Name: 抗体フラグメントのライブラリーをスクリーニングするための細菌インナー膜を表示 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: 学ぶ、大腸菌のツインアルギニン輸送経路を利用して抗体フラグメントの結合親和性と溶解性を同時にスクリーニングする手法。細胞内抗体工学の課題解決に貢献し、神経変性疾患やがん治療への応用が期待されます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

scFvスクリーニングと特性評価アッセイに取り組んでくださったTomer Zoharに感謝します。この研究の一部は、国立がん研究所からの賞番号F32CA150622(AJKに)によって支援されました。内容は著者の責任であり、必ずしも国立がん研究所または国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

<ol><li>Biocca, S., Pierandrei-Amaldi, P., Campioni, N., Cattaneo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+immunization+with+cytosolic+recombinant+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Intracellular immunization with cytosolic recombinant antibodies.</a> Biotechnology (NY). 12 (4), 396-399 (1994).</li>
<li>Chen, S. Y., Bagley, J., Marasco, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+antibodies+as+a+new+class+of+therapeutic+molecules+for+gene-therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Intracellular antibodies as a new class of therapeutic molecules for gene-therapy.</a> Hum. Gene Ther. 5 (5), 595-601 (2008).</li>
<li>Gargano, N., Biocca, S., Bradbury, A., Cattaneo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+recombinant+antibody+fragments+neutralizing+human+immunodeficiency+virus+type+1+reverse+transcriptase+provide+an+experimental+basis+for+the+structural+classification+of+the+DNA+polymerase+family%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Human recombinant antibody fragments neutralizing human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase provide an experimental basis for the structural classification of the DNA polymerase family.</a> J Virol. 70 (11), 7706-7712 (1996).</li>
<li>Mhashilkar, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+HIV-1+Tat-mediated+LTR+transactivation+and+HIV-1+infection+by+anti-Tat+single+chain+intrabodies%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Inhibition of HIV-1 Tat-mediated LTR transactivation and HIV-1 infection by anti-Tat single chain intrabodies.</a> Embo J. 14 (7), 1542-1551 (1995).</li>
<li>Strube, R. W., Chen, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+anti-cyclin+E+single-chain+Fv+antibodies+and+intrabodies+in+breast+cancer+cells%3A+enhanced+intracellular+stability+of+novel+sFv-F-c+intrabodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Characterization of anti-cyclin E single-chain Fv antibodies and intrabodies in breast cancer cells: enhanced intracellular stability of novel sFv-F-c intrabodies.</a> J. Immunol. Meth. 263 (1-2), 149-197 (2002).</li>
<li>Mössner, E., Koch, H., Plückthun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+selection+of+antibodies+without+antigen+purification%3A+adaptation+of+the+protein+fragment+complementation+assay+to+select+antigen-antibody+pairs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fast selection of antibodies without antigen purification: adaptation of the protein fragment complementation assay to select antigen-antibody pairs.</a> J. Mol. Biol. 308 (2), 115-122 (2001).</li>
<li>Wörn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+in+vitro+stability+and+in+vivo+performance+of+anti-GCN4+intrabodies+as+cytoplasmic+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Correlation between in vitro stability and in vivo performance of anti-GCN4 intrabodies as cytoplasmic inhibitors.</a> J Biol Chem. 275 (4), 2795-2803 (2000).</li>
<li>Knappik, A., Plückthun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+turns+of+a+recombinant+antibody+improve+its+in+vivo+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">Engineered turns of a recombinant antibody improve its in vivo folding.</a> Protein Eng. 8 (1), 81-89 (1995).</li>
<li>Martineau, P., Jones, P., Winter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+an+antibody+fragment+at+high+levels+in+the+bacterial+cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of an antibody fragment at high levels in the bacterial cytoplasm.</a> J Mol Biol. 280 (1), 117-127 (1998).</li>
<li>Steipe, B., Schiller, B., Plückthun, A., Steinbacher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+statistics+reliably+predict+stabilizing+mutations+in+a+protein+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sequence statistics reliably predict stabilizing mutations in a protein domain.</a> J. Mol. Biol. 240 (3), 188-192 (1994).</li>
<li>Daugherty, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+engineering+with+bacterial+display%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein engineering with bacterial display.</a> Curr Opin Struct Biol. 17 (4), 474-480 (2007).</li>
<li>Lener, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverting+a+protein+from+its+cellular+location+by+intracellular+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Diverting a protein from its cellular location by intracellular antibodies.</a> Eur. J. Biochem. 267 (4), 1196-1205 (2000).</li>
<li>Lynch, S. M., Zhou, C., Messer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+scFv+intrabody+against+the+nonamyloid+component+of+%CE%B1-synuclein+reduces+intracellular+aggregation+and+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">An scFv intrabody against the nonamyloid component of α-synuclein reduces intracellular aggregation and toxicity.</a> J. Mol. Biol. 377 (1), 136-147 (2008).</li>
<li>Gai, S. A., Wittrup, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+surface+display+for+protein+engineering+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Yeast surface display for protein engineering and characterization.</a> Curr. Opin. Struc. Biol. 17 (4), 467-473 (2007).</li>
<li>Kieke, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+functional+T+cell+receptor+mutants+from+a+yeast+surface-display+library%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Selection of functional T cell receptor mutants from a yeast surface-display library.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96 (10), 5651-5656 (1999).</li>
<li>Steiner, D., Forrer, P., Stumpp, M. T., Pluckthun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+sequences+directing+cotranslational+translocation+expand+the+range+of+proteins+amenable+to+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Signal sequences directing cotranslational translocation expand the range of proteins amenable to phage display.</a> Nat. Biotechnol. 24, 823-831 (2006).</li>
<li>Pugsley, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+general+secretory+pathway+in+gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The complete general secretory pathway in gram-negative bacteria.</a> Microbiol. Rev. 57 (1), 50-108 (1993).</li>
<li>Rapoza, M. P., Webster, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+filamentous+bacteriophage+assembly+proteins+require+the+bacterial+SecA+protein+for+correct+localization+to+the+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The filamentous bacteriophage assembly proteins require the bacterial SecA protein for correct localization to the membrane.</a> J. Bacteriol. 175 (6), 1856-1859 (1993).</li>
<li>Karlsson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+antibody+fitness+and+function+using+membrane-anchored+display+of+correctly+folded+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Molec.+Biol%22%5BJournal%5D)">Engineering antibody fitness and function using membrane-anchored display of correctly folded proteins.</a> J. Molec. Biol. 416 (1), 94-107 (2012).</li>
<li>DeLisa, M. P., Tullman, D., Georgiou, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+quality+control+in+the+export+of+proteins+by+the+bacterial+twin-arginine+translocation+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Folding quality control in the export of proteins by the bacterial twin-arginine translocation pathway.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 6115-6120 (2003).</li>
<li>Fisher, A. C., Kim, W., DeLisa, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+selection+for+protein+solubility+enabled+by+the+folding+quality+control+feature+of+the+twin-arginine+translocation+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Genetic selection for protein solubility enabled by the folding quality control feature of the twin-arginine translocation pathway.</a> Protein Sci. 15 (3), 449-458 (2006).</li>
<li>Maynard, J., Georgiou, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Antibody engineering.</a> Annu Rev Biomed Eng. 2, 339-376 (2000).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. 1, Fourth, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).</li>
<li>Milo, R., Jorgensen, P., Moran, U., Weber, G., Springer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BioNumbers--the+database+of+key+numbers+in+molecular+and+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">BioNumbers--the database of key numbers in molecular and cell biology.</a> Nucleic Acids Res. 38, D750-D753 (2010).</li>
<li>Hermanson, G. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHermanson%2C+GT+%22Bioconjugate+Techniques%22">Bioconjugate Techniques</a>. , Third, Elsevier/Academic Press. (2013).</li>
<li>Tayapiwatana, C., Chotpadiwetkul, R., Kasinrerk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+using+streptavidin+magnetic+bead-sorted+in+vivo+biotinylated+survivin+for+monoclonal+antibody+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel approach using streptavidin magnetic bead-sorted in vivo biotinylated survivin for monoclonal antibody production.</a> J Immunol Methods. 317 (1-2), 1-11 (2006).</li>
<li>Zhu, G., Song, L., Lippard, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+inhibition+of+nucleosome+mobility+and+transcription+by+cisplatin-DNA+interstrand+crosslinks+in+live+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Visualizing inhibition of nucleosome mobility and transcription by cisplatin-DNA interstrand crosslinks in live mammalian cells.</a> Cancer Res. 73 (14), 4451-4460 (2013).</li>
<li>Bogsch, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+component+of+a+novel+bacterial+protein+export+system+with+homologues+in+plastids+and+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">An essential component of a novel bacterial protein export system with homologues in plastids and mitochondria.</a> J. Biol. Chem. 273, 18003-18006 (1998).</li>
<li>Julian, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-evolution+of+affinity+and+stability+of+grafted+amyloid-motif+domain+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng.+Des.+Sel%22%5BJournal%5D)">Co-evolution of affinity and stability of grafted amyloid-motif domain antibodies.</a> Protein Eng. Des. Sel. 28 (10), 339-350 (2015).</li>
<li>Garber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bispecific+antibodies+rise+again%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug.+Discov%22%5BJournal%5D)">Bispecific antibodies rise again.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 13 (11), 799-801 (2014).</li>
<li>Marschall, A. L., Dübel, S., Böldicke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+in+vivo+knockdown+of+protein+function+by+intrabodies%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Specific in vivo knockdown of protein function by intrabodies.</a> MAbs. 7 (6), 1010-1035 (2015).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

細胞質活性のために抗体を操作することは、ジスルフィド結合6,7の安定化の形成を妨げる細胞質、の還元環境に困難な作業です。これは、それらが細胞質中の安定性と溶解性のために設計されていない限り、ほとんどの抗体が結合親和性のために設計されることに加えて、細胞質に不活性であることが原因となります。ファージディスプレイ、細菌表面ディスプレイ、酵母表面ディスプレイ法の既存の方法は、すべての操作された抗体の表示のために分泌経路14-16を使用しますが、これらの方法は、細胞内の折り畳みを操作する手段がありません。 Tat経路の折り品質管理が不十分に折りたたまれ、細胞質内の不安定される抗体の移行を防止するため、内側膜ディスプレイを使用して操作された抗体は、細胞質の安定性と溶解性が改善されています。この方法は、親和性aの工学、細胞内抗体の反復プロセスを簡素化目の溶解度、二つの特性は、1ステップで操作されているよう。この方法は、還元細胞内環境中での溶解度を有する抗体を改変するために設計されたが、この方法を使用して操作されたタンパク質は、ペリプラズムの酸化性環境中でそれらのフォールディングを維持するので、また、非還元条件下で機能する技術的抗体に適用することができます。 この技術は、高い親和性と高い細胞質溶解性を有する抗体を設計するプロセスを簡素化しますが、いくつかの制限は、このプロトコルを使用する際に考慮することが重要です。有望なscFvは変異体を識別するために、二次スクリーニングELISAシグナルを分析する場合、適切な抗原結合を示さないかもしれない潜在的に興味深い変異体およびそれらの間の目の肥えたためのしきい値は、いくつかのクローンをさらに特徴付けられている後まで明らかになることはまずありません。改善された親抗体を介して結合を探すことが重要です。しかしながら、異常に高い信号は、内側の膜ディスプレイスクリーニングアプローチに固有のものではありません挑戦アビディティ29または凝集効果30の指標である可能性があります。それらは非生存（未発表データ）であるため、このプロトコルを使用するときに覚えておくべき重要な制限は、パニングの後にスフェロプラストを回復することができないことです。これは、抗体をコードするプラスミドを回収するためにDNA増幅および変換ステップを必要とします。 プロトコルのいくつかの重要なステップは、折り畳みおよび抗体の結合の同時エンジニアリングを可能にします。スクリーニングを成功させるには、スクリーニングされるscFvライブラリーはssTorAシグナルペプチドとの融合として発現されなければなりません。このシーケンスがなければ、抗体は、Tat経路に導かれることはありませんので、ペリプラズム19に移行されることはありません。加えて、C末端エピトープタグがビンに表示された抗体の検出を可能にするために、抗体に融合されることが不可欠です鼎アッセイ。明らかに、E。 coli株も必要Tat経路機構を有していなければならないscFvを発現するために使用されるが、これは一般的に使用されるEの真でありますcoli株。 このプロトコルへの改変は、所望の特性を有する抗体を単離する可能性を向上させることが可能です。減法パニングステップは、前の非所望成分のscFvライブラリーを枯渇するために標的抗原に対してパニングを完了することができます。ライブラリーのスフェロプラストは、BCCP単独で、または非所望のタンパク質でコーティングされてコーティングした磁気ビーズとともにインキュベートすることができ、それらのビーズに結合したスフェロプラストは、所望の標的に結合するために、残りの未結合のスフェロプラストをスクリーニングする前に廃棄することができます。代表的な結果で述べたように、分離されたscFvの親和性を改善するための方法は、スフェロプラスト上に表示されたscFvと競合するパンニング反応中の可溶性競合他社を含むことです。可溶性コンプため、etitorにはDNAは、スフェロプラスト上に表示されたscFvのように配列のみでは、PCR反応で回収され、それから増幅されていない、精製されたタンパク質です。さらに、この方法は、抗体の他のタイプの工学または非抗体結合タンパク質に拡張することができます。 大腸菌内側の膜ディスプレイは、高親和性および細胞内溶解性の高レベルの抗体を改変するための強力なプラットフォームです。この方法は、細胞内環境内で機能するように設計された抗体の効率的な操作のために特に適しています。これらの細胞内抗体は、すでに神経変性疾患、癌、およびウイルス感染31を含むフィールドの数の潜在的な治療薬として検討されています。この技術は、研究と医療これらの分野でその場でタンパク質標的を研究が望まれる任意の他のフィールドのためのツールとしての細胞内抗体のより広範な使用を可能にします。

折りたたみ及び細胞内環境内で機能することができる抗体は、研究および治療用途の両方のための有望なツールです。これらは、タンパク質-タンパク質相互作用を防止するために、細胞内で標的タンパク質に結合することによってタンパク質の活性を調節する能力を有するタンパク質-核酸相互作用を破壊する、または酵素1-5に基板へのアクセスを防ぎます。 抗体が細胞内のアプリケーションのための多くの可能性を有するが、標的抗原に結合する能力を維持しながら、細胞内環境における適切な折り畳みと溶解性のためにそれらを操作することは困難です。還元性の細胞質環境は、通常、一本鎖可変断片（scFv）で抗体6,7-含む完全長抗体および抗体フラグメントの安定なフォールディングに必要なジスルフィド結合の形成を防止します。指向進化アプローチの数は、hを有する抗体を設計するために使用されています標的抗原8-10のためのIGH親和性。これらのアプローチは、一般的に、抗体11-13の大きなライブラリーをスクリーニングするファージディスプレイ、酵母表面ディスプレイ、細菌表面ディスプレイを使用します。これらの方法は、標的に結合する抗体を同定するための強力かつ効果的で、まだ彼らは14から16に表示されるタンパク質を輸送するために分泌経路に依存しています。分泌経路は、酵母または細菌中のペリプラズムへの小胞体内腔に減少させる細胞質から展開されたタンパク質を移動します。タンパク質は、次いで、酸化条件下で折り畳むと、細胞表面上に提示または親和17,18の結合についてスクリーニングするファージ粒子中にパッケージングされます。結果として、これらの技術を用いて単離された抗体は、必ずしも細胞質内にうまく折り畳まれず、抗体は細胞内のアプリケーションで使用される場合、細胞内の溶解性は、多くの場合、個別に操作されなければなりません。 改善するために、よく細胞質内に折り畳まれる抗体を改変の効率は、我々は以前MAD-TRAP（関連付けるタンパク質のタットベースの認識のための膜固定表示）の成功、 大腸菌 inner-使用して、scFv抗体ライブラリーをスクリーニングするための方法を報告しましたメンブレンディスプレイ19。細菌の内側の膜ディスプレイは、分泌経路を使用する他の一般的な表示方法とは対照的に、表示された抗体を輸送するためのツインアルギニン転位（TAT）経路に依存しています。 Tat経路は、可溶性の正しく折り畳まれたタンパク質はE.から輸送されることを可能にする品質制御機構を含んでいます内側の膜を横切る、およびペリプラズム20,21に大腸菌細胞質、。過剰発現したTat基質（ すなわち 、TatのシグナルペプチドssTorAへのN末端融合でTat経路を標的とするタンパク質）も細胞質内に折り畳まれているN末端の私との中間長寿命転座を形成します細胞質とペリプラズム19におけるC末端のn。これは、Eのペリプラズム面には、抗体フラグメントを含む、正しく折り畳まれたTat基板の表示を可能にします大腸菌内膜。スフェロプラストを生成するために酵素消化により外膜を除去した後、抗体は、細胞外空間（ 図1）にさらされています。これは、内膜に表示Tatの基板は、特定の標的への結合についてスクリーニングすることを可能にします。重要なのは、細胞表面ディスプレイのためのTat経路を利用すると、結合親和性および細胞内フォールディングの同時エンジニアリングを可能にする、十分に細胞質内に折り畳まれているライブラリ内の唯一の抗体が結合するために尋問されることを保証します。このプロトコルでは、我々は、E上のscFvライブラリーを表示する方法について説明します大腸菌内膜は、標的抗原に対するライブラリをパンし、ライブラリの最も有望な成分を同定するための二次スクリーニングを行います。我々は集中しながら、<html> scFvのプロトコルは、この方法は、そのアプリケーションの結合および細胞内折り畳みを必要とする任意のタンパク質を操作に適用することができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54583/54583fig1.jpg" /> 図1.タット内側の膜が表示されます。E.で大腸菌は、ssTorAシグナル配列の融合体として発現し、正常に細胞質内に折り畳まれたscFv抗体は、内膜を横切って輸送されています。 scFvをが細胞質中のN末端およびペリプラズム中のC末端と、内膜に固定されている転座の中間形態。 E.大腸菌の外膜を酵素的に、それによって細胞外空間に固定する抗体を露出し、表示された抗体のC末端に融合したエピトープタグに特異的に結合する抗体を用いて検出するためにそれらを利用可能にする、スフェロプラストを形成するために消化されます。ロード/ 54583 / 54583fig1large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

<table><tbody><tr><td>scFvライブラリ</td><td>はさまざま</td><td></td><td>です 適切なscFvライブラリは、商用または学術的なソースから入手する必要があります。</td></tr><tr><td>MC4100 E. coli細胞</td><td>Coli Genetic Stock Center</td><td>6152</td><td>細胞は、選択した形質転換方法に応じて、化学的に有能または電気的に有能である必要があります。</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>BP229-4</td><td></td></tr><tr><td>ディフコ脱水培地 LB ブロス、ミラー (ルリア・ベルタニ)</td><td>BD</td><td>244610</td><td></td></tr><tr><td>クロラムフェニコール (Cm)</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>BP904-100</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム (NaCl)</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム (KCl)</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム、二塩基性(Na2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム、一塩基性(KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9706-100</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1521</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、0.5 M</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP2482-500</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム(MgCl<サブ>2</サブ>)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP214-500</td><td></td></tr>リ<tr><td>ゾチーム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>L3790-10X1ML</td><td></td></tr><tr><td>ボルテックス</td><td>ミキサーVWR</td><td>97043-564</td><td></td></tr><tr><td>ビシン</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>サイエンティフィック BP2646100</td><td></td></tr><tr><td>D-ビオチン</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>BP232-1</td><td></td></tr><tr><td>イソプロピル &β;-D-1-チオガラクトピラノシド</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>BP1755-1</td><td></td></tr><tr><td>バグバスター マスター ミックス (細胞溶解洗剤)</td> <td>EMD ミリポア</td><td>71456</td><td></td></tr><tr><td>ビバスピン 2 MWCO, 3,000&nbsp;ダルトン</td><td>GEヘルスケアサイエンス</td><td>28932240</td><td></td></tr><tr><td>標的抗原</td><td></td><td>N/A</td><td>異なる 精製された標的抗原は、購入または製造/精製することができます。</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne ストレプトアビジン T1</td>、<td>Invitrogen</td><td>65601</td><td></td></tr>、<tr><td>Dynamag-2 マグネット</td>、<td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>チューブローテーター</td><td>、VWR</td><td>13916-822</td><td></td></tr>、<tr><td>PCR プライマー</td>、<td>IDT</td><td>N/A</td><td>プライマー配列は、プロトコルに記載されている通りです。</td></tr><tr><td>10x T4 DNAリガーゼ反応バッファー</td><td>New England BioLabs</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polynucelotide kinase (PNK)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0201S</td><td>プライマーリン酸化反応で使用されるT4リガーゼバッファーに1 mM ATPが含まれていることを確認してください。</td></tr><tr><td>5x Phusion HFバッファーパック</td><td>New England BioLabs</td><td>B0518S</td><td></td></tr><tr><td>デオキシヌクレオチド(dNTP)溶液ミックス、各10 mM dNTP</td><td>New England BioLabs</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>Phusion DNAポリメラーゼ</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530S</td><td>他の高忠実度ポリメラーゼを代替として使用できますが、Table 3のアニーリング温度を調整する必要があります。</td></tr><tr><td>C1000 タッチサーマルサイクラー、デュアル 48/48 高速反応モジュール</td><td>Bio-Rad</td><td>185-1148</td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>Promega</td><td>V3121</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA gel stain</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV gel and PCR clean-up system</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Microdialysisメンブレンフィルター</td><td>EMD Millipore</td><td>VSWP04700</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルポリスチレン丸底細胞培養プレート</td><td>VWR</td><td>10062-902</td><td></td></tr><tr><td>Costar 一般ポリスチレンアッセイプレート蓋</td><td>コーニング</td><td>3931</td><td></td></tr><tr><td>マイクロタイタープレートシェーカー</td><td>VWR</td><td>12620-926</td><td></td></tr><tr><td>Costar 96 well EIA/RIA Easy Wash clear flat bottom polystyrene high bind microplate</td><td>Corning</td><td>3369</td><td></td></tr><tr><td>Bel-blotter polycarbonate 96-well replicating tool</td><td>Bel-Art Products</td><td>378760002</td><td></td></tr><tr><td>インスタント無脂肪粉ミルク</td><td>品質 生物学的</td><td>A614-1000</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 (polysorbate 20)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>PopCulture試薬(濃縮細胞溶解界面活性剤)</td><td>EMD Millipore</td><td>71092-3</td><td></td></tr><tr><td>マウスで産生されたモノクローナル抗フラグM2-ペルオキシダーゼ(HRP) 抗体</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8592</td><td></td></tr><tr><td>SigmaFast OPD</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9187-50SET</td><td></td></tr><tr><td>硫酸 (H2SO4), 10&nbsp;N溶液</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>SA200-1</td><td></td></tr>レイ<tr><td>ノルズラップアルミホイル</td><td>VWR89079-075</td><td></td><td></td></tr>バイオ<tr><td>テックエポックマイクロプレート分光光度計</td><td>フィッシャーサイエンティフィック11120570</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

抗体フラグメントのライブラリーをスクリーニングするための細菌インナー膜を表示

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

細胞内機能のために改変された抗体は、その標的抗原に対する親和性を持つだけでなく、細胞質内で可溶性で正しく折り畳まれている必要があります。組換え抗体ライブラリーのディスプレイおよびスクリーニングに一般的に使用される方法は、細胞内タンパク質のフォールディング品質管理を組み込んでいないため、これらの方法を使用して操作された抗体の抗原結合能力、細胞質フォールディングおよび溶解性は、多くの場合、個別に設計する必要があります。ここでは、一本鎖可変フラグメント(scFv)抗体の組換えライブラリーをスクリーニングし、抗原結合と適切な細胞質フォールディングを同時に行うためのプロトコールについて説明します。この方法は、大腸菌ツインアルギニン転座(Tat)経路の固有の細胞内フォールディング品質管理メカニズムを利用して、大腸菌内膜にscFvライブラリを表示します。Tat経路は、可溶性でよく折りたたまれたタンパク質のみが細胞質から輸送され、内膜に表示されることを確実にするため、抗原結合の調査前に折り畳みが不十分なscFvが排除されます。外膜を剥離した後、内膜上に示されたscFvを磁気ビーズに固定化された標的抗原に対してパンニングし、標的抗原に結合するscFvを単離します。酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)ベースの二次スクリーニングを使用して、追加の特性評価に最も有望なscFvを特定します。抗原結合性と細胞質溶解性は、その後の突然変異誘発とスクリーニングにより改善し、細胞内アプリケーション向けに高い親和性と高い細胞質溶解性を持つ抗体を改変することができます。

E.におけるTat経路の細胞内のタンパク質フォールディング品質管理機構コリがよく、還元細胞質環境に折り畳まれるタンパク質に内部細胞膜を横切る輸送を制限します。 ssTorAシグナル配列（天然のTat経路20により搬送されたトラタンパク質からのシグナル配列）へのscFvの融合体を過剰発現することにより、転座は内膜19上のscFvの表示をもたらす、ストールします。外膜の酵素破壊した後、表示された抗体は、抗原結合活性をスクリーニングするために利用できるようになります。 scFvをディスプレイするためのTat経路を利用する能力は、カールソンらによって示された。19（ 図6）。 scFv抗体scFv13とscFv13.R4はによって認識アルギニン - アルギニン残基のペアを欠いているネイティブssTorA配列または修正ssTorAのいずれかに融合させましたTat経路。 scFv13.R4は、指向進化の4ラウンドを通じてscFv13から。マーティらによって設計され、細胞質9でよく折り畳むことが知られています。このscFvは、内膜上に表示したが、ネイティブssTorAシグナル配列への融合物として発現のみ（ 図6）。逆に、scFv13はよく細胞質9が折り畳まれていないので、関係なく、シグナル配列は、それが融合された、内膜にも表示されません。また、場合のscFvは、ディスプレイが内側の膜の表示およびTat経路間の重要なリンクを示す、観察されなかった、TATCタンパク質、タット機械20,28の重要なコンポーネントを欠いていた細胞で発現させました。これらの結果は、Tat経路を介した輸送は、細胞内FOL用スクリーンとして機能するように、正確に細胞質内に折り畳まれているだけTatシグナルペプチドを含むタンパク質とは、内膜上に表示されていることを示しています鼎。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/54583/54583fig6.jpg" /> 内膜上に表示されたscFvの図6.検出。フローサイトメトリー分析は、内膜上の不十分折り畳まscFv13、よく折り畳まれたscFv13.R4の表示を検出しました。 scFvはssTorAシーケンス内のArg-ArgのペアがLys-Lysのに変更されたネイティブssTorAまたはssTorA（KK）に融合させました。 scFvのC末端FLAGエピトープタグは、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）で検出した抗FLAG抗体を抱合。 FLAGタグなしTATCタンパク質（ΔtatC）とssTorA-scFv13ない細胞を対照として試験しました。 Mは、メジアン蛍光値を示しています。許可を得て、基準19から転載。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54583/54583fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 19を向上させます。この、βガラクトシダーゼに対する結合親和性の低いレベルを有するscFv13に基づくエラープローンPCRライブラリーを実証するために、ディスプレイを使用して、標的抗原のβガラクトシダーゼに対してパニングプロトコルに記載の方法をパンニングしました。 scFvを1-4は、突然変異誘発の1ラウンドの後に単離され、パン、scFv13よりも（ 図7A）および細胞質溶解性（ 図7B）、より高いレベルのβ-ガラクトシダーゼするために、より高い結合親和性を示しました。 scFvを1-4に基づいて、新しいライブラリは、エラープローンPCRを使用して作られ、そしてに対するこの第二世代のライブラリーのパニングましたβガラクトシダーゼを記載したプロトコルの変形を使用して行きました。進化の第二ラウンドのためのβガラクトシダーゼに対するパニングは、scFv 1-4よりも高い親和性を有するクローンを単離する可能性を向上させるために競争相手として精製し、可溶性scFv 14の存在下で行いました。突然変異誘発とパンのこの第二ラウンドの後、scFvを2-1およびscFv 2-3は、ELISAに基づく二次スクリーニングを用いて単離しました。これらのscFvはscFv13よりβガラクトシダーゼに対する高い結合親和性を示しただけでなく、最初のラウンドのクローンのscFv 1-4よりも良好な結合を示しただけではなく。 scFvを2-1 scFv13.R4（ 図7A）に匹敵する結合βガラクトシダーゼを示しました。 scFvを2-3また、溶解性および抗原結合の同時エンジニアリングを強調し、scFvを14に比べて細胞質溶解性のさらなる増加を示しています。親和性のscFvの可溶性の発現を同時にについてスクリーニングされるので、選択されたscFvは、MODを有することが可能ですERATEの溶解度が、高い結合、またはその逆。例えば、scFvを2-1は、scFv 2-3よりも低い水溶性発現を有するが、それはβ-ガラクトシダーゼする高い結合親和性を示します。 <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/54583/54583fig7.jpg" /> 図7.ターゲット結合およびscFvの細胞質発現は、内側の膜ディスプレイを用いて単離し変種。（A）のscFvは、 大腸菌の細胞質で発現させました大腸菌細胞（ 例えば 、ssTorAシグナル配列なし）ヘキサヒスチジン（6×-His）タグおよびニッケル-ニトリロ三酢酸のスピンカラムを用いて精製とは。 β-ガラクトシダーゼ、精製scFvの結合は、ELISAで測定しました。精製されたscFvはβガラクトシダーゼでコーティングしたELISAプレートにロードし、結合したscFvを抗6×-His抗体を用いて検出しました。データは、6つの反復試験の平均であり、エラーバーは平均の標準誤差を示します。（B）細胞質抗6×-His抗体でプローブしたウェスタンブロットによって分析したscFvを発現する細胞からの細胞溶解物の可溶性画分および不溶性画分。総タンパク質濃度を、サンプルのローディングを標準化するために使用しました。 （A）転載及び権限を持つ参照19からの（B）に適合される。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54583/54583fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

私たちは、細胞内タンパク質の折り畳みに固有の品質管理メカニズムを持つ大腸菌ツイン-アルギニン転座経路を使用して、抗体フラグメントの結合親和性と細胞質溶解性について抗体フラグメントのライブラリーを同時にスクリーニングする方法を提供します。

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

本手順の全体的な目的は、ツインアルギニン輸送（TAT）経路のフォールディング品質管理を利用して、抗体断片の結合能と細胞内でのフォールディングを一段階でエンジニアリングすることであり、これは細胞内で機能する抗体の作製に応用されます。この手法は、還元的な細胞質環境において抗体が適切にフォールディングし機能するように設計することの困難さなど、抗体エンジニアリング分野における主要な課題を克服するのに役立ちます。細胞質内で良好にフォールディングした抗体のみが提示され、結合能が評価されます。分泌経路に依存する酵母ディスプレイやファージディスプレイに対して、本手法は利点があります。この技術の意義は、抗体によって標的化可能な細胞内病原性が関与する神経変性疾患、癌、およびウイルス感染症の治療にまで及びます。スフェロプラストの作製方法および取り扱いを理解することは困難であるため、本手法を視覚的に提示することは極めて重要です。scFvライブラリーをssTorAシグナル配列に融合させ、37 °Cで3時間振盪培養した後、20 °C、225 rpmで一晩（15～22時間）scFvライブラリーを発現させます。インキュベーション後、分光光度計を用いて600 nmにおける光学密度を測定します。次に、算出された容量の誘導培養液を1.5 mLマイクロ遠心チューブに入れ、室温、12,000 ×gで5分間遠心分離します。上清を除去し、100 µLの氷冷分画バッファー（fB）を用いてペレットを再懸濁します。次に、サンプルを12,000 ×g、室温で1分間遠心分離します。上清を除去した後、3.5 µLの10 mg/mL リゾチームを添加した350 µLの氷冷fBを用いてペレットを再懸濁します。次に、チューブをゆっくりとボルテックスしながら、1 millimolar EDTAを700 µLずつ滴下し、チューブローテーターを用いて室温で20分間インキュベートし、サンプルを混合します。ローテーターからチューブを取り出します。各チューブに氷冷した0.5 molar MgCl2を50 µL加え、氷上で10分間インキュベートします。次に、サンプルを11,000 ×g、4 °Cで10分間遠心分離します。次に、マイクロピペットと1 mLチップを用いて、ペレットの一部をゆっくりと吸い上げます。その後、チューブを傾け、開口部を新しい1.5 mLチューブの真上に向けた状態で、ピペットチップを上清からゆっくりと引き上げ、ペレットを新しいチューブへと滑り込ませます。過剰な上清を除去した後、1 mLの氷冷PBSを用いてスフェロプラストを再懸濁します。凝集した状態で存在する非結合性のscFvはパニングにおいて偽陽性の原因となるため、パニング前にスフェロプラストを完全に再懸濁させる必要があります。テキストのプロトコルに従って標的抗原をビオチン化した後、ストレプトアビジンコート磁気ビーズを元のバイアル内で再懸濁します。次に、7～10 × 10⁹ 個のビーズを1.5 mLチューブに移します。ビーズが入ったチューブをマグネットラックに2分間置き、ビーズをチューブの側面に集めてから、ピペットで上清を慎重に除去します。チューブを磁石から取り外し、気泡が入らないようにPBSを用いてビーズを再懸濁します。その後、チューブをマグネットに戻して緩衝液を除去し、PBSでビーズをさらに2回洗浄します。ビオチン化抗原を含むライセート1 mLをビーズに加え、緩やかに回転させながら室温で30分間インキュベートします。インキュベーション後、1% BSA含有PBSを用いてビーズを5回洗浄します。次に、1%BSA含有PBSを用いてビーズを再懸濁させます。scFvライブラリーをスクリーニングするため、まず4×10⁹個のスフェロプラストと8×10⁸個のビーズを滅菌済みの15mLチューブに加えます。1×PBS（1%BSA含有）を加え、全量を4mLにします。次に、溶液を1 mLずつ4本の1.5 mLチューブに分注し、緩やかに回転させながら4°Cで5時間インキュベートします。PCR用のビーズ結合スフェロプラストを調製するため、パニング反応チューブをマグネットの上に3分間置きます。上清を除去し、前述と同様に1% BSA含有1x PBSでビーズを4回洗浄します。次に、1本あたりのチューブに25 µLのddH20を用いてビーズを再懸濁します。テキストプロトコルに記載されている通り、全プラスミドPCRを行い、ビーズ結合scFvの遺伝子を増幅し、その後PCR産物からプラスミドを再環状化させます。テキストプロトコルに従い、反応液全量をMC4100等量化細胞に形質導入します。ELISAを用いてクローンを同定するために、パンニング後のサブライブラリーのチューブ1本を解凍し、LB寒天培地にプレートします。丸底96ウェル培養プレートの各ウェルに、20 µg/mLのクロラムフェニコールを含むLB培地を200 µLずつ分注します。ピペットチップを用いて、寒天培地から単一のコロニーをピックアップします。次に、チップを96ウェルプレートの最初のウェルに入れ、緩やかに撹拌して接種します。同様に、各ウェルに1コロニーずつ接種していきます。マイクロプレートシェーカーを用いて、37°Cで20～24時間培養します。テキストプロトコルに従って標的抗原コーティング溶液を調製した後、96ウェル高結合クリアポリスチレンELISAプレートの各ウェルに、その溶液を50 µLずつ加えます。プレートを4 °Cで一晩インキュベートします。次に、テキストプロトコルに従って、96ウェル培養プレートからアガープレートへコロニーをリプリケートします。次に、ELISAプレートからコーティング溶液を除去し、テキストプロトコルに従って調製したブロッキング溶液を各ウェルに100 microlitersずつ加えます。室温で少なくとも2時間、または4 degrees Celsiusで一晩インキュベートします。ラウンドボトム培養プレートの各ウェルに濃縮細胞溶解界面活性剤を20 microliters加え、マイクロプレートシェーカーを用いて室温で15〜20分間インキュベートします。ELISAプレートからブロッキング溶液を除去し、テキストプロトコルに従って調製した200 µLの洗浄バッファーでウェルを4回洗浄します。最後の洗浄液を除去した後、細胞溶解プレートの各ウェルから50 µLを、ELISAプレートの対応するウェルに転送します。プレートを室温で1〜2時間インキュベートします。ELISAプレートからサンプルを排出し、ウェルを4回洗浄します。その後、テキストプロトコルに従ってscFvを検出するための抗体溶液を調製します。各ウェルに50 µLの抗体を加え、室温で1～2時間インキュベートします。製造元のプロトコルに従って調製したHRP基質を1ウェルあたり200 microlitersずつ加える前に、ELISAプレートを洗浄バッファーで4回洗浄します。プレートを室温の暗所で30から60分間インキュベートします。反応を停止させるため、各ウェルに3 molarのH2SO4を50 microliters加え、ピペッティングして穏やかに溶液を混ぜ合わせます。最後に、プレートリーダーを用いて492 nanometersで吸光度を測定します。この実験では、scFv抗体scFv13およびscFv13. R4を、天然のssTorA配列または、twin-arginine translocation経路（Tat経路とも呼ばれる）によって認識されない修飾ssTorAのいずれかに融合させました。ScFv。R4は適切に折りたたまれ、天然のssTorAに融合させた際に内膜に発現します。一方、ScFv13は適切に折りたたまれず、どのTatシグナルペプチドに融合させても内膜に提示されません。これらの結果は、Tatシグナルペプチドを含み、かつ細胞質内で正しく折りたたまれたタンパク質のみが内膜に提示されることを示しており、Tat経路が細胞内での折りたたみのスクリーニングとして機能することを証明しています。本実験では、ベータ-ガラクトシダーゼに対する結合親和性が低いscFv13に基づくエラー惹起PCRライブラリーを用いて、ベータ-galに対するパンニングを行いました。その結果、scFv 1-4が単離され、scFv13よりも高いベータ-gal結合親和性と、より高い細胞質溶解性を示しました。このscFv 1-4を競合剤として第2世代scFv 1-4ライブラリーに用いたところ、scFv 2-1および2-3が単離され、scFv13 1-4よりもさらに高いベータ-gal結合親和性が実証されました。これにより、溶解性と抗原結合能の同時エンジニアリングが可能であることが示されました。本手順に続き、精製ライセートを用いたELISAなどの他の手法を実施することで、抗原特異性を検証し、単離したクローンの結合親和性を決定させることができます。このビデオを視聴することで、Tat経路を用いてライブラリを表示させ、磁性ビーズパニングによって抗原結合体を濃縮および単離し、目的の抗原に結合するように機能する抗体をスクリーニングする方法を理解できるはずです。硫酸を用いた操作は極めて危険であるため、適切な個人用保護具を着用することを忘れないでください。

bacterial-inner-membrane-display-for-screening-library-antibody

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

この方法は、同時に、抗原の何百に対するファージディスプレイコンビナトリアル合成抗体ライブラリーから、スケーラブルで高スループットの選択を行うための視覚的な伴奏して説明する。このパラレルアプローチを使用して、我々は、標準的な免疫アッセイにおいて機能的に多様な抗原に対する高い親和性および特異性を示す抗体断片を単離した。...

ファージディスプレイされた合成抗体ライブラリーから、スケーラブルな高スループットの選択

ここでは、著者らは、精製されたモノクローナル抗体とドットブロットハイブリダイゼーションによるペプチドスキャンを使用して、線状抗原エピトープを定義するためのシンプルで効率的なプロトコルを提示します。同定されたエピトープは、その後、治療および診断アプリケーションに使用できます。...

モノクローナル抗体認識リニアB細胞エピトープのペプチドスキャンアシスト識別

バイオパニング細菌の表示ライブラリは、抗体に堅牢な代替ペプチド親和性試薬の発見の実績のある手法です。半自動ソーティング法を本書は誤検知の発生を減らすバイオパニングを合理化します。ここでは、思考プロセスと候補者を評価し、下流の解析を最小限に適用される技術を示しています。...

結果菌株のペプチド親和性試薬の発見と解析のため細菌表示ライブラリの半自動バイオパニング

説明されているプロトコルは、建設、特性および DNA の任意のソースから作られた"domainome"ライブラリの (好みのターゲット) に対して選択を許可します。さまざまな技術を組み合わせた研究パイプラインにより、これ: バクテリオファージの表示、折りたたみ記者とシークエンサー データ解析のための web...

インタラクトーム Seq: Domainome ライブラリーの構築、検証およびバクテリオファージの表示と次世代シーケンシングによる選択のプロトコル

高スループットで新規受容体-リガンド相互作用の同定のため画面細胞外蛋白質のマイクロ アレイのプロトコルを紹介します。タンパク質マイクロ...

低親和性受容体-リガンド相互作用のハイスループット検出の細胞外タンパク質マイクロ アレイ技術

ヒト末梢血単核細胞から個々の抗原特異的抗体を同定し、回収するBSelex法は、フローサイトメトリーと単一細胞PCRおよびクローニングを組み合わせたものです。...

濃縮ヒト記憶B細胞集団からの所望特異性を持つ抗体の選択と回収のための単細胞スクリーニング法

ここでは、特定の標的ペプチドをビオチン化する大腸菌ビオチンタンパク質リゲスBirAの新規変異体を選択する方法を提示する。プロトコルは、標的ペプチドの細菌表示のためのプラスミドの構築、BirAライブラリーの生成、BirA変異体の選択および特徴付けについて説明する。...

新規ビオチニル化酵素の選択のための細菌ペプチド表示

任意の与えられた低分子リガンドに対して所望の親和性および特異性を有する化学的に誘導されたタンパク質二量体化システムを作成することは、多くの生物学的センシングおよび作動アプリケーションを有するであろう。ここでは、ファージディスプレイコンビナトリアル単一ドメイン抗体ライブラリーの段階的選択を介した化学的に誘導された二量体化システムのde...

組み合わせ単一ドメイン抗体ライブラリーの段階的ファージ選択による高特異的化学的誘起タンパク質二量体化システムの作成

このプロトコールは、目的の抗原に結合するタンパク質変異体を濃縮するための酵母表面ディスプレイ選択キャンペーンを実施するための重要なステップを説明しています。...

酵母表面ディスプレイによるタンパク質工学

このプロトコルは、哺乳動物発現系における治療抗体の産生を記載しています。記載されている方法は、ベクターDNAの調製、安定なトランスフェクションおよびアフィニティークロマトグラフィーを用いた大規模な文化や精製の設定ヒト胚性腎臓293細胞株の無血清適応を含みます。...

治療用抗体の実験室規模の産生および精製

学ぶ、大腸菌のツインアルギニン輸送経路を利用して抗体フラグメントの結合親和性と溶解性を同時にスクリーニングする手法。細胞内抗体工学の課題解決に貢献し、神経変性疾患やがん治療への応用が期待されます。

抗体フラグメントのライブラリーをスクリーニングするための細菌インナー膜を表示

さらに動画を探す