Name: 単離、分化、および血液からヒト抗体を分泌するB細胞の定量化：体液性免疫の機能読み出しなどのELISpot (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 学ぶELISpot法によるヒト抗体産生B細胞の単離・分化・定量化。末梢血からIgM・IgG産生細胞を単一細胞レベルで検出し、ワクチン効果評価や体液性免疫応答の研究に応用する方法です。

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この研究は、台湾行政院科学技術部(NSC99-2320-B-002-011)からの研究助成金によって支援されました。国立台湾大学医学部のFirst Core LaboratoryのFlow Cytometric Analyzing and Sorting Coreが提供する優れたサービスに感謝したいと思います。

ヒト末梢血は、インフォームドコンセントの下で健康なドナーから得なければならない、と血液サンプルの使用は、個々の治験審査委員会によって確立され承認されたガイドラインに準拠する必要があります。本研究では、フローサイトメトリーの結果のデモンストレーションでは、ヒトの血液を使用するプロトコル（ 図1）およびELISPOTアッセイ（ 図3）は、国立台湾大学病院（プロトコル番号201307019RINB）の内部審査委員会によって承認されました。 ヒト末梢血B細胞の1単離および精製<ol><li> K 2 EDTA（1.5〜2.0ミリグラム/ mLの血液）を含む15-mLのチューブに（肘に肘窩の前方で）肘正中皮静脈から血液の〜10mLのを描画し、すぐに凝血塊を防止するために、チューブを数回転倒形成。 </li><li> P;（121℃、15分）、オートクレーブ処理の35 mLを加え、赤血球（RBC）溶解バッファー（150mMのNH 4 Cl を 、10mMのKHCO 3、および1mM EDTA新鮮な血液サンプル（≥3を含有するチューブにH 7.4）：1体積/体積）をし、もはやより5分間室温（RT）でインキュベート。 注：管を通る光の透過の外観は、RBC溶解が完了したことを示しています。 </li><li>室温で5分間600×gで遠心分離します。ペレットの色が白であることを確認してください。 </li><li>ステップ1.3のように遠心分離器;オートクレーブしたリン酸緩衝生理食塩水（pH7.4のPBS、137mMの塩化ナトリウム、2.7のKCl、4.3 mMののNa 2 HPO 4、および1.47 mMのKH 2 PO 4）10mLでペレットを再懸濁。 </li><li> 、その後プレート：上清を捨てRPMI 1640培地（10％ウシ胎児血清、100 U / mLのペニシリン/ストレプトマイシン、0.25 / mlのアンホテリシンB、および2mM L-グルタミンサプリメント）10mLでペレットを再懸濁10 cmの培養皿（皿当たり10mlの血液）への細胞。 30分間、5％CO 2で37℃のインキュベーターに皿を置きます。 </li><li>静かに培養皿を数回旋回し、配置15-mLのプラスチック製コニカルチューブに培地（浮遊細胞）。培養皿に接着細胞（主にマクロファージ）を捨てます。 </li><li>室温で5分間600×gで遠心分離します。上清を捨てます。 </li><li> RPMI 1640培地1mLでペレットを再懸濁します。血球計数器または自動細胞カウンターで細胞数をカウントします。 注：分離された白血球の生存率は、通常、トリパンブルー排除によって90％以上です。 </li><li> 10×10 6細胞/ mL - 5の濃度で工程1.7と同様に遠心分離し、冷PBS緩衝液〜200μL（0.5％ウシ血清アルブミン（BSA）および2mM EDTA）中で細胞を再懸濁します。 </li><li> 10 6個の細胞あたり（B細胞の負の選択のための）血液細胞に特異的なビオチン化抗ヒト抗体カクテルの5μLを加え、30分間21氷上でインキュベートします。 注：抗ヒト抗体カクテルは、少なくともCD2（またはCD3）、CD14、およびCD16に特異的な腹筋を含める必要があります。 </li><li> 10倍過剰量を追加滅菌PBSの細胞、5分間600×gで遠心分離し、上清を廃棄します。 </li><li>ペレットにストレプトアビジン結合マイクロビーズ（10 6細胞あたり5μL）の等量を加え、よく混ぜます。 </li><li> 15-mLのプラスチック円錐管中で30分間氷上でインキュベートします。 </li><li>チューブにPBS緩衝液2mLのを追加します。 </li><li>磁気スタンドにチューブを置き、8分間RTでインキュベートします。茶色のマイクロビーズは徐々に次の磁石22に管壁に付着します。 </li><li>チューブを磁気スタンドに残っていると、慎重に新しい滅菌15 mLチューブ22に上清を移します。 </li><li>繰り返しは、1.16から1.14までを段階的に説明し、手つかずのB細胞を含む2つの上清を兼ね備えています。マイクロビーズを捨てます。 </li><li>室温で5分間600×gで遠心分離します。上清を捨てます。 </li><li>下流の実験のためにRPMI 1640培地中でペレットを再懸濁。 注：一般的に、1から5×10 5 B細胞のウィットHA末梢血10mLの95％を超える純度が23を単離することができます。 </li></ol> 2.精製および単離されたB細胞からのメモリとナイーブB細胞の分離<ol><li>ステップ1から精製された細胞を使用し、血球計または自動セルカウンターを用いて細胞数を決定します。 </li><li> 5分間600×gで遠心分離し、RT後の冷PBS緩衝液100μLで細胞を再懸濁します。 </li><li> 10 6個の細胞あたりビオチン化CD27 mAbを2μgの氷上で30分間インキュベート- 1を追加します。 </li><li> 5分間、600×gでチューブと遠心分離機にPBS緩衝液の10 mLを加え。 </li><li>上清を捨て、PBS緩衝液の50μLで細胞を懸濁します。 </li><li> 15 mLのプラスチックコニカルチューブ中の細胞に- （2μgの/ 10 6細胞1）ストレプトアビジン磁性マイクロビーズの等量を追加します。 </li><li>穏やかによく混合し、氷上で30分間インキュベートします。 </li><li>チューブにPBS緩衝液3mLの - 2を追加します。 </li><li>置き磁気スタンドにチューブとは、茶色のマイクロビーズが磁石に近い側に取り付けることができるように、8分間RTでインキュベートします。 </li><li>磁気スタンドでの管で、慎重に新しい滅菌チューブに上清画分を転送します。ナイーブB細胞-この画分は、濃縮されたCD27が含まれています。 </li><li>マイクロビーズを含むチューブに5 mLを加え、穏やかにマイクロビーズを再懸濁（ すなわち、CD27 +メモリーB細胞の濃縮分画）24-25。 </li><li>室温で5分間600×gで遠心分離します。下流の実験のためのRPMI 1640培地でペレットを再懸濁します。 注：典型的には、約30 - B細胞の60％が健康なドナー7、25-26のPBMCからCD27 +記憶細胞として精製することができます。 </li></ol>ナイーブB細胞、メモリーB細胞、およびPBS /パソコンのコレクションのソート3.セル<ol><li>ステップ1から精製された細胞を用いて、hemocytomeを用いて細胞数を決定しますターまたは自動セルカウンター。 </li><li> 5-mLのポリスチレンチューブ中で、mL当たり10 7の濃度で冷PBS緩衝液中で細胞を再懸濁します。 </li><li> 10 6個の細胞当たりのヒトIgGを2μgおよびFcブロックのために10分間氷上でインキュベート- 1を追加します。 </li><li> 1μgの抗CD19-APC（クローン：HIB19）のそれぞれを追加し、抗CD27-eFluor450（クローン：O323）、および抗CD38-PE（クローン：HIT2）10 6細胞あたり。よく混ぜ、30分4、27氷上でインキュベートします。 </li><li>ステップ3.4の最後の5分で、商業7-アミノD（7-AAD）の5μLを追加します。 </li><li> 5分間、600×gでチューブ、ボルテックスし、遠心分離機にPBSの2ミリリットルを追加します。 </li><li> 15 mLチューブに、mL当たり5×10 7細胞- 1の濃度で（2％BSAおよび2mMのEDTAを含む滅菌PBS）バッファーを並べ替え中に細胞を再懸濁します。 </li><li>細胞塊を除去するためにナイロンメッシュセルストレーナー（40μmの孔サイズ）を介して細胞をフィルタリングします。 </li><li>フローサイトメトリーソートして細胞を分離紫色（405 nm）と、青（488 nm）で、赤色（640nmの）：えー3つのレーザを搭載しました。 注：単独の青色レーザーは、27-28サイトメトリー3色のフローのために十分です。 </li><li>ナイーブB細胞（CD19 + CD27 - ）を同時に収集するための3つの15 mLチューブ（RPMI培地5mlを含有する）にソート細胞、記憶B細胞（CD19 + CD27 +）、およびPBS /パソコン（CD19 + CD27 + /ハイ CD38 +）3-4、28。 注：ステップ4で説明したようにソートさナイーブおよびメモリーB細胞を培養することができます。 </li></ol>ナイーブB細胞-単離されたヒトCD19 + B細胞、CD19 + CD27 +メモリーB細胞、およびCD19 + CD27のインビトロ分化4. <ol><li>手順1.19、2.10、2.11および3.10で精製された細胞を用いて、血球計または自動セルカウンターで細胞数を決定します。 </li><li> RPMI 1640培地で細胞を再懸濁1の濃度- 、mL当たり10×10 5、12ウェルプレートのウェルにそれらをアリコート。 </li><li> 5μgの/ 10 6細胞/ mLの18、29でのCpG（ODN 2006）を追加します。 </li><li> 5日間培養し、5％CO 2、37℃インキュベーターで細胞。 </li><li>各ウェルから細胞を採取、15-mLのチューブに別々に配置し、各チューブにPBSの5 mLを加え、5分間600×gで、室温でそれらを遠心分離します。 </li><li>血球計数器または自動細胞カウンターを用いて細胞を数えます。 RPMI 1640培地で、mL当たり10×10 5から1までの濃度で細胞を再懸濁します。 </li></ol> 5.エリスポットアッセイ<ol><li> 30秒間ELISPOTプレートの各ウェルに蒸留水に35％エタノールの30μLを加えます。 注：ピペッティングすると、すべての回でウェル中の膜には触れないでください。 </li><li>エタノールを除去したELISpotプレートを反転。 </li><li>各ウェルにオートクレーブ滅菌のddH 2 Oの150μLを入れ、インキュベート室温で5分間、それらは、残留エタノールをオフにフラッシュします。 3分間室温で滅菌PBSの洗浄に従ってください。 注：5.3から5.1までは、プレートの製造に応じて、任意であるステップ。 </li><li> ELISPOTプレートの各ウェルに（PBS中）抗ヒトIg抗体（IgG + IgM抗体+型IgA）の5μg/ mlのポリクローナルF（ab &#39;）2フラグメントの50μLを入れ、4℃で一晩（好ましい）でそれらをインキュベートまたは2時間11 37℃です。 注：使用するまでパラフィルムでプレートの端をシール。 </li><li>たびに、未結合のAbを除去し、各ウェルに200μlのPBSを追加し、3分間室温で二度、それらをインキュベートし、プレートを反転。 </li><li>遮断するための各ウェルに5％BSA（またはRPMI 1640培地）を含むPBSを200μLを追加し、室温で2時間、それらをインキュベートします。 </li><li>ブロッキングバッファーを除去するためにプレートを反転。ステップ5.5のように、PBS200μlで各ウェルを二回洗浄します。 </li><li>各ウェルにRPMI 1640培地100μLを加え、37℃でそれらをインキュベートします。 </li><li>準備ができた細胞をシードするときは、RPMI 1640培地を除去するためにプレートを反転。 </li><li>シード100μL（5×10 4）、50μL（2.5×10 4）、および（ステップ1.19、2.10、2.11、3.10から、および4.6）細胞の25μL（1.25×10 4）のウェルにELISPOTプレート。 RPMI 1640培地で、/だけでなく150μLにボリュームをもたらします。 注：細胞をプレーティングするための1つまたは2つの2倍連続希釈の最小値が推奨されます。 </li><li> 14時間18から8のために、5％CO 2で37℃インキュベーターで培養します。インキュベーション中にプレートを移動しないでください。 </li><li>細胞およびRPMI 1640培地を除去するためにプレートを反転。 </li><li> 3分間、室温で毎回5回（0.05％のTween 20を含むPBS）を200μL/ウェルのPBS-Tのを追加し、それらをインキュベートします。 5回の洗浄との間に洗浄バッファーを除去するためにプレートを反転。 </li><li> IgGの検出、1のFcγ特異的、ヤギ抗ヒトIgGアルカリホスファターゼ（AP）のいずれかを追加するABS（：PBS-Tで5,000）またはヤギ抗ヒトIgM-AP、Fcμフラグメント固有のAbs（IgM抗体検出、1：PBS-Tで5,000）指定されたウェルに、暗所で室温で2時間インキュベートします。 </li><li>ステップ5.5のように、PBS200μlで各ウェルを二回洗浄します。 </li><li> 50μL/ウェルのブロモクロロインドリルリン酸ニトロブルーテトラゾリウム（BCIP / NBT）基質溶液を追加します。 15分 - 紫色の斑点は、通常5に表示されます。 </li><li>スポットの過剰発生を防止するために、100μL/ウェルのddH 2のOを追加します。 </li><li>すべてのスポットの完全な開発後に水道水でプレートを洗浄します。 </li><li>プレートの暗渠を削除し、それらは暗闇の中で空気乾燥することができます。 </li><li>画像取得/解析部（ 例えば、自動スキャナまたは手動で解剖顕微鏡を介して）で自動化プレートリーダーを使用してスポットをカウントします。 注意：プレートを暗所で室温で保存し、後で分析することができます。 </li></ol>

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</ol>

著者は、競合する金銭的利益を宣言していません。

ヒト末梢血B細胞の単離および精製通常、RBCが効率的に破裂し、溶解バッファー（ステップ1.2）でクリアすることができます。細胞生存率は、塩化アンモニウムによって影響を受ける可能性があるように、5分より長いRBC溶解緩衝液でのPBMCをインキュベートしないことが重要です。また、赤血球と血小板は同時に以下のプロトコルによって除去することができます。 1血液にバッファ：9の体積比で、酸 - クエン酸 - デキストロース（ACD）緩衝液（pH 7.4 39 mMのクエン酸、75 mMクエン酸ナトリウム、および135mMのデキストロース）新鮮な全血を混合します。 RTで10分間、250×gで遠心分離します。分離を示す、層の形成に注意してください。血小板および多血小板血漿（黄色）が含まれている上層を、吸引し、廃棄します。 PBMCが含まれている界面で薄い中間層、（iは .E。、軟膜）を取り外します。 D（底層でRBCの汚染を避けます）赤色をARK。残留赤血球を除去し、その後1.19にステップ1.2に従うようにしたPBMCに溶...

B細胞は、体液性免疫の発達において中心的な役割を果たしています。彼らは当初、骨髄で開発し、さらなる発展のために、ナイーブ脾臓などのリンパ組織へと移動することができるB細胞、リンパ節、および扁桃として血流を入力してください。銀遭遇すると、いくつかのナイーブB細胞が胚中心B細胞は、記憶B細胞および形質（PBS）/プラズマ細胞（パソコン）に分化することができるリンパ濾胞へ移行します。ほとんどのPB / PCが血流に発信されているが、いくつかは、最終的には長寿命のパソコン1に最終的に分化するために骨髄に存在します。循環中のB細胞は不均一であり、かつ定常状態で、PBS / PCは、末梢血2で稀です。系統特異的表面マーカーの利用可能性の結果として、フローサイトメトリー末梢血中のB細胞サブセットの同定および特徴付けのための一般的な方法となっています。フローcytometrの拡張アプリケーションYは、高純度で分離し、B細胞の個々のサブセットの単離を可能にするセルソーター機能の追加です。異なる発生段階の特定の表面受容体の発現に基づいて、人間の循環B細胞は一般的に3つの主要な亜集団に分類される、記憶B細胞（CD19 + CD27 + CD38 - ）、ナイーブB細胞（ - - CD38 CD19 + CD27）、およびPBS /パソコン（CD19 + CD27 + CD38 +）3-4（ 図1）。本質的にナイーブB細胞はのAgに遭遇していません。しかし、それらはIgM抗体+ CD27 +メモリーB細胞に分化することができます。ナイーブB細胞（BCR）関連分子（ 例えば、CD19、CD20およびCD22）、B細胞抗原受容体を発現に均質であるが、それらは、免疫グロブリンレパートリー5に不均質です。 CD27 +メモリーB細胞の大部分はCD27に分化することができます+ /ハイCD38 + PBS /パソコン6。また、メモリーB細胞およびPBS / PCはポリクローナルであり、発達および機能異質4-7を示します。循環中のPB / PCは、通常短命であり、CD138を発現しないが、骨髄に落ち着くために作られたものは、末端分化し、長寿命となります。最終的に分化したPCは、CD138を発現し、その表面8上にCD27分子をダウンレギュレートします。 PBSおよびPCの両方が腹筋を分泌することができるので、多くの場面では、それらを総称したASCと表記されています。対照的に、ナイーブB細胞や記憶B細胞のいずれもは、ABS 9-10のかなりの量を生成することができます。適切な培養条件6、11-15に置かれたとき、10日-単離された場合、それにもかかわらず、両方のナイーブ及びメモリーB細胞は、3でのASCに分化させることができます。実際には、ASCを、それらの直接分離されたFRとCD27とCD38のインビトロ分化を共有同様の表面式から導出しますオム末梢血6。また、in vitroで分化したASCは、PBS /パソコン6の循環同様の表面CD20の低レベルを発現します。文化由来のASCは、すべての短命ですが、彼らは機能的に有能で、体液性免疫に貢献することが可能であることを示す、ABS樹脂を分泌することができます。 遠くで最も一般的に適用される方法は、体液性免疫応答の機能情報を取得することにより、ELISAおよびエリスポットの両方があります。 ELISAは、96ウェルプレートに基づくアッセイであり、しばしば血清Ag特異ABSおよび他の検体（ 例えば、サイトカイン）の力価を測定するために使用されます。これは、便利かつスケーラブルです。 ELISAは、液体試料16中、ABS又は血清のような他の物質の存在を検出するための固相酵素アッセイを使用するように設計されています。血清のELISAからの読み出しが広く体の免疫応答を表すために使用されてきました。再取得のために必要なツールELISAアッセイからadoutsは、分光光度マイクロプレートリーダーです。リーダは、典型的には、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）共役検出ABSおよびその特異的な基質17の反応から得られる最終生成物の光学密度（OD）を決定することができます。体液性免疫応答の報告に関して、ELISAによって決定した血清抗体レベルは、体内でのASCの集団ではなく、個々の性能を示します。また、ELISAは、アカウントに腹筋を分泌しない記憶B細胞による参加を取ることができません。 ELISAのように、エリスポットは、末梢血サンプル17-18で免疫応答を検出し、監視するための広く用いられている方法です。 ELISpotは、サンドイッチELISAに関連する技術です。その中で、細胞をポリビニリデンジフルオリド（PVDF）短期培養のためのマイクロプレートの96ウェルの膜・バックウェルに配置されています。 ELISpotアッセイは、マイクロプレートとdevelopinにウェスタンブロッティングを行うに類似していますグラム各ウェルのPVDF膜上のスポット。自動ELISPOTリーダーシステムやマニュアルの計数のための実体顕微鏡が必要です。免疫応答を検出するのELISpotの主な利点は、ASCにおよびサイトカイン分泌細胞の定量化におけるその優れた感度です。それは、それぞれ、体液性および細胞性免疫におけるそれらの機能の活動を報告します。体液性免疫機能の測定では、ELISAおよびELISPOTによって列挙されたASCの数によって決定される血清抗体レベルは、しばしば相関しているが、これらの2つのアッセイからのデータ読み出しは、機能的意味19-20でいくつかの違いがあります。エリスポットの主な利点は、この方法の感度です。 Abの適切なアイソタイプの既知量を参考のために含まれている場合に、ELISAによって報告されているように、血清抗体力価のレベルは、濃度の読み出しとして、より定量的に相対的な抗体のレベルを示す、ODの読み出しとして半定量的に提示、またはされています。対照的に、のELISpotの結果はpresenteあります関心対象の細胞プールでのASCの絶対数としてD（ 例えば、未分画の末梢血単核細胞（PBMC）及びPBMCから精製したB細胞）。エリスポットは、単一のASCを検出することができますが、ELISAは、測定前に最適化されたアッセイに依存する濃度に到達するのASCからのAbの量を必要とします。したがって、エリスポットは、定量化の感度のELISAに明らかに優れています。また、エリスポットはまた、活性化された記憶B細胞のインビトロ分化のASCを定量化するのに適しています。記憶B細胞は、ABSを分泌しないが、活性化の際のASCに分化することができます。彼らは、したがって、ELISAによって検出された血清のAbsへの貢献を持っていません。従って、エリスポットは、培養中の活性化した後、記憶B細胞の循環の免疫応答の測定で選択する方法です。これは、長期的な体液性免疫の維持の監視を可能にします。

<table><tbody><tr><td>BD Vacutainer K2E</td><td>BD Biosciences</td><td>367525</td><td>10 mL チューブ</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>エンドトキシンフリー</td></tr><tr><td>トリパンブルー 0.5% 溶液</td><td>バイオロジカルインダストリーズ</td><td>03-102-1B</td><td></td></tr><tr><td>IMag ヒト B リンパ球濃縮セット</td><td>BD Biosciences</td><td>558007</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化 CD27 mAb</td><td>バイオレジェンド</td><td>302804</td><td>クローンO323</td></tr><tr><td>ストレプトアビジン磁気マイクロビーズ</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>9000810</td><td></td></tr><tr><td>15mLファルコンチューブBD</td><td>ファルコン</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>ブルーナイロンメッシュセルストレーナー、40&mu;m</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human CD19-APC</td><td>Biolegend</td><td>302212</td><td>クローン HIB19</td></tr><tr><td>Anti-human CD27-eFluor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-0279-42</td><td>clone O323</td></tr><tr><td>Anti-human CD38-PE-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>303516</td><td>clone HIT2&nbsp;</td></tr><tr><td>抗ヒトCD38-PE-Cy7</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>社560677</td><td>クローンHIT2&nbsp;</td></tr><tr><td>抗ヒトCD45-FITC</td><td>バイオレジェン</td>ド<td>304006</td><td>クローンHI30</td></tr><tr><td>抗ヒトCD45-FITC</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>555482</td><td>クローンHI30</td></tr><tr><td>抗マウス/ラット/ヒト CD27-PerCP Cy5.5 バイオ</td><td>レジェンド</td><td>124213</td><td>クローンLG.3A10</td></tr><tr><td>反ヒトCD27-PerCP Cy5.5</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>65429</td>クローン <td>L128</td></tr><tr><td>抗ヒトCD19-FITC</td><td>ミルテニ・バイオテック</td><td>130-098-064</td><td>クローン LT19</td></tr><tr><td>抗ヒト CD19-FITC</td><td>GeneTex</td><td>GTX75599</td><td>クローン LT19</td></tr><tr><td>抗ヒト CD20-FITC</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>555622</td><td>クローン 2H7</td></tr><tr><td>ビオチン化 抗ヒト CD27</td><td>バイオレジェンド</td><td>302804</td><td>クローン O323</td></tr><tr><td>ビオチン化 抗ヒト CD27</td><td>eBioscience</td><td>13-0279-80</td><td>クローン O323</td></tr><tr><td>7-アミノアクチノマイシン D (7-AAD)</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>CpG (ODN 2006)&nbsp;</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-2006</td><td>Type B CpG</td></tr><tr><td>組換えヒト IL-2</td><td>PeproTech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト IL-10</td><td>PeproTech</td><td>200-10</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト IL-21</td><td>PeproTech</td><td>200-21</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト sCD40L</td><td>PeproTech</td><td>310-02</td><td></td></tr><tr><td>プロテイン A of S. aureus Cowan (SAC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>82526</td><td></td></tr><tr><td>ヤマゴボウマイトジェン (PWM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9379</td><td></td></tr><tr><td>マルチスクリーン フィルター プレート、0.45 & マイクロ;m孔径</td><td>Merck Millipore</td><td>MSIPS4510</td><td>無菌、透明96ウェルフィルタープレート、疎水性PVDF膜</td></tr><tr><td>BCIP/NBT溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6404</td><td></td></tr><tr><td>BCIP/NBT単試薬、アルカリホスファターゼ基質</td><td>Merck Millipore</td><td>ES006</td><td></td></tr><tr><td>Human IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>009-000-003</td><td></td></tr><tr><td>Human IgG, Fc fragment</td><td>JacksonImmunoResearch</td><td>009-000-008</td><td></td></tr><tr><td>F(ab')2 fragment of goat anti-human Ig (IgG + IgM + IgA)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-006-127</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ヒトIgGアルカリホスファターゼ、Fc&γ、フラグメント特異的</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-055-008</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ヒトIgMアルカリホスファターゼ、Fc&micro、フラグメント特異的</td><td>ジャクソンImmunoResearch</td><td>109-055-043</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ヒトIgG-ペルオキシダーゼ、Fc&γ;フラグメント特異的</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-035-008</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ヒトIgM-ペルオキシダーゼ、Fc&micro;フラグメント特異的</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-035-095</td><td></td></tr><tr><td>BD ELISPOT AEC基板キット</td><td>BD Biosciences</td><td>551951</td><td></td></tr><tr><td>C.T.L. ImmunoSpot analyzer</td><td>C.T.L.(C.T.L.)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

単離、分化、および血液からヒト抗体を分泌するb細胞の定量化：体液性免疫の機能読み出しなどのelispot

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

体液性免疫の特徴は、合成し、そのような病原体としての抗原（Ag）から、固有の腹筋を分泌し、宿主防御のために使用される機能のASCを、生成することです。個体の体液性免疫応答の機能状態を定量的に決意するために、血清のAb及び循環のASCの両方は、一般的に機能的な読み出しとして測定されます。ヒトにおいては、末梢血は、宿主B細胞によって誘発される体液性免疫応答を決意するために使用することができる最も便利で容易にアクセス可能な試料です。 ASCを含む異なるB細胞サブセットは、系統特異的抗体コンジュゲートビーズまたはフローサイトメトリーで細胞選別を介して選択を介して、末梢血から直接単離することができます。また、精製されたナイーブ及びメモリーB細胞を活性化し、培養中のASCに分化させることができます。抗体分泌に貢献するのASCの機能活性は、酵素を収束するアッセイであるエリスポットによって定量することができます- 結合immunoabsorbanceアッセイ（ELISA）およびウエスタンブロッティング技術は、単一細胞レベルでの個々のASCの列挙を有効にします。実際には、ELISpotアッセイは、ますますために血液試料の多数の取り扱いの容易さのワクチンの有効性を評価するために使用されています。末梢血からのヒトB細胞を単離する方法は、 インビトロでのASCへのB細胞の分化、および総IgM-およびIgG-ASCを定量化するためのELISpotの使用は、ここで説明します。

PBMCを赤血球および接着細胞（1.7から1.2ステップ）の枯渇させました。細胞のアリコート（2×10 6）を 、ナイーブB細胞、メモリーB細胞、及びPBS /末梢血中のPC（ 図1）の集団を説明するためにフローサイトメトリー分析に供しました。このドナーのPBMCにおける、リンパ球の約10％がCD19 + B細胞でした。 B細胞区画において、CD19 + CD27の百分率-ナイーブB細胞は約50％でした。一方、CD19 + B細胞の約50％がCD27 +メモリーB細胞7、25-26ました。注目すべきは、CD27 +メモリーB細胞は、さらに、IgDの4を含めて分離することができます。 2、30-31 -のPB循環の表現型は、より良い低または無表面CD20の発現（CD19 <sup...

ヒト末梢血は、体液性免疫応答の評価に一般的に使用されます。ここでは、末梢血からヒトB細胞を単離する方法、培養中のヒトB細胞を抗体(Ab)分泌B細胞(ASC)に分化させる方法、およびELISpotアッセイによる総IgM-およびIgG-ASCの列挙方法について説明します。

単離、分化、および血液からヒト抗体を分泌するB細胞の定量化：体液性免疫の機能読み出しなどのELISpot

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

このELISpot法の総合的な目的は、血液中からヒト抗体分泌B細胞を定量化することです。この手法は、B細胞の免疫学やワクチン研究に関する生物医学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、抗体分泌B細胞を単一細胞レベルで検出および測定できることです。手順の実演は、私の研究室の大学院生であるTsung-Chih Tsengが行います。カリウムを添加したEDTAを含む15 mlチューブを用いて、正中肘静脈から10 mlの血液サンプルを採取した直後、凝固を防ぐためにチューブを数回反転させて混ぜ合わせます。次に、細胞にオートクレーブ滅菌済みの赤血球溶血バッファーを35 ml加え、室温で5分間インキュベートします。チューブを透過して光が観察できるようになったら、血液を遠心分離し、白いペレットの存在を確認します。10 mlのオートクレーブ済みPBSで残ったライシスバッファーを除去し、ペレットを10 mlのRPMI 1640培地で再懸濁します。細胞を10 cm培養皿に播種し、37 °C、5% CO2条件下で30分間インキュベートします。次に、培養皿を数回そっと円を描くように揺らし、浮遊細胞をプラスチック製の15 mlコニカルチューブに移します。遠心分離による洗浄を2回行った後、ペレットを200 µLの冷PBSバッファーで、細胞濃度を10⁶ cells/mlの5〜10分の1に再懸濁し、10⁶ cellsあたり5 µLの血液細胞特異的ビオチン化抗ヒト抗体カクテルを添加します。氷上で30分間インキュベートした後、10倍量の滅菌PBSで細胞を洗浄し、ペレットを10⁶ cellsあたり5 µLのストレプトアビジン結合マイクロビーズに再懸濁し、氷上で30分間インキュベートします。インキュベーション終了後、細胞に2 mlのPBSバッファーを加え、チューブを磁気スタンドに設置して室温で8分間静置します。マイクロビーズがチューブの壁面に付着したら、上清を慎重に新しいコニカルチューブに移し、さらに2 mlのPBSバッファーを細胞に加えます。2回目の上清回収後、合わせた細胞を遠心分離により回収し、細胞を5 mlポリスチレンチューブに移し、細胞濃度を7×10⁶ cells/mlの1/10とした新鮮なPBSバッファーに懸濁します。非特異的ブロッキング後、1x10⁶個の細胞を含むチューブに、各選択抗体を1 µgずつ加え、緩やかに混合して氷上で30分間インキュベートします。インキュベーションの最後の5分間に、5 µLの7-AADを細胞に加えます。その後、2 mLの新鮮なPBSを細胞に加え、ボルテックスミキサーで攪拌してから遠心分離します。ペレットを、1〜5×10⁵ cells/mLの濃度になるよう新鮮なソーティングバッファーで再懸濁し、40 µmのセルストレーナーを用いて新しい5 mLポリスチレンチューブにろ過します。次に、フローサイトメトリーを用いて細胞をソーティングし、5 mLの新鮮なRPMI培地 containing 5mls の3本の15 mLチューブに回収し、ナイーブB細胞、メモリーB細胞、およびプラズマブラスト/形質細胞を分取します。すべての細胞を回収した後、各サブセットを新鮮なRPMI培地を用いて1〜10×10⁵ cells/mLの濃度で、12ウェル細胞培養プレートの各ウェルに播種します。次に、セルカルチャーインキュベーター内で、1x10⁶ cells/mLあたり5 µgのCPG ODN 2006を用いてB細胞を5日間活性化させます。活性化終了後、ELISpotプレートの各ウェルに35%エタノールと蒸留水を30 µL加え、30秒間置きます。その後、各ウェルのエタノールを150 µLのオートクレーブ滅菌済み二回蒸留水に置換し、室温で5分間インキュベートして残留エタノールを除去します。PBSで洗浄し、各ウェルに抗ヒトIGポリクローナルFAB2フラグメントを50 µL添加します。先ほど示した方法で、プレートをPBSで2回洗浄します。BSAを含む新鮮なPBS 200 µLを用いて、室温で2時間、各ウェルの非特異的結合をブロックします。再度PBSで洗浄した後、各ウェルに100 µLの新鮮なRPMI 1640培地を加え、37 °Cでインキュベートします。次に、各ELISpotウェルの培地を、適切に調整した数の活性化B細胞に置換します。新鮮なRPMI培地を用いて各ウェルの最終容量を150 µLにし、ELISpotプレートを細胞培養インキュベーターに戻して8〜14時間静置します。インキュベーション期間の終了後、培地を除去し、PBS plus tween20を200 micro liters使用して、3分間の洗浄を5回行います。最後の洗浄後、適切な検出抗体を対応するウェルに添加し、プレートを暗所で2時間インキュベートします。再度PBSで洗浄した後、各ウェルに50 micro litersのBCIPMBT基質を添加し、室温で5〜15分間静置します。紫色のスポットが現れたら、1ウェルあたり100 µLの2回蒸留水で反応を停止させ、プレートを水道水で洗浄します。その後、ELISpotメンブレンを遮光した状態で風乾させます。このドナーPBMCサンプルでは、赤血球溶解および接着細胞の除去後、リンパ球の約10%がCD19陽性B細胞でした。B細胞分画において、細胞の約50%はCD27陰性のナイーブB細胞であり、50%はCD27を発現するメモリーB細胞でした。精製されたヒトB細胞およびCD19+CD27+細胞を5日間CPG処理すると、先に示したように、通常1×10⁴個の活性化B細胞から50〜200個のIgMおよび10〜50個のIgG抗体産生細胞が生成されます。このELISpot法を習得し適切に実施すれば、3時間で完了させることができます。この手順を開始する前に、抗体分泌細胞を検出するための適切な捕捉試薬を用いて、部位にコードを付けることが重要であるという点を覚えておいてください。この技術の開発により、ワクチン学分野の研究者は、大規模試験や縦断的な追跡調査においてワクチンの有効性を探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、血液からヒトB細胞を精製する方法について十分に理解できるはずです。分化能を確認するため、ナイーブB細胞とメモリーB細胞を分離し、ELISpotアッセイを行って抗体産生細胞を定量します。ヒト血液の取り扱いは危険を伴う可能性があるため、本手順の実施中は常に手袋を着用するなど、適切な予防策を講じることを忘れないでください。

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JoVE Journal

Immunology and Infection

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