の効率的な胞子形成サッカロマイセス・セレビシエ 96マルチウェルフォーマットで

このプロトコルの全体的な目標は、出芽酵母を96ウェルフォーマットで効率的に胞子形成することです。出芽酵母については多くの大規模なスクリーニングが行われていますが、減数分裂と胞子形成を調べるハイスループット研究は限られています。このビデオで説明している手法には、ハイスループットスクリーニングと互換性のある96ウェルフォーマットで、費用対効果の高い方法で酵母を効率的に胞子形成できるという利点があります。

私が最初にこの方法を思いついたのは、難治性胞子を形成できない変異体の高コピーサプレッサーをスクリーニングするために、タイル張りの2ミクロンプラスミドライブラリーを使用したかったからです。当初、私の胞子形成効率は96ウェルフォーマットでは貧弱でした。これは通気が不十分だったためであることがわかりました。

この手順は、SK1酵母株を酵母抽出物、ペプトングリセロール、またはYPGプレートに解凍することから始めます。滅菌スティックを使用して、グリセロールストックを含む冷凍バイアルから少量の細胞をこすり落とし、YPGプレートに広げます。酵母を摂氏30度で12〜16時間育てます。

次に、YPGプレートから酵母を酵母抽出物ペプトンデキストロース(YPD)プレートに縞模様で貼り付けます。YPDプレート上で酵母を摂氏30度で24〜48時間増殖させます。YPD固体培地で24〜48時間増殖した後、YPDプレートの1つのコロニーを使用して25ミリリットルのYPD培養を開始します。

この培養物を摂氏30度の振とうインキュベーターで220 RPMで一晩成長させ、細胞がOD600が4.0〜7.0に達するまで培養します。翌日、YPD培養液の細胞を適量使用して、酵母抽出物ペプトンアセテート(YPA)でOD600が0.1の125ミリリットル培養を開始します。摂氏30度の振とうインキュベーターで220 RPMで培養物を培養し、OD600が1.3〜1.5になるまで

培養物を遠心チューブに移し、卓上遠心分離機で1800X Gで5分間回転させ、細胞をペレット化します。0.5容量の滅菌オートクレーブ脱イオン水で細胞を一度洗浄します。もう一度回転させて水を捨てます。

細胞を1倍量の胞子形成培地に再懸濁します。異なる遺伝子型の細胞を調製するために、96マルチウェルプレートで解凍した凍結ストックの細胞を最初にYPG固体培地に移します。96プロングフロッガーを炎にかけ、固形培地のプレートで一時的に冷却してから、酵母コロニーに触れます。

酵母を摂氏30度で一晩成長させます。翌日、株の遺伝子型に応じて、YPG固体培地から細胞をYPDまたは選択的固体培地に移します。このデモではYPDを使用しています。

酵母を摂氏30度で増殖させ、各菌株にコロニーが形成されるまで培養します。1.2ミリリットルのYPD液体培地を96ディープウェルプレートの各ウェルに分注します。細胞を固体培地から液体培地に移します。

長方形のペトリプレートのプラスチック製の蓋でプレートを覆い、テープを使用して蓋を所定の位置に保持し、空気循環を最小限に抑えます。細胞を摂氏30度のシェーカーで220RPMで一晩成長させます。翌日、1800X Gで5分間遠心分離します。

培地を注ぎ、各ウェルに500マイクロリットルのYPAを加えます。そして、ペレット化された細胞を再懸濁します。プレートをテープで固定したプラスチック製の蓋で覆います。

220 RPMで摂氏30度の振とうインキュベーターで細胞を15時間増殖させます。効率的な胞子形成のための適切な通気を行うには、96ウェルプレートの各ウェルに、3mmの滅菌固体ガラスビーズ1個または5mm×2mmの滅菌磁気攪拌子を1個追加します。すべての細胞が同じ遺伝子型である場合は、500マイクロリットルの細胞と培地を96マルチウェルプレートの各ウェルに分注します。

プレートをテープで固定したプラスチック製の蓋で覆います。細胞の遺伝子型が異なる場合は、YPA中の細胞を1800X Gで5分間回転させ、培地を注ぎます。各ウェルに500マイクロリットルの胞子形成培地を追加します。

そして、ペレット化した細胞を胞子形成培地に再懸濁します。プレートをテープで固定したプラスチック製の蓋で覆います。ガラスビーズを使用する場合は、サンプルを摂氏30度の振とうインキュベーターに入れ、胞子形成のために220RPMで振とうします。

マグネティックスターバーを使用する場合は、胞子形成のために摂氏30度のインキュベーター内のスタープレートにサンプルを置きます。磁気バーの正確な攪拌速度は、すべてのバーがエネルギー的に動き、培養が曝気されている限り、あまり重要ではありません。36時間後、胞子形成による進行を監視するためにサンプルを回収します。

各胞子培養物から6マイクロリットルの細胞を回収し、96ウェルカバースリッププレートで24マイクロリットルの胞子形成培地に加えます。細胞を5分間落ち着かせてから、倒立顕微鏡で細胞を検査します。2つの異なる菌株の代表的な胞子形成は、倒立顕微鏡の63倍対物レンズを使用して視覚化された細胞のこれらの画像に示されています。

矢印で示されている屈折性テトラッドは、野生型の培養物で見ることができます。しかし、胞子形成欠損smk1細胞を含む培養物では細胞を欠失させません。マルチウェルプレートで胞子嚢を形成した細胞の胞子形成効率と、フラスコで大容量の胞子嚢を採取した細胞とを比較しました。

マルチウェルプレートの使用では、フラスコでの胞子形成のより一般的なプロトコルを使用する場合に日常的に見られる高い効率は達成されませんでした。適切な曝気によりマルチウェルプレートで胞子形成を行うと、50%を超える十分な胞子形成効率を達成でき、5mmの攪拌子を使用して最良の結果を得ることができます。しかし、小型の攪拌子のコストが高いことを考えると、ガラスビーズを使用して得られる効率は同等です。

5mmと7mmの攪拌子はどちらも96マルチウェルプレートのウェルに収まりますが、7mmの攪拌子を使用すると胞子形成効率が悪くなりました。井戸内の7ミリメートル攪拌子は、隣接する井戸内の攪拌子と相互作用する傾向があります。バーが適切に攪拌されるのを防ぎ、培養物に適切な通気を提供します。

このビデオを見れば、96ウェルフォーマットの液体培養で酵母細胞を効率的に胞子形成する方法を十分に理解できるはずです。このプロセスをマスターすると、適切に行えば、このプロセスは6日で完了できます。この手順は、さまざまな変異株、プラスミド、または低分子阻害剤の減数分裂および胞子形成に対するそれらの影響をスクリーニングするために使用できます。

開発後、この技術は、減数分裂細胞周期の調節と、出芽酵母の胞子形成における細胞質分裂と減数分裂がどのように結合するかを研究するために使用されました。