抗体フラグメントのライブラリーをスクリーニングするための細菌インナー膜を表示

この手順の全体的な目標は、ツイン-アルギニン転座経路のフォールディング品質管理を利用して、抗体フラグメントの結合と細胞内フォールディングを1つのステップで操作し、抗体が細胞内で機能するように操作することに応用することです。この方法は、抗体が還元性細胞質環境で適切に折り畳まれて機能するように操作することの難しさを克服するなど、抗体工学分野における主要な課題を克服するのに役立ちます。細胞質内で良好に折り畳まれる抗体のみを表示し、結合についてアッセイします。

酵母やファージのディスプレイは、分泌経路に依存してディスプレイを行うという利点があります。この技術の意味は、神経変性疾患、がん、ウイルス感染症の治療にまで及びます。なぜなら、これらの疾患には抗体が標的とする可能性のある細胞内病因が関与しているからです。この方法のVisalデモンストレーションは、スフェロプラストの生成方法と使用方法を理解することが難しいため、非常に重要です。

scFvライブラリをssTorAシグナルシーケンスに融合させ、37°Cで3時間振とうしながら増殖させた後、scFvライブラリを20°C、225rpmで一晩15〜22時間発現させます。インキュベーション後、分光光度計を使用して600ナノメートルの光学密度を測定します。次に、1.5ミリリットルの微量遠心チューブ内で、12, 000倍のgと室温で5分間、誘導培養の計算量を遠心分離します。

上清を取り除き、100マイクロリットルの氷冷分画緩衝液またはfBを使用してペレットを再懸濁します。次に、サンプルを 12 、 000 倍の g と室温で 1 分間遠心分離します。上清を取り除いた後、350マイクロリットルの氷冷fBに10ミリグラム/ミリリットルのリゾチーム3.5マイクロリットルを補充して、ペレットを再懸濁します。.

次に、チューブをゆっくりとボルテックスしながら、700マイクロリットルの1ミリモルEDTAを滴下し、チューブを室温でチューブローテーター上で20分間インキュベートしてサンプルを混合します。ローテーターからチューブを取り外します。50マイクロリットルの氷冷点5モルMgCl2を各チューブに加え、氷上で10分間インキュベートします。

次に、サンプルを11, 000倍のgと摂氏4度で10分間遠心分離します。次に、マイクロピペットと1ミリリットルの先端を使用して、ペレットの一部をゆっくりと引き上げます。次に、チューブを保持しながら、新しい1.5ミリリットルのチューブの真上の開口部と斜めに、ピペットの先端を上清からゆっくりと持ち上げ、ペレットを新しいチューブにスライドさせます。

余分な上清を取り除いた後、1ミリリットルの氷冷PBSを使用してスフェロプラストを再懸濁します。.凝集体中に非結合性scFvが存在すると、パンニングによる偽陽性が発生するため、スフェロプラストはパンニングの前に完全に再懸濁する必要があります。テキストプロトコルに従って標的抗原をビオチン化した後、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズを元のバイアルに再懸濁します。

次に、1.5ミリリットルのチューブに9番目のビーズに10を7〜10倍移します。ビーズのチューブを磁気ラックに2分間置き、チューブとピペットの側面にあるビーズを収集して、上清を慎重に取り除きます。チューブを磁石から取り外し、PBSを使用して気泡を発生させずにビーズを再懸濁します。

次に、チューブを磁石に戻し、バッファーを取り外してから、ビーズをPBSでさらに2回洗浄します。ビオチン化抗原を含むライセート1ミリリットルをビーズに加え、室温で30分間静かに回転させながらインキュベートします。インキュベーション後、PBSと1%BSAを使用してビーズを5回洗浄します。

次に、PBSと1%BSAを使用してビーズを再懸濁します。scFvライブラリーをスクリーニングするには、まず、滅菌済みの15ミリリットルチューブに、9番目のスフェロプラストに10の4倍、8番目のビーズに10の8倍を加えます。1%BSAを含むPBSを1つ追加して、総容量を4ミリリットルにします。

次に、溶液をそれぞれ1ミリリットルの4本の1.5ミリリットルチューブに分注し、5時間穏やかに回転させて摂氏4度で反応をインキュベートします。PCR用のビーズ結合スフェロプラストを調製するには、パンニング反応チューブを磁石に3分間置きます。上清を取り除き、ビーズを1%BSAを含むPBS1個で前回4回洗浄します。

次に、チューブあたり25マイクロリットルのddH20を使用して、ビーズを再懸濁します。テキストプロトコルに記載されているように、全プラスミドPCRを実施してビーズ結合scFvの遺伝子を増幅し、PCR産物からプラスミドを再環化します。テキストプロトコルに従って、反応全体をMC4100均等化細胞に変換します。

ELISAを使用してクローンを同定するには、パンニングしたサブライブラリの1つのチューブを解凍し、LB寒天プレートでプレートします。200マイクロリットルのLBと20マイクログラム/ミリリットルのクロラムフェニコールを丸底の96ウェル培養プレートの各ウェルに加えます。ピペットチップを使用して、寒天プレートから個々のコロニーを選択します。

次に、チップを96ウェルプレートの最初のウェルに置き、穏やかに攪拌して接種します。各ウェルに1つのコロニーを引き続き接種します。マイクロプレートシェーカーで摂氏37度で20〜24時間インキュベー

テキストプロトコールに従って標的抗原コーティング溶液を調製した後、96ウェルの高結合性透明ポリスチレンELISAプレートの各ウェルに50マイクロリットルの溶液を加えます。プレートを摂氏4度で一晩インキュベートします。次に、テキストプロトコルに従って、96ウェル培養プレートのコロニーを寒天プレートに複製します。

次に、ELISAプレートからコーティング溶液を空にし、テキストプロトコルに従って調製した100マイクロリットルのブロッキング溶液を各ウェルに加えます。室温で少なくとも2時間、または摂氏4度で一晩インキュベートします。丸底培養プレートの各ウェルに20マイクロリットルの濃縮細胞溶解界面活性剤を加え、マイクロプレートシェーカーで培養プレートを室温で15〜20分間インキュベー

ELISAプレートからブロッキング溶液を空にし、テキストプロトコルに従って調製した200マイクロリットルの洗浄バッファーでウェルを4回洗浄します。最終洗浄液を除去した後、細胞溶解プレートの各ウェルから50マイクロリットルをELISAプレートの対応するウェルに移します。プレートを室温で1〜2時間インキュベートします。

ELISAプレートからサンプルを空にし、ウェルを4回洗浄します。その後、テキストプロトコルに従ってscFvsを検出するための抗体溶液を調製します。各ウェルに50マイクロリットルの抗体を添加し、室温で1〜2時間インキュベートします。

ELISAプレートを洗浄バッファーで4回洗浄してから、メーカーのプロトコルに従って調製したHRP基質のウェルあたり200マイクロリットルを添加します。プレートを暗所で室温で30〜60分間インキュベートします。反応を急冷するには、各ウェルに50マイクロリットルの3モルH2SO4を加え、静かにピペットで溶液を混合します。

最後に、492ナノメートルのプレート読み取り値を使用して吸光度を測定します。この実験では、scFv抗体scFv13およびscFv13。R4は、ネイティブのssTorA配列、またはTat経路とも呼ばれるツインアルギニン転座経路によって認識されない修飾されたssTorAのいずれかに融合されました。

R4はよく折り畳み、天然のssTorAに注入すると内膜に発現します。ScFv13は、どのTatシグナルペプチドに融合しているかに関わらず、うまく折り畳まれず、内膜上に表示されません。これらの結果は、Tatシグナルペプチドを含み、細胞質内で正しく折り畳まれたタンパク質のみが内膜に表示され、Tat経路が細胞内折り畳みのスクリーニングとして機能することを示しています。

この実験では、β-ガラクトシダーゼに対する結合親和性が低いscFv13に基づくエラーが発生しやすいPCRライブラリをβ-galに対してパンニングしました。ScFv 1-4は単離され、scFv13よりもβ-galに対する高い結合親和性、ならびにより高いレベルの細胞質溶解性を示した。scFv 1-4を第2世代のscFv 1-4ライブラリーの競合物質として用いたところ、scFv 2-1および2-3が単離され、scFv13 1-4よりもβ-galに対する結合親和性がさらに高いことが示され、溶解性と抗原結合の同時エンジニアリングが強調されました。

この手順に続いて、精製ライセートを使用するELISAのような他の方法を実行して、抗原特異性を検証し、単離されたクローンの結合親和性を決定することができます。このビデオを見た後、Tat経路を使用してそのライブラリを表示し、磁気ビーズパンニングを使用して抗原結合剤を濃縮および単離することにより、目的の抗原に結合するために抗体をスクリーニングする方法を理解できるはずです。硫酸を扱う作業は非常に危険であり、適切な個人用保護具を着用する必要があることを忘れないでください。