単離、分化、および血液からヒト抗体を分泌するB細胞の定量化：体液性免疫の機能読み出しなどのELISpot

このELISpot法の全体的な目標は、血液中のヒト抗体分泌B細胞の定量を可能にすることです。この方法は、B細胞の免疫学とワクチン研究に関する生物医学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、抗体分泌B細胞を単一細胞レベルで検出および測定できることです。

その手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるTsung-Chih Tsengです。正中肘静脈から10 mlの血液サンプルを採取した直後に、カリウムを補給したEDTAを含む15 mlチューブにチューブを反転させ、血栓の形成を防ぎます。次に、オートクレーブ処理した赤血球溶解バッファー35 mLを細胞に加え、室温で5分間インキュベートします。

チューブを通して光が観察できる場合は、血液を遠心分離し、白いペレットの存在を確認します。10 mLのオートクレーブ滅菌PBSで残留溶解バッファーを取り出し、ペレットを10 mLのRPMI 1640培地に再懸濁します。細胞を10cmの培養皿にプレートし、摂氏37度と二酸化炭素5%で30分間インキュベートします。

次に、培養皿を数回静かに回転させ、浮遊細胞をプラスチック製の15ml円錐管に移します。遠心分離による2回の洗浄後、ペレットを200マイクロリットルの冷PBSバッファーに6細胞/ml濃度の10分の5〜10倍で再懸濁し、6番目の細胞の10分の1あたり5マイクロリットルの血液細胞特異的なビオチン化抗ヒト抗体カクテルを追加します。氷上で30分間インキュベートした後、10倍の過剰量の滅菌PBSで細胞を洗浄し、ペレットを6つの細胞の10分の1あたり5マイクロリットルのストレプトアビジン標識マイクロビーズに再懸濁して、氷上で30分間インキュベーションします。

インキュベーションの最後に、2 mLのPBSバッファーを細胞に加え、チューブを磁気スタンドに室温で8分間置きます。マイクロビーズがチューブの壁に付着したら、上清を新しい円錐形のチューブに慎重に移し、さらに2mlのPBSバッファーを細胞に加えます。2回目の上清収集後、プールされた細胞を遠心分離により収集し、細胞を5 mLのポリスチレンチューブと新鮮なPBSバッファーに7細胞あたり10分の1の濃度で移します。

非特異的ブロッキングを調製した後、6つの細胞の10分の1あたり各選択抗体を1μgずつチューブに加え、氷上で30分間インキュベートします。インキュベーションの最後の5分間に、5マイクロリットルの7-AADを細胞に加えます。次に、2ミリリットルの新鮮なPBSを細胞に加え、遠心分離する前にボルテックスします。

ペレットを新鮮な選別緩衝液に7細胞/1ミリリットルの濃度の10分の1から5倍で再懸濁し、40ミクロンのセルストレーナーで細胞をろ過して新しい5ミリリットルのポリスチレンチューブに入れます。次に、フローサイトメトリーで細胞を5 mLの新鮮なRPI培地を含む3本の15 mLチューブに選別し、ナイーブB細胞、メモリーB細胞、および形質芽細胞形質細胞を回収します。すべての細胞を回収したら、新鮮なRPMI培地で、12ウェル細胞培養プレートの個々のウェルにサブセットを播種します。

次に、細胞培養インキュベーター内で、ウェルあたり1ミリリットルあたり6番目の細胞の10分の1あたり5マイクログラムのCPG ODN 2006でB細胞を5日間活性化します。活性化の最後に、30マイクロリットルの35%エタノールと蒸留水をELISpotプレートの各ウェルに30秒間追加します。次に、各ウェルのエタノールを150マイクロリットルのオートクレーブ二重蒸留水と交換し、プレートを室温で5分間インキュベートして残留エタノールを除去します。

PBS洗浄を行った後、抗ヒトIGのポリクローナルFAB2フラグメントを50μリットルを各ウェルに添加します。示したように、プレートをPBSで2回洗います。各ウェルの非特異的結合を、200 μリットルの新鮮なPBSとBSAで室温で2時間ブロックします。

別のPBS洗浄シリーズの後、100マイクロリットルの新鮮なRPMI 1640培地で37°Cでウェルをインキュベートします。次に、各ELISpotウェルの培地を適切な数の活性化B細胞と交換します。各ウェルの最終容量を新鮮なRPMI培地で150μリットルに戻し、ELISpotプレートを細胞培養インキュベーターに8〜14時間戻します。

インキュベーション期間の終わりに、培地を廃棄し、200マイクロリットルのPBSとtween20でウェルを5、3分間洗浄します。最後の洗浄後、適切な検出抗体を対応するウェルに加え、プレートを暗所で2時間インキュベートします。別のPBS洗浄シリーズの後、50マイクロリットルのBCIPMBT基質を各ウェルに室温で5〜15分間加えます。

紫色の斑点が現れたら、ウェルあたり100マイクロリットルの二重蒸留水で反応を止め、流水でプレートをすすいでください。次に、光から保護されたELISpotメンブレンを風乾します。このドナーPBMCサンプルでは、赤血球溶解と接着細胞の枯渇後、リンパ球の約10%がCD19陽性B細胞でした。

B細胞コンパートメントでは、細胞の約50%がCD27陰性のナイーブB細胞であり、50%がCD27を発現するメモリーB細胞であった。精製されたヒトB細胞およびCD19+CD27+を5日間CPG処理すると、通常、1×10から4番目の活性化B細胞から50〜200個のIgMおよび10〜50個のIgG抗体分泌細胞が生成されます。このELISpotテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば3時間で完了することができます。

この手順を開始する前に、抗体分泌細胞を検出するための適切な捕捉試薬をその場所にコード化することを覚えておくことが重要です。開発後、この技術は、ワクチン学の分野の研究者が大規模な試験や縦断的な追跡調査でワクチンの有効性を探求する道を開きました。このビデオを見た後、血液からヒトB細胞を精製する方法をよく理解しているはずです。

ナイーブB細胞とメモリーB細胞を分化のために分離し、ELISpotエッセイを実行して抗体分泌細胞を適格化します。人間の血液を扱う作業は危険な場合があり、この手順を実行するときは常に手袋を着用するなどの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。