Name: の効率的な胞子形成サッカロマイセス・セレビシエ 96マルチウェルフォーマットで (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: 学ぶ Saccharomyces cerevisiae の96ウェルプレートを用いた効率的な胞子形成法。最適な通気条件により高スループットスクリーニングを可能にし、遺伝子ライブラリーの解析に応用できます。

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この作品は、NIH（LSH）からマサチューセッツ州ボストン（LSH）およびR15 GM86805の大学のジョセフ・P.ヒーリーの助成金によってサポートされていました。 SMPは、マサチューセッツ州ボストンの大学でサノフィ・ジェンザイムフェローシップによって部分的にサポートされています。

1.胞子形成のための準備注：このプロトコルに記載されたメディアは、標準的なレシピと方法13,17を用いて製造される。表1は 、このプロトコルで使用される様々なメディアの1 Lのための製剤が得られます。 <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" height="180" width="469"><colgroup><col /><col /><col span="3" /><col /><col span="2" /></colgroup><tbody><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"></td><td style="width: 55px;">バクトペプトン</td><td style="width: 50px;">酵母エキス</td><td style="width: 50px;">バクト寒天</td><td style="width: 60px;">ブドウ糖</td><td style="width: 70px;">酢酸カリウム</td><td style="width: 60px;">グリセロール</td><td style="width: 60px;"> ddH 2 O </td></tr><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"> YPGプレート</td><td> 20グラム</td><td> 10グラム</td><td> 20グラム</td><td> - </td><td> - </td><td> 30ミリリットル</td><td> 970ミリリットル</td></tr><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"> YPDプレート</td><td> 20グラム</td><td> 10グラム</td><td> 20グラム</td><td> 20グラム</td><td> - </td><td> - </td><td>千ミリリットル</td></tr><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"> YPD液体</td><td> 20グラム</td><td> 10グラム</td><td> - </td><td> 20グラム</td><td> - </td><td> - </td><td>千ミリリットル</td></tr><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"> YPA液体</td><td> 20グラム</td><td> 10グラム</td><td> - </td><td> - </td><td> 20グラム</td><td> - </td><td>千ミリリットル</td></tr><tr height="15"><td style="height: 20px; width: 80px;">胞子形成培地</td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 10グラム</td><td> - </td><td>千ミリリットル</td></tr></tbody></table> 表1：メディア製剤金額はメディアの1 Lのために与えられています。メディアに関する詳細成分は、材料表に記載されています。 <ol><li>すべての胞子形成細胞は同じ遺伝子型になる場合は、次の手順を実行します。 <ol><li>解凍酵母株はYPG（YPGlycerol）プレートに使用されます。 30℃で12-16時間、酵母を育てます。重要なことは、SK1細胞はまた、胞子形成する態勢を整えているので、SK1株はYPGプレート上に長すぎる残されるべきではない、またはそれらは、プレート上で胞子を形成することができます。 注：炭素源としてのグリセロールの使用は、酸化的リン酸化を必要とし、従って、機能的なミトコンドリアDNAを有する細胞について選択するようYPG上に成長した新たに解凍した株が好ましいです。 SK1細胞は、機能的なミトコンドリアDNAを失い、petitesのになる傾向を有します。機能的なミトコンドリアDNAは、胞子形成のために必要とされます。 </li><li>単一コロニーのためのYPD（YPDextrose）プレート上にYPGプレートからストリーク酵母。 30℃でYPDプレート24-28時間に酵母を成長させます。 </li><li> YPD固体培地上での増殖の約36〜48時間後、単一コロニーを使用して、25ミリリットルのYPD培養を開始YPDプレートから。細胞は7.0〜約OD 600 = 4.0になるまで、この文化を育てます。 220 rpmで振とう、振盪インキュベーター中で30℃で一晩、この手順を実行します。 </li><li> YPD培養物から、（220で振盪30℃振盪インキュベーター中で酵母を育てる2節の各96ウェルプレートの必要性のためにOD 600 = 0.1であることYPA（YPAcetate）文化の千ミリリットルを開始するために、細胞の適切な量を使用します培養OD 600までの回転数）は1.5から1.3の間です。 注：4 96マルチウェルプレートをスクリーニングする場合は、各96マルチウェルプレートのためのYPA培地の100ミリリットルを接種は、例えば、第2節でスクリーニングするために、YPA培地の400ミリリットルが必要になります。 YPA培養における10％の余分なボリュームで起動すると、蒸発量が消失するのを防止することが必要です。細胞は、適切なOD 600に到達するために一般的には、12-16時間の間になります。時間の量は、酵母株の遺伝子型に依存して変化し得ます。 YPAはpresporulationメディアです。 Pregrowth酢酸で効率的かつ同期胞子形成6のために必要な（例えばIME1など）の遺伝子の発現を誘導するのに役立ちます。 </li><li> 5分間テーブルトップ遠心機で1800×gでスピンはYPAで増殖させた細胞をペレット化します。洗浄細胞は、滅菌オートクレーブした脱イオン水0.5体積の1倍。再びスピン、および洗浄を捨てます。 1×ボリュームの胞子形成培地で細胞を再懸濁し。第2節に進みます。 </li></ol></li><li> 96マルチウェルフォーマットに、（ すなわち 、異なるプラスミドまたは異なる変異を含むで形質転換され、一般的に入手し、凍結ストックとして保存されている）、異なる遺伝子型の配列の細胞を、異なる遺伝子型のもので胞子形成のために細胞を使用している場合。そして、次の手順を実行します。 <ol><li> YPG固体培地上で96マルチウェルプレート（複数可）で解凍凍結ストックから細胞を転送するために、無菌の96プロングフロッガーを使用してください。 30℃での酵母の一晩を成長させます。 </li><li>滅菌96プロングフロッガーを使用して、YPD固形培地または選択的にYPG固体培地から細胞を転送固体培地（アミノ酸を欠いている、すなわち 、合成最小培地、細胞は選択を必要とするプラスミドが含まれている場合）。コロニーを各株のために形成されるまで、選択培地が必要であればYPD及び2日目に、典型的には1日、30℃で酵母を成長します。 </li><li>アリコート96深い2ミリリットルマルチウェルプレートの各ウェルにYPD液体培地または選択液体培地の1.2ミリリットル。フロッガーを使用して液体培地に固体培地から細胞を移すには、テープによって所定の位置に保持されたプラスチック蓋でカバーし、220 rpmで振とうしながら、30℃のシェーカーで一晩増殖します。 注：長方形のペトリプレートからプラスチックのふたを使用して、カバープレートの汚染を最小限にします。空気の循環が最小限に制限されているように、テープ片を使用して所定の位置に蓋を保持します。 </li><li> 96ウェルプレートを収容するためのアダプタを有するスイングバケット遠心機を用いて5分間、1,800×gで遠心分離板。細胞からの培地を捨て、各ウェルに500μlのYPAを追加し、YPAでペレット化した細胞を再懸濁します。カバープラスチック蓋をテープで適所に保持。 </li><li> 220 rpmで振とう、振盪インキュベーター中で30℃で15時間、細胞を増殖させます。第2節に進みます。 </li></ol></li></ol> 96マルチウェルフォーマット2.胞子形成細胞<ol><li> 1.3ミリリットルウェルを有する96ウェルプレートの各ウェルに1 3ミリメートル滅菌固体ガラスビーズまたは滅菌5ミリメートルのx 2ミリメートルの磁気攪拌棒のいずれかを追加します。 （ビーズまたは攪拌棒を使用するかどうかについての議論については、以下の代表的な結果を参照してください。） </li><li>スクリーニングされるすべてのセルが同じ遺伝子型である場合は、2.2.1に進みます。スクリーニングされる細胞は、異なる遺伝子型である場合は、2.2.2に進みます。 <ol><li> 96マルチウェルプレートの各ウェルにステップ1.1.5アリコート細胞+培地500μlのから細胞を取ります。テープによって所定の位置に保持プラスチック製のふたでカバーしています。 2.3に進んでください。 </li><li> 96ウェルプレートを収容するためのアダプタとスイングバケット遠心機を用いて1.2.4から5分間、1800×gでYPAであるスピン細胞、。の流動細胞からのFメディア。各ウェルに胞子形成培地500μlを添加して、胞子形成培地でペレット化した細胞を再懸濁します。テープによって所定の位置に保持プラスチック製のふたでカバーしています。 2.3に進んでください。 </li></ol></li><li>ガラスビーズを使用している場合は、場所の30℃の振盪培養器内のサンプルとは、胞子形成のための220 rpmで振とうします。胞子形成のために30℃インキュベーターの内側撹拌プレート上の磁気撹拌棒、場所のサンプルを使用している場合。 注：磁気攪拌棒の正確な撹拌速度は限りすべてのバーが精力的に動いていると文化を通気するように、非常に重要ではありません。 </li><li> （：5希釈1）可視化のために胞子形成培養物からサンプルを引き出す、胞子形成の進行を監視するために、96ウェルカバースリッププレートに胞子形成培地の24μlに胞子形成培養物から細胞の6μlを添加。倒立顕微鏡を用いて細胞を検査する前に5分間沈降細胞を残します。 注：野生型SK1細胞では、コンパクトな成熟した胞子が3によって形成されます胞子形成培地に移した後、6時間。胞子形成の進行は、例えば、核マーカー、蛍光マーカーを用いて顕微鏡検査によりモニターすることができる（ すなわち 、HTB2-mCherryを18）が減数分裂またはprospore膜マーカーを調べるために（ すなわち 、G20 19）は胞子形態形成を調べました。あるいは、屈折胞子の形成は、胞子形成培地に移した後、約12時間を開始ノマルスキー微分干渉顕微鏡を用いて見ることができます。 </li></ol>

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</ol>

著者には競合する金銭的利益はありません。

ここでは、96マルチウェルフォーマットでSK1酵母を胞子形成するためのプロトコルを提示します。エアレーションは、各ウェル中の攪拌棒やガラスビーズのいずれかの使用を必要とする、効率的な胞子形成するためのキーです。細胞は、ビーズや撹拌棒のいずれかなし振盪インキュベーター中で96マルチウェルプレートに胞子形成されている場合、細胞が効率的に胞子を形成しません。細胞は、ビーズまたは（撹拌せずに30℃で、表1であることと比較して、振とう培養器で攪拌棒、のいずれかなしに胞子形成されたときに胞子形成効率のわずかな増加が見られ、10％対シェーカーで17％が攪拌に置かプレート）。 7ミリメートルの攪拌棒は、隣接するウェル内の攪拌棒との相互作用に適切文化を曝気しなかったため、同様に、7ミリメートルの撹拌棒の使用は、おそらく、貧しい胞子形成効率（28％）が得られました。このプロトコルは、SPOを研究するために一般的に使用される同期かつ効率的に胞子形成SK1酵母株7,8を使用して胞子形成のための条件を説明しrulation;このプロトコルを使用して、他の酵母株を得ることができる胞子形成効率は、これらの技術を...

出芽酵母における胞子形成が減数分裂1、遺伝子組換え2のメカニズム、3シグナル伝達細胞による開発のコントロール、開発4の栄養制御、転写時の染色体分離の制御を含む生物学の多くの側面、洞察を提供することが検討されています開発5の規制、および胞子形成6の検討。胞子形成は、保護胞子壁6の堆積に続いて母細胞内の新しい膜区画の形成を含む新規な細胞分裂事象を含みます。胞子形成細胞を調べるこれらの研究は、多くの場合、比較的効率的なやり方7,8で約24時間で胞子形成のプロセスを経ることができる急速に胞子形成酵母株SK1、を利用します。出芽酵母のための胞子形成条件の最適化は、9月13日 、これらの実験について説明したがSは、固体培地上または胞子形成は、培養チューブもしくはフラスコを用いて行われる大規模な液体培養物中で胞子形成を調べました。 ここでは、96マルチウェルプレートフォーマットで酵母を胞子形成するための方法を説明します。我々は、この方法のために、通気が同期および効率的な胞子形成のために重要であることを見つけると、小容量マルチウェルフォーマット十分な胞子形成を確保するための手法を考案しました。細胞は、高スループット技術とタイルライブラリ14-16を使用して高コピー抑制のためのマルチウェルプレートフォーマット、このようなスクリーニングのために最適化された試薬を用いてスクリーニングされる96マルチウェルプレート形式で胞子形成することができます。

<table><tbody><tr><td>Nunc 1.3 ml DeepWell プレート</td><td>ThermoScientific</td><td>260251</td><td>胞子形成に使用</td></tr><tr><td>Nunc 2.0 ml DeepWell プレート</td><td>ThermoScientific</td><td>278743</td><td>胞子形成前増殖に使用、ステップ 1.2.3</td></tr><tr><td>3 mm ガラスビーズ</td><td>フィッシャー</td><td>11-312A</td><td>胞子形成に使用</td></tr><tr><td>5 mm x 2 mm 攪拌子、12 個入りパック</td><td>フィッシャー</td><td>14-511-82</td><td>胞子形成に使用</td></tr><tr><td>96井戸フロッ</td><td>ガーV&ステップ</td><td>1.2</td>のライブラリコピー機V&に必要なP Scientific <td>VP407</td></tr><tr><td></td><td>ステップ</td> 1.2 に必要な P Scientific <td>VP381</td><td>; フロッガー</td></tr><tr><td>長方形のペトリ皿</td>と一緒に使用 <td>ステップ 1.2 に必要な</td><td>ThermoScientific</td><td>264728</td></tr><tr><td>培地に必要な</td><td>バクトペプトン</td><td>BD</td><td>211677培</td>地に必要な</tr><tr><td>酵母エキス</td><td>BD</td><td>212750</td> 培<td>地に必要な</td></tr><tr><td>バクト寒天</td><td>培</td>地に必要な BD <td>212750</td><td></td></tr> デ<tr><td>キストロース</td><td></td><td>メディアに必要な</td>フィ<td>ッシャーD16-3</td></tr><tr><td>メディアに必要な酢酸カリウム</td><td></td><td>フィ</td><td>ッシャーP171-500</td></tr> メディアに必要な<tr><td>グリセロール</td><td></td><td>フィ</td><td>ッシャーG33-500</td></tr><tr><td>ブラック96ウェルガラス底板</td> ステップ<td>2.4に必要な</td><td>マットテック</td><td>PBK96G-1.5.5-F</td></tr></tbody></table>

の効率的な胞子形成<em&gt;サッカロマイセス・セレビシエ</em&gt; 96マルチウェルフォーマットで

Efficient Sporulation of Saccharomyces cerevisiae in a 96 Multiwell Format

栄養ストレスの時期に、Saccharomyces cerevisiaeは胞子形成として知られる配偶子形成を経験します。窒素と炭素が不足している二倍体酵母細胞は、胞子形成プロセスを開始します。胞子形成のプロセスには、減数分裂とそれに続く胞子形成が含まれ、一倍体核が環境に耐性のある胞子にパッケージ化されます。私たちは、96枚のマルチウェルプレートで出芽酵母の効率的な胞子形成の方法を開発し、酵母細胞の胞子形成表現型のスクリーニングのスループットを向上させました。これらの方法は、適切な最小培地を使用する場合に栄養選択が必要なプラスミドを含む酵母のスクリーニング、または豊富な胞子形成レジメンを使用する場合にゲノム変化を伴う酵母のスクリーニングに適合します。この方法では、胞子形成中の通気が胞子形成に重要であることがわかり、96マルチウェルプレートフォーマットに適合した十分な通気を確保するための技術を考案しました。これらの方法では、大容量フラスコベースの実験で達成できる典型的な~80%レベルの胞子形成は達成されませんが、これらの方法では、少量のマルチウェルプレートで約50〜60%の胞子形成を確実に達成できます。

<html> （上記のように）このプロトコールを評価するために、胞子形成効率は、マルチウェルプレート中で胞子形成細胞から得られたフラスコ（ 表2）に大きなボリュームを使用して胞子形成細胞と比較しました。マルチウェルプレートの使用は〜80％の効率が日常的に見ることができるフラスコに胞子形成時に見られる高効率を達成しませんでした。 （ガラスビーズまたは攪拌棒で提供される）適切な通気とマルチウェルプレートに胞子形成することは最良の結果（66％効率）5ミリメートル×2ミリメートル撹拌棒を用いて得られたと、十分な胞子形成効率を50％より多くを達成することができます。二つの異なる株（野生型とsmk1Δ）の代表的な胞子形成は、（ 図1）ここに示されています。これらの細胞は、胞子形成培地で36時間後に検査し、96ウェルガラス底板を用いて可視化しています。 84 / 54584fig1...

ここでは、出芽酵母の胞子形成が96マルチウェル形式で行われます。

During times of nutritional stress, Saccharomyces cerevisiae undergoes gametogenesis, known as sporulation. Diploid yeast cells that are starved for ...

本プロトコルの全体的な目的は、出芽酵母を96ウェル形式で効率的に胞子形成させることです。出芽酵母を用いた大規模なスクリーニングは数多く実施されてきましたが、減数分裂および胞子形成に着目したハイスループット研究は限られていました。本ビデオで解説する手法は、ハイスループットスクリーニングに対応した96ウェル形式で、コスト効率よく酵母を効率的に胞子形成させることができるという利点があります。この手法を考案したきっかけは、屈折性胞子を形成できない変異体の高コピー抑制因子をスクリーニングするために、タイル状の2ミクロン・プラスミドライブラリーを使用したいと考えたことでした。当初、96ウェルフォーマットでは胞子形成効率が低いという問題がありました。その原因は、通気不足にあることがわかりました。まず、SK1酵母株を酵母エキスペプトングリセロール（YPG）プレート上で融解させます。滅菌棒を用いて、グリセロールストックが入った冷凍保存バイアルから少量の細胞を掻き出し、YPGプレートに塗布します。酵母を30 °Cで12〜16時間培養します。次に、YPGプレートから酵母を酵母エキス・ペプトン・デキストロース（YPD）プレートにストリークし、単一コロニーを分離します。YPDプレート上で酵母を30 degrees Celsiusで24から48時間培養します。YPD固体培地で24から48時間培養した後、YPDプレート上の単一コロニーを用いて25 milliliterのYPD培養を開始します。この培養液を30 °Cの振盪インキュベーターにて220 RPMで一晩培養し、細胞のOD600が4.0から7.0に達するまで育成します。翌日、YPD培養液から適切な量の細胞を用い、OD600が0.1となるように酵母エキスペプトン酢酸（YPA）を用いて125 mLの培養を開始します。この培養液を30 °Cの振盪インキュベーターにて220 RPMで、OD600が1.3から1.5の間になるまで育成します。培養物を遠心チューブに移し、卓上遠心機を用いて 1800X G で5分間遠心分離し、細胞をペレット化します。滅菌オートクレーブ済みの脱イオン水を 0.5 volume 加えて、細胞を1回洗浄します。再度遠心分離を行い、上清を除去します。細胞を1倍量の胞子形成培地で再懸濁します。異なる遺伝子型の細胞を準備するには、96ウェルプレート内の凍結保存ストックから融解した細胞を、まずYPG固体培地に転写します。96本爪のフロッガーを火炎滅菌し、固体培地プレート上で一時的に冷却させた後、酵母コロニーに接触させます。酵母を30°Cで一晩培養します。翌日、株の遺伝子型に応じて、細胞をYPG固形培地からYPDまたは選択固形培地に移します。本デモンストレーションではYPDを使用しています。各株のコロニーが形成されるまで、酵母を30 °Cで培養します。96深孔プレートの各ウェルに、YPD液体培地を1.2 mLずつ分注します。固体培地から液体培地へ細胞を移します。長方形ペトリ皿のプラスチック製の蓋でプレートを覆い、空気の循環を最小限に制限するようにテープで蓋を固定します。30 °Cのシェーカーを用いて220 RPMで一晩、細胞を培養します。翌日、1800X Gで5分間遠心分離を行います。培地を捨て、各ウェルに 500 µL の YPA を加えます。そして、ペレット化した細胞を再懸濁します。プレートをプラスチック製の蓋で覆い、テープで固定します。30 °Cに設定し、220 RPMで振盪するインキュベーター内で、細胞を15時間培養します。効率的な胞子形成に必要な適切な通気を確保するため、96ウェルプレートの各ウェルに、直径3 mmの滅菌済みガラスビーズを1個、または5 mm × 2 mmの滅菌済みマグネチックスターラーバーを1本加えます。すべての細胞が同一の遺伝子型である場合は、細胞と培地の混合液500 µLを96ウェルプレートの各ウェルに分注します。プレートをプラスチック製の蓋で覆い、テープで固定します。異なるジェノタイプ（遺伝子型）の細胞を用いる場合は、YPA培地中の細胞を1800X Gで5分間遠心分離し、培地を除去します。各ウェルに胞子形成培地を500 microliters加えます。そして、ペレット化した細胞を胞子形成培地で再懸濁します。プレートをプラスチック製の蓋で覆い、テープで固定します。ガラスビーズを使用する場合は、サンプルを30 °Cの振盪インキュベーターに入れ、220 RPMで振盪して胞子形成させます。撹拌子を使用する場合は、サンプルを撹拌機に載せ、30 °Cのインキュベーター内で胞子形成を行う。すべての撹拌子が活発に動き、培養液に十分な通気が行われていれば、撹拌子の正確な回転速度はそれほど重要ではない。36時間後、サンプルを回収し、胞子形成の進行状況を確認する。各胞子形成培養液から6 µLの細胞を分注し、96ウェルカバースリッププレート内の24 µLの胞子形成培地に加えます。倒立顕微鏡で観察する前に、細胞を5分間静置して沈降させます。倒立顕微鏡の63倍対物レンズを用いて可視化したこれらの細胞画像に、2つの異なる株の代表的な胞子形成を示します。野生型の培養液では、矢印で示される屈折性の四分子（tetrads）が観察されます。しかし、胞子形成不全のsmk1欠損細胞を含む培養液では観察されません。マルチウェルプレートで胞子形成させた細胞と、フラスコを用いてより大きな容量で胞子形成させた細胞の間で、胞子形成効率の比較を行いました。マルチウェルプレートの使用では、フラスコを用いたより一般的な胞子形成プロトコルで日常的に見られるような高い効率は得られませんでした。適切なエアレーションを伴うマルチウェルプレートでの胞子形成では、50%以上の十分な胞子形成効率を達成でき、5 mmのスターバーを使用した場合に最良の結果が得られました。しかし、小型スターバーはコストが高いため、ガラスビーズを使用して得られる効率もそれに匹敵します。5 mmと7 mmのどちらのスターバーも96穴マルチウェルプレートのウェルに収まりますが、7 mmのスターバーを使用すると胞子形成効率が低下しました。ウェル内の7 mmのスターバーは、隣接するウェルのスターバーと干渉しやすく、その結果、バーが適切に回転しなくなり、培養液への十分な通気が行われなくなります。このビデオを視聴することで、96ウェル形式の液体培養を用いて酵母細胞を効率的に胞子形成させる方法について十分に理解できるはずです。適切に行えば、このプロセスを習得することで6日間で完了させることができます。この手順は、さまざまな変異株、プラスミド、または低分子阻害剤が減数分裂および胞子形成に及ぼす影響をスクリーニングするために使用できます。この手法の開発後、Saccharomyces cerevisiaeにおける減数分裂細胞周期の調節、および胞子形成において細胞質分裂と減数分裂がどのように連動しているかを研究するために用いられました。

efficient-sporulation-saccharomyces-cerevisiae-96-multiwell

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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学ぶ Saccharomyces cerevisiae の96ウェルプレートを用いた効率的な胞子形成法。最適な通気条件により高スループットスクリーニングを可能にし、遺伝子ライブラリーの解析に応用できます。

の効率的な胞子形成

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