胞は50 mLのコニカル遠心チューブ（〜30 mLの合計）に培養プレートから各感染症に対応するプール。 </li><li> 10分間、300×gで、25℃での遠心分離により細胞を回収。慎重に（あるいは、ピペットを使用）チューブから上清を吸引除去します。 </li><li> - / - （150ミリモルのKCl、20mMのHEPES、pH7.6の、5mMのMgCl 2）、300×gで、25°Cのためにサンプルを遠心分離し、残留ウイルス粒子を除去するために、緩衝液Kの2ミリリットルを添加することにより、各細胞ペレットを洗浄10分。その後、ペレットを乱すことなく、慎重に吸引またはピペットを使用して、上清を除去します。 </li><li> Repeaトンのステップ3.3。 </li><li>慎重にマイクロピペットを使用して、任意の残った液を取り除き。氷冷溶解バッファーのK + / +（ - / -バッファK 0.025％ジギトニン、1 mMのDTT、20μgの/ mLのアプロチニンを補充した）2mL中に再懸濁各細胞ペレットを、穏やかなピペッティングによって内容物を混合し、への転送2mLのマイクロチューブ。 </li></ol>細胞質のPICの4準備（BSL3ラボ） <ol><li> 10分間室温でロータリーシェーカー上でサンプルをロック。 </li><li> 1,500×gで、4℃に予備冷却回転子を、サンプルを遠心分離し、4分間、4°C。 </li><li>ペレットを乱すことなく、慎重に1分間16,000×gで4℃で新鮮なマイクロ遠心チューブと遠心分離機に上清を移します。 </li><li>慎重に新しいマイクロ遠心チューブに上清を移します。 30分（なし揺動）をRTで内容を20μgの/ mLの（PICを2mLのための2μL）の最終濃度までのRNase A（20 mg / mlで）を追加し、インキュベートします。&lt;/李&gt; <li> 7％の最終濃度にし、穏やかにピペッティングによりよく混ぜ（ - - /バッファKにワット60％/ v）のスクロースを追加します。長期保存のために-80℃の冷凍庫に微量遠心管、液体窒素中でフラッシュ凍結し、場所でのPICのアリコート（ 例えば、200μL）を準備します。 </li></ol> インビトロの統合5. HIV-1のPICを使う（IVI）アッセイ<ol><li>カスタムメイドのプライマー、phiX174-FとphiX174-Rを用いたPCRでphiX174プラスミドDNAから2.0キロバイトの領域を増幅することにより、IVIアッセイで使用した標的DNAを準備します。 <ol><li> 表1に記載されているようにPCR混合物を組み立てます。 表2に推奨サーマルサイクリング条件を用いてサーマルサイクラーにPCRを行います。 （メーカー推奨のプロトコルに従って）ゲル精製キットを用いて、PCR産物をゲル精製し、そして使用するまで-80℃でアリコートとして精製された標的DNAを保存します。 </li></ol></li><li> 200に標的DNAの600 ngの追加 - ＆＃181;のPICのLアリコートを、よく混ぜ、45分間37℃でインキュベートします。 注：インテグラーゼ阻害剤（ 例えば、ラルテグラビル）を標的DNAを省略したりなど、IVIの反応はコントロール反応を推奨しています。 </li><li> 0.5％、8 mMの、それぞれ0.5 mg / mlでの最終濃度までSDS、EDTA、及びプロテイナーゼKを添加することにより、IVI反応を停止させます。反応内容物を完全に混合し、56℃で一晩インキュベートします。 </li><li>翌日、フェノール/クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によりIVI反応からの全DNAを精製します。 16,000×gで、室温ですべての遠心操作を実行します。 </li><li> 2分間、脱タンパクサンプルに等量のフェノールを加え、ボルテックスで激しく混合し、遠心。慎重に上部の水相を除去し、新しいチューブに移します。 </li><li>繰り返し手順5.5。新しいチューブに上部の水相を転送します。 </li><li> 、クロロホルム混合物ボルテックスで激しく混合し、遠心分離器のfo：1フェノール：1等量の追加R 2分間。新しいチューブに上部の水相を転送します。 </li><li> 、等量のクロロホルムを加え、ボルテックスで激しく混合し、2分間遠心します。新しいチューブに上部の水相を転送します。 </li><li> DNAを沈殿させ、最終0.3 Mの濃度、および100％エタノール（氷冷）の2.5倍量には0.1μg/μL、酢酸ナトリウムの3 Mの最終濃度にグリコーゲンを追加します。コンテンツを収集し、-80°CO / Nでチューブを配置するために、短時間遠心分離を混合する渦。 </li><li>次の日は、16,000×gで30分間サンプルを遠心分離し、30分間、4°C。ペレットを乱さないように注意して上清を除去します。 </li><li> 16,000×gでペレットや遠心分離機に80％エタノール（氷冷）の500μLを加え、4℃で10分間。 RTでDNAペレットを空気乾燥し、完全にヌクレアーゼフリー水50μLに再懸濁します。 -20℃でDNAサンプルを保管してください。 </li></ol>定量化PIC活動6. PCRアッセイ<ol><li>統合されたHIV-1 DNAの接合部を増幅するために（それぞれ、LTRとphiX174プライマー）ウイルスのLTRおよびphiX174 DNAを標的とするプライマーを用いて、第1ラウンド従来のPCRを行います。 <ol><li> 表3に記載されているように第一ラウンドPCR混合物を組み立てます。鋳型DNAを除くすべてのコンポーネントのマスターミックスを組み立て、別々のPCRチューブに45-μLアリコートを分配し、鋳型DNAまたはヌクレアーゼフリー水（コントロール）の5μLを追加します。 </li><li> 表4に、推奨サーマルサイクリング条件を用いてサーマルサイクラーにPCRを行います。 </li></ol></li><li>選択的に第一-ROから統合vDNA配列を増幅するために、ウイルスLTR（LTR-RおよびLTR-Uプライマー）の短い領域に隣接するプライマーを用いて、第2ラウンドのqPCRを実行しますウントPCR産物。統合vDNAコピー数を決定するために、既知のコピー数の10倍連続希釈液を使用して標準曲線を生成する（ 例えば、10 0から10まで 8）HIV-1分子クローンの。 <ol><li> 表5に説明したように、第2ラウンドのqPCR混合物を組み立てます。 96ウェルPCR反応プレート中のウェルの適切な数に25μLのアリコートを分配慎重に、テンプレートDNAを除くすべてのコンポーネントのマスターミックスを組み立て、その後、未精製の第一ラウンドのPCR産物またはヌクレアーゼフリー水を5μLを追加（コントロール）。三重ですべてのqPCR反応を実行します。 </li><li>リアルタイムPCR装置にPCRプレートをロードし、 表6に推奨サイクリング条件を用いて定量PCRを行います。 </li><li>適切なソフトウェアを使用してデータを分析します。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Sattentau, Q. J., Weiss, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CD4+antigen%3A+physiological+ligand+and+HIV+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The CD4 antigen: physiological ligand and HIV receptor.</a> Cell. 52 (5), 631-633 (1988).</li>
<li>Wilen, C. B., Tilton, J. C., Doms, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+HIV+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of HIV entry.</a> Adv Exp Med Biol. 726, 223-242 (2012).</li>
<li>Bowerman, B., Brown, P. O., Bishop, J. M., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nucleoprotein+complex+mediates+the+integration+of+retroviral+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A nucleoprotein complex mediates the integration of retroviral DNA.</a> Genes Dev. 3 (4), 469-478 (1989).</li>
<li>Bukrinsky, M. I., Sharova, N., Dempsey, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+nuclear+import+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+preintegration+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Active nuclear import of human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes.</a> Proc Natl Acad Sci. 9 (14), 6580-6584 (1992).</li>
<li>Hansen, M. S., Smith, G. J. 3rd, Kafri, T., Molteni, V., Siegel, J. S., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+complexes+derived+from+HIV+vectors+for+rapid+assays+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integration complexes derived from HIV vectors for rapid assays in vitro.</a> Nature biotechnol. 17 (6), 578-582 (1999).</li>
<li>Farnet, C. M., Haseltine, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+DNA+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Integration of human immunodeficiency virus type 1 DNA in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci. 87 (11), 4164-4168 (1990).</li>
<li>Fujiwara, T., Mizuuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+DNA+integration%3A+structure+of+an+integration+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Retroviral DNA integration: structure of an integration intermediate.</a> Cell. 54 (4), 497-504 (1988).</li>
<li>Brown, P. O., Bowerman, B., Varmus, H. E., Bishop, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correct+integration+of+retroviral+DNA+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Correct integration of retroviral DNA in vitro.</a> Cell. 49 (3), 347-356 (1987).</li>
<li>Lewinski, M. K., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+DNA+integration--mechanism+and+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Genet%22%5BJournal%5D)">Retroviral DNA integration--mechanism and consequences.</a> Adv Genet. 55, 147-181 (2005).</li>
<li>Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+DNA+integration%3A+mechanism+of+viral+DNA+cleavage+and+DNA+strand+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer.</a> Cell. 67 (6), 1211-1221 (1991).</li>
<li>Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+retroviral+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+rev+gen%22%5BJournal%5D)">Genetics of retroviral integration.</a> Ann rev gen. 26, 527-544 (1992).</li>
<li>Panganiban, A. T., Temin, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+terminal+nucleotides+of+retrovirus+DNA+are+required+for+integration+but+not+virus+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The terminal nucleotides of retrovirus DNA are required for integration but not virus production.</a> Nature. 306 (5939), 155-160 (1983).</li>
<li>Bieniasz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+HIV-1+virion+genesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+host+microbe%22%5BJournal%5D)">The cell biology of HIV-1 virion genesis.</a> Cell host microbe. 5 (6), 550-558 (2009).</li>
<li>Sherman, P. A., Fyfe, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+integration+protein+expressed+in+Escherichia+coli+possesses+selective+DNA+cleaving+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus integration protein expressed in Escherichia coli possesses selective DNA cleaving activity.</a> Proc Natl Acad Sci. 87 (13), 5119-5123 (1990).</li>
<li>Katzman, M., Katz, R. A., Skalka, A. M., Leis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+avian+retroviral+integration+protein+cleaves+the+terminal+sequences+of+linear+viral+DNA+at+the+in+vivo+sites+of+integration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The avian retroviral integration protein cleaves the terminal sequences of linear viral DNA at the in vivo sites of integration.</a> J Virol. 63 (12), 5319-5327 (1989).</li>
<li>Craigie, R., Mizuuchi, K., Bushman, F. D., Engelman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+in+vitro+assay+for+HIV+DNA+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+acid+res%22%5BJournal%5D)">A rapid in vitro assay for HIV DNA integration.</a> Nucl acid res. 19 (10), 2729-2734 (1991).</li>
<li>Bushman, F. D., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activities+of+human+immunodeficiency+virus+%28HIV%29+integration+protein+in+vitro%3A+specific+cleavage+and+integration+of+HIV+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Activities of human immunodeficiency virus (HIV) integration protein in vitro: specific cleavage and integration of HIV DNA.</a> Proc Natl Acad Sci. 88 (4), 1339-1343 (1991).</li>
<li>Pauza, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+bases+are+deleted+from+the+termini+of+HIV-1+linear+DNA+during+integrative+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Two bases are deleted from the termini of HIV-1 linear DNA during integrative recombination.</a> Virology. 179 (2), 886-889 (1990).</li>
<li>Engelman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+analysis+of+HIV-1+preintegration+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and analysis of HIV-1 preintegration complexes.</a> Meth Mol Biol. 485, 135-149 (2009).</li>
<li>Engelman, A., Oztop, I., Vandegraaff, N., Raghavendra, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+HIV-1+preintegration+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of HIV-1 preintegration complexes.</a> Methods. 47 (4), 283-290 (2009).</li>
<li>Addai, A. B., Pandhare, J., Paromov, V., Mantri, C. K., Pratap, S., Dash, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocaine+modulates+HIV-1+integration+in+primary+CD4%2B+T+cells%3A+implications+in+HIV-1+pathogenesis+in+drug-abusing+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leuk+Biol%22%5BJournal%5D)">Cocaine modulates HIV-1 integration in primary CD4+ T cells: implications in HIV-1 pathogenesis in drug-abusing patients.</a> J Leuk Biol. 97 (4), 779-790 (2015).</li>
<li>Wehrly, K., Chesebro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p24+antigen+capture+assay+for+quantification+of+human+immunodeficiency+virus+using+readily+available+inexpensive+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">p24 antigen capture assay for quantification of human immunodeficiency virus using readily available inexpensive reagents.</a> Methods. 12 (4), 288-293 (1997).</li>
</ol>

著者には、競合する金融・非金融利益を宣言しません。

レトロウイルスのPICの生化学的分析は、レトロウイルスDNAの統合のメカニズムに重要な洞察を提供しています。レトロウイルスのPICの統合活性の測定は、プラーク形成アッセイ、サザンブロット分析、およびネストされた定量PCRにより達成することができます。プラークアッセイの実験戦略は面倒であり、統合6、7、18を測定するための間接的な方法を利用しています。サザンブロットベースアッセイ対策統合は、直接が、PICの6、7、18の比較的高い量を必要とします。 このレポートでは、in vitroで HIV-1 PIC-関連統合活性を測定するためのネストされた定量...

初期および後期のイベント：標的細胞におけるHIV-1複製は、大きく2段階にグループ化された複数のステップを伴います。 HIV-1順次標的細胞表面受容体CD4二共受容体（CCR5またはCXCR4）1のいずれかに結合したときに初期のイベントが始まります。その結果、ウイルスの細胞膜が融合、およびウイルスカプシド（CA）コアが細胞質2に放出されます。 CAのコアは、ウイルスゲノムの一本鎖RNA（ssRNA）と原点におけるウイルスおよび細胞の両方のいくつかのタンパク質が含まれています。 CA関連ウイルスタンパク質は、逆転写酵素（RT）及びインテグラーゼ（IN）、ウイルス複製の初期のイベント中に重要なステップを仲介する二つの酵素が含まれます。それぞれRTおよび複合核タンパク質複合体、すなわち逆転写（RTC）とプレインテグレーション複合体（PIC）の文脈で機能IN、3、4、5 &lt;SUP&gt;、6。ウイルスのssRNAゲノム港ターミナルリピート（R）ユニークな配列の（5時U5 &#39;末端）および（3時U3&#39;末端）に隣接する要素の両端。 RTCは、二本鎖（ds）DNAコピー（vDNA）へのウイルスのssRNAゲノムを変換します。この逆転写プロセスは、従ってvDNA 7,8の両端の長い末端反復（LTR）を生成し、U5及びU3配列の重複をもたらします。その後、PIC-関連INは宿主染色体9、10、11にvDNAの統合を可能にする2つの連続生化学反応を触媒します。まず、細胞質内で、多量体の両方のLTR 12に係合および3 &#39;末端のそれぞれからジヌクレオチドを切断します。この3 &#39;末端の処理は、各3&#39;末端vDNAの（CA OH）にヒドロキシル基を生成します。INは千鳥状に染色体DNAの両方の鎖を切断する求核剤としてOH vDNA CAを使用する、請求次に、PICは、核に入稿。同時に、INは協調染色体DNAの反対の鎖上に得られたリン酸ジエステル結合にvDNAの両端を継ぎ。この鎖の転写工程に続いて、宿主細胞機構は、5 &#39;vDNAの両端と修理に2つの不対ヌクレオチド組み込み部位の接合部に続く一本鎖ギャップを削除します。初期の事象は、このようにHIV-1ゲノムの統合されたDNAコピー（プロウイルス）の設立で絶頂に達します。プロウイルスは、ウイルスにコードされたタンパク質の発現を含む、後のイベントを、開始し、効率的なウイルス遺伝子の発現に適した環境を提供します。未成熟ウイルスのアセンブリ。そして、リリース、および感染性ビリオン13への成熟出芽。 精製された組換えレトロウイルスINはに有能ですin vitroで 、行って、両方の3 &#39;末端プロセシングおよび鎖移転活動は、上の外因LTRのような基質DNA供給します。このような精製された組換えINを用いて生化学的研究は、vDNA統合14、15、16、17の重要な側面を明らかにしました。しかし、自然感染とは異なり、このインビトロ生化学反応は、標的DNAに基質DNAの両端の協調統合をサポートしていません。これとは対照的に、急性感染細胞から単離されたレトロウイルスのPICは、協奏異種標的DNAの中に内在性vDNAの両端を統合します。これは、単離された天然のPICを使って広く採用し、I nはインビトロインテグレーション（IVI）アッセイのその後の改良につながりました。 最初に報告されたレトロウイルスIVIアッセイでは、細胞からの細胞質抽出物は、組換えマウスに感染させましたそのLTRに大腸菌supF遺伝子を有する白血病ウイルス（MLV）は、IN活動の源を務め、および溶菌成長の欠損変異体ラムダファージのDNAは、外因的に標的DNAとして供給しました。組換えMLV DNAの統合を成功さは、ファージDNAにコピーして、その後のsupF式は、組換えファージのプラーク形成能力の回復につながりました。しかし、この実験的な戦略は面倒であり、間接的な方法で統合を測定します。このような警告に対処するために、vDNAは外因性の線形化バクテリオphiX174 DNAに組み込まれ、内因性の尺度としてPIC関連IVI活動を定量化するサザンブロットベースの間接末端標識アッセイは、18、7、6開発されました。この方法は、組込み事象の直接的な測定を提供するが、PICの調製の比較的高い量は技術的に困難なままである、必要とされます努力。これを回避するには、写真のわずかな量を必要とするネストされたPCRベースのアッセイは、19 5、4開発されました。 この報告書では、我々は、in vitroの方法で 、ネストされたベースのPCRの更新バージョンを記述自然感染時に発生するHIV-1 PIC媒介統合アクティビティを再現するために考案しました。この方法は、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）を用いて測定された内因性のPIC活性の供給源として、HIV-1に感染した標的細胞の細胞質抽出物を使用します。 PICを単離し、それらの統合の活動を測定するための手順は、エンゲルマンの実験室20によって発行されたプロトコルから、修正を加えて、適合されています。この方法では、PIC関連積分活性は、外因性の直鎖標的DNA 21から得られたDNA産物を提供することによって開始されますこの統合化反応を精製し、その後のPCRに基づく定量化のための出発物質として使用されます。第一ラウンドの従来のPCRにおいては、ウイルス標的DNAの接合は、適切なプライマーを用いて増幅されます。第二ラウンドでのqPCRは、LTR特異的プライマーは、具体的には第一ラウンドのPCR産物からvDNA集団を豊かにするために使用されています。この方法の詳細な説明のためのプロトコルのセクションを参照してください。 レトロウイルスのPICを用いたin vitroの研究では、レトロウイルスDNAの統合のメカニズムの理解にとINの阻害剤の開発に大きな進歩につながっています。 HIV-1の統合におけるウイルスと宿主因子の役割を決定し、薬剤耐性との闘いに向けて新たな抗ウイルス薬の開発、マッピング、HIV-1の統合サイトでの最近の増加の焦点に基づいて、我々は、IVIアッセイの関心の高まりや広範な使用を想定します、この報告書に記載のものなどがあります。これは、今度は、につながりますそれによって、そのアプリケーションの範囲を多様化する方法で将来の改良、。

<table><tbody><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)</td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 10437-028 </td><td></td></tr><tr><td>熱不活化ウシ胎児血清(Hi-FBS)</td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 10438-026 </td><td></td></tr><tr><td> ダルベッコ'修正されたイーグル」培地 (DMEM) </td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 11995-065 </td><td></td></tr><tr><td> ロズウェルパーク記念研究所 (RPMI) 1640 medium </td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 11875-093 <</td><td></td></tr><tr><td>p>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (1x)</td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 20012-027 </td><td></td></tr><tr><td> トリプシン-EDTA (0.25%) </td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 25200-056 </td><td></td></tr><tr><td> ペニシリン-ストレプトマイシン溶液 (100x) </td><td> Cellgro/Mediatech </td><td> 30-002-CI </td><td></td></tr><tr><td> HEK293T細胞 (293T) </td><td>American Type Culture Collection (ATCC) </td><td> CRL-3216 </td><td></td></tr><tr><td> HIV-1 proviral molecular clone pNL4-3 </td><td> NIH AIDS Research and Reference Reagent Program </td><td> 114 </td><td></td></tr><tr><td> PolyFect トランスフェクション試薬 </td><td> Qiagen </td><td> 301107 </td><td></td></tr><tr><td>DNase 1 <</td><td>p>Calbiochem/Merckmillipore </td><td> 260913 </td><td></td></tr><tr><td>Sup-T1細胞</td><td> American Type Culture Collection (ATCC) </td><td> CRL-1942 </td><td></td></tr><tr><td>HEPES pH 7.2 - 7.5 (ready-to-use solution)</td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> 塩化カリウム(KCl)溶液 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 60142 </td><td></td></tr><tr><td> 塩化マグネシウム(MgCl2)溶液 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1028 </td><td></td></tr><tr><td> ジチオスレイトール(DTT) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 43815 </td><td></td></tr><tr><td> アプロチニン </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A6106 </td><td></td></tr><tr><td> ジジトニン< </td><td> p>Sigma-Aldrich </td><td> D141 </td><td></td></tr><tr><td> RNase A </td><td> Invitrogen </td><td> 12091-021 </td><td></td></tr><tr><td> スクロース </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td> phiX174 複製形態 DNA </td><td> Promega </td><td> D1531 </td><td></td></tr><tr><td>PhiX174-Fプライマー: 5'-CGCTTCCATGACGCAGAAGTT-3' PhiX174-Rプライマー: 5'-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3' </td><td> Invitrogen および/または IDT-DNA </td><td> </td><td></td></tr><tr><td> dNTP mix </td><td> Promega </td><td> U1515 </td><td></td></tr><tr><td> Go Taq DNA ポリメラーゼ </td><td> Promega </td><td> M3005 </td><td></td></tr><tr><td> Qiaquick ゲル抽出キット </td><td> Qiagen </td><td> 28706 </td><td></td></tr><tr><td> 超純蒸留水 </td><td> Invitrogen </td><td> 10977-015 </td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA (TE) バッファー (100x)</td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9285 </td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)</td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L3771 </td><td></td></tr><tr><td> エチレンジアミン四酢酸、二ナトリウム塩(EDTA)溶液、0.5 M、pH 8.0 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E7889 </td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K(20 mg/mL ready-to-use solution)</td><td> Qiagen </td><td>19131 </td><td></td></tr><tr><td> フェノール(10&nbsp;mM トリス HCl、pH&nbsp;8.0 および 1&nbsp;mM EDTA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4557 </td><td></td></tr><tr><td> クロロホルム </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 288306 </td><td></td></tr><tr><td>グリコーゲン(5 mg/mL溶液)</td><td> Ambion/Invitrogen </td><td> AM9510 </td><td></td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム(3 M、 pH 5.2)</td><td> Sigma-Aldrich </td><td>S7899</td><td></td></tr><tr><td> エタノール </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E7023 </td><td></td></tr><tr><td>First round LTR primer: 5'-GTGCGCTTCAGCAAG-3' 第1ラウンドphiX174プライマー: 5'-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3'</td><td> Invitrogen および/または IDT-DNA </td><td> --- </td><td></td></tr><tr><td>第 2 ラウンド LTR-R プライマー: 5'-TCTGGCTAACTAGGGAACCCA-3' 第2ラウンドLTR-Uプライマー: 5'-CTGACTAAAAGGGTCTGAGG-3' 第2ラウンド タクマンプローブ: &nbsp;5'-6- FAM/TTAAGCCTCAATAAAGCTTGC CTTGAGTGC/6-TAMRA/-3'</td><td> Invitrogen および/または IDT-DNA </td><td> --- </td><td></td></tr><tr><td> iQ Supermix </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-8862 </td><td></td></tr></tbody></table>

の測定インビトロ hiv-1プレインテグレーション複合体の統合活動

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1エンベロープタンパク質は、細胞質へのウイルスのカプシド（CA）コアの放出に続いてウイルスの細胞膜融合をもたらす、標的細胞表面上の同族受容体に係合します。その後、ウイルス逆転写酵素（RT）は、同名核タンパク質複合体の一部のような複雑な逆転写（RTC）は、二本鎖DNAコピー（vDNA）へのウイルスの一本鎖RNAゲノムを変換と呼ばれます。これは、他の核タンパク質複合体の生合成につながる、vDNAと関連するウイルスタンパク質と宿主因子で構成される統合前複合体（PIC）は、と呼ばれます。 PIC関連ウイルスインテグラーゼ（IN）は、時間的および空間的に調節二段階プロセスで宿主染色体DNAへvDNAの統合を調整します。まず、INは、細胞質内vDNAの3 &#39;末端を処理して、PICは、核に入稿した後に第二、それは染色体DNAに加工vDNAの組込みを媒介します。 PICには、単離されました急性HIV-1に感染した標的細胞から、彼らは外因的に添加された異種標的DNAに関連vDNAを統合する能力があるとして、in vitroで機能的です。このようなインビトロの統合アッセイで PICベースのかなりレトロウイルス組み込みのメカニズムの詳細を描写するおよび阻害剤IN発見に貢献しています。本稿では、単離された天然のPICのin vitroでの統合の活性を測定するためのネストされたリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）ベースの戦略を採用して更新されたHIV-1のPICアッセイに手の込んだ。

HIV-1のPICの単離 急性感染のSup-T1細胞からのHIV-1のPICの単離のために使用されるプロトコルの概略図を図1に示されています。このプロトコルは、エンゲルマンらによって記載された方法に由来します。 19、20。 HIV-1のPICは、感染細胞内で組み立てられ、逆転写vDNAで構成されている核タンパク質複合体、ウイルスタンパク質、および細胞性因子19、20です。このレポートに記載された方法は、PIC-関連統合活動の源としてのHIV-1感染細胞の細胞質抽出物を使用しています。 <p class="jove_conte...

この報告は、急性感染細胞の細胞質抽出物中のヒト免疫不全ウイルス1型(HIV-1)プレインテグレーションコンプレックス(PIC)関連統合活性を測定するためのin vitroアッセイについて説明しています。PIC関連HIV-1 DNAの異種標的DNAへの組み込みは、ネストされたリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応戦略を使用して定量化されます。

の測定インビトロ HIV-1プレインテグレーション複合体の統合活動

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

この手順の全体的な目標は、HIV-1感染したSupT1細胞から単離されたプレインテグレーション複合体(PIC)のin vitroインテグレーション活性を測定することです。この方法は、HIV生物学におけるいくつかの重要な問題、特に特定の宿主因子やウイルス因子(ウイルスカプシドなど)がHIV-1 DNAの統合にどのように関与しているかに答えるものであり、そうすることで、抗レトロウイルス療法の新規標的を設計または特定するのに役立ちます。この方法の主な利点は、in vitroでの統合活性を測定するために、比較的少量のPre Integration複合体(PIC)調製物を必要とすることです。この技術の意味は、HIV-1エイズの診断だけでなく治療にも及ぶ可能性があり、これは、この技術の初期のバージョンが、今日臨床で使用されている主要な抗HIV薬の1つであるHIV-1インテグラーゼ阻害剤の発見に重要であったため、この方法はHIV-1の統合を理解するためだけでなく、 しかし、RSVやMLVなどの他のレトロウイルスの研究にも適用できます。このプロトコルを実証するのは、研究室のポスドクフェローであるMuthukumar Balasubramaniam博士です。SupT1をHIV-1に感染させるには、BSL-2ラボで、ロズウェルパークメモリアルインスティテュートまたは10%FBSとペン連鎖球菌を補充したRPMI培地で、SupT1細胞を1ミリリットルあたり1〜2倍10〜6番目の細胞に維持します。テキストプロトコルに従って感染性HIV-1の高力価を生成した後、培養フラスコからSupT1細胞をプールし、ピペッティングでよく混合し、血球計算盤でトリパンブルー排除染色を使用して生存細胞数を決定します。50ミリリットルの円錐形遠心分離管でウイルス感染ごとに106個の細胞を8倍分し、次にスイングバケットローターで細胞を500倍g、摂氏25度で5分間遠心分離します。細胞培養培地を取り出さずに、ペレット化された細胞を含むチューブをBSL-3ラボに移してさらに処理し、ペレットを乱さずにチューブから培地を慎重に吸引します。次に、30ミリリットルのDNase I処理ウイルス接種物を細胞に加え、穏やかにピペッティングして混合し、混合物を2つの6ウェル組織培養プレートに均等に分配します。スピノキュレーションの場合は、培養プレートをプレートキャリアに入れ、スイングバケットローターで480 g、摂氏25度で2時間遠心分離し、細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%で5時間インキュベートします。感染した細胞を採取して溶解するには、各感染に対応する細胞を50ミリリットルの円錐形遠心分離チューブにプールします。細胞を300倍g、摂氏25度で10分間遠心分離し、上清を慎重に吸引またはピペットで分注します。残留ウイルス粒子を除去するには、各ペレットにバッファーKマイナスマイナス2ミリリットルを加えて洗浄し、再度サンプルを回転させた後、ペレットを乱さないように、吸引またはピペットで上清を慎重に除去してから、再度洗浄を繰り返します。マイクロピペットで残留バッファーを慎重に取り除いた後、氷冷溶解バッファーK plus plusを使用して各ペレットを穏やかに再懸濁し、2ミリリットルの微量遠心チューブに移します。細胞質プレインテグレーション複合体(PIC)を調製するには、サンプルを室温で10分間揺とり、次にチューブを摂氏4度に予冷したローターに入れ、1,500倍のgと摂氏4度で4分間遠心分離します。ペレットを乱すことなく、上清を新鮮な微量遠心チューブに慎重に移し、16, 000倍のgと摂氏4度で1分間回転させます。上清を新しい微量遠心チューブに慎重に移し、RNase Aを最終濃度の20μg/mLまで加え、内容物を30分間揺さぶらずに室温でインキュベートします。スクロースを最終濃度7%まで加え、穏やかにピペッティングしてよく混合し、マイクロ遠心チューブにPICのアリコートを調製します。液体窒素で急速凍結し、マイナス80°Cの冷凍庫に入れて長期保存します。in vitro integrationまたはIVIアッセイで使用する標的DNAを調製するには、カスタムメイドのプライマーphiX174-ForwardおよびphiX174-Reverseを使用して、phiX174プラスミドDNAから2.0キロベース領域を増幅するPCR混合物を組み立て、テキストプロトコルに従ってプログラムを使用してPCRを実施します。サンプルをゲル精製して分注した後、600ナノグラムのターゲットDNAを200マイクロリットルのPICに添加します。よく混ぜ合わせ、摂氏37度で45分間インキュベートします。SDS、EDTA、プロテイナーゼKを添加してIVI反応を停止させた後、反応内容物を十分に混合し、56°Cで一晩インキュベートします。翌日、IVI反応から全DNAを精製するために、除タンパクしたサンプルに同量のフェノールを加えます。ボルテックスと遠心分離により2分間激しく混合します。フェノール抽出を繰り返す前に、上部水相を慎重に取り除き、新しいチューブに移してから、等量の1対1のフェノールクロロホルムを追加します。チューブをボルテックスしてサンプルを2分間遠心分離して混合し、その後、上部水相を新しいチューブに移します。テキストプロトコルに従ってクロロホルムで抽出した後、グリコーゲンのマイクロリットルあたり0.1マイクログラム、0.3モルの酢酸ナトリウム、および2.5容量の氷冷100%エタノールを添加して、水相からDNAを沈殿させます。チューブを摂氏マイナス80度に一晩置きます。翌日、サンプルを16, 000倍のgと摂氏4度で30分間遠心分離し、ペレットを乱さずに上清を慎重に取り除きます。PIC活性を定量するためのPCRを実施するには、ウイルスLTRとphiX174 DNAを標的とするプライマーを使用して、統合されたHIV-1 DNAの接合部を増幅する従来のPCRの最初のラウンドから始めます。ここで概説されているように、マスターミックスからテンプレートDNAを除いたものを組み立て、次に45マイクロリットルのアリコートを別々のPCRチューブに分注し、5マイクロリットルのテンプレートDNAまたはヌクレアーゼフリー水をコントロールとして追加します。テキストプロトコルに概説されているプログラムを使用してサーモサイクラーで反応を実行し、次に2回目の定量PCRを実施し、テキストプロトコルに従ってデータを分析します。このIVIアッセイでは、SupT1をDNAse Iで処理したHIV-1と、HIV-1インテグラーゼ阻害剤であるRaltegravirの有無または存在で棘化しました。インキュベーション後、PICを単離し、精製したDNAを分析してウイルスDNAの組み込みを行いました。ここに示すように、HIV-1 PICは、関連するウイルスDNAを標的DNAに強固に統合し、PICのIVI効率は、Raltegravirを添加した反応で大幅に低下し、このアッセイで測定されたHIV-1インテグラーゼへの組み込み活性を強く示唆しています。対照反応は、統合活性を示さなかった。さらに、PCR の 1 回目のラウンドで Taq ポリメラーゼを除外したコントロールは、組み込み産物を増幅しませんでした。特に、PIC単独のコントロールからのデータは、ネステッドqPCR戦略が統合されたウイルスDNAを特異的に測定したが、PIC関連ウイルスDNAは測定しなかったことを示しました。まとめると、これらのデータはPICに関連付けられた統合アクティビティを示しています。一度習得すれば、PIC活性を定量化するためのウイルス調製とPCRアッセイを1週間で完了することができます。SupT1細胞の感染と感染細胞からのPICの単離は1日で行うことができます。このビデオを見れば、HIV-1 PICの単離方法とin vitro統合活性の測定方法について十分に理解できるはずです。感染性HIV-1の高力価での作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を実行する際には、エプロンやガウンなどの防護服、二重手袋、保護眼鏡などの適切な予防策を常に講じる必要があることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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の測定インビトロ HIV-1プレインテグレーション複合体の統合活動

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