ザショウジョウバエ成虫盤腫瘍モデル：遺伝的モザイクを用いた遺伝子発現と腫瘍侵襲性の可視化と定量化

このプロトコルの全体的な目標は、遺伝的に定義された蛍光標識付きクローンを運ぶショウジョウバエの眼触角の想像椎間板と脳を解剖する方法と、それらを処理して遺伝子発現の変化と細胞の侵襲性を視覚化および定量化する方法を実証することです。記載されている手順は、遺伝子と上皮の発達、恒常性、または疾患の役割に関する新たな洞察を提供し、それらの競争、代償的増殖、またはクローン間結合の根底にあるメカニズムを解剖するのに役立ちます。この研究の主な利点は、ショウジョウバエの遺伝子モザイクの詳細な定量的および定性的な分析のために調整されたプロトコル全体を提供することです。

一般に、ショウジョウバエモデルを初めて使用する個人は、他の仮想ディスクから目の触角の虚系ディスクを認識できないため、苦労します。幼虫の体内の蛍光マーク付きクローンを持つ眼触角想像円板の認識を容易にするために、蛍光顕微鏡下で最初の解剖を行うことをお勧めします。抑制性細胞マーカーまたはMARCMを用いたモザイク解析により、表現型的に野生型の状況で遺伝的に定義されたクローンパッチの生成が可能になります。

アイレスプロモーターによって駆動されるFLPは、黄色の遺伝子でマークされたストップカセットに隣接する2つのFRT要素間の組換えを触媒します。DNA複製後、FLPは相同染色体間の非姉妹染色分体の交換を触媒し、姉妹染色分体を生成します。1つは野生型対立遺伝子とGal80リプレッサーを運び、もう1つは突然変異体を持っています。

有糸分裂では、これらは分離して2つの娘細胞を生成し、1つはホモ接合型変異体であり、もう1つは野生型です。Gal80リプレッサーの喪失により、変異体でのGFP発現が可能になりますが、野生型細胞はGFP陰性のままです。実験を開始するには、PBSをフライボトルに噴射して食品の表面を覆うことにより、モザイク幼虫を収穫します。

次に、ヘラで最上層を柔らかくし、幼虫を含む食品スラリーをペトリ皿に注ぎます。幼虫をそっと摘み取り、PBSで満たされた胚皿に移します。免疫染色のために少なくとも20匹の幼虫を採取し、腫瘍の浸潤性の定量化のために80匹の幼虫を採取します。

幼虫をPBSで洗って、残っている食物をすべて取り除きます。蛍光実体顕微鏡を8:16倍の倍率で使用して、全身にランダムなGFP陽性スポットを示すヒョウの幼虫をすべて特定して廃棄します。PBSに残った幼虫が入った皿を氷の上に置いて解剖します。

実体顕微鏡で眼触角の想像椎間板を解剖するには、1対の鉗子を使用し、頭の後方の体長の約2/3で幼虫をそっとつかみます。2組目の鉗子で、幼虫の口のフックをつかみ、体から引き離します。鉗子を使用して、重なり合うキューティクルや唾液腺や脂肪体などの外部組織から口のフックを解き

あるいは、腹側神経索を無傷に保ちながら眼触角椎間板脳複合体を準備するには、鉗子を使用して体の中央で幼虫を切断します。後半分を捨てます。1対の鉗子の先端で幼虫の体の前半分を保持し、次に2番目のペアの先端で口のフックを内側に押し、最初の鉗子のペアでキューティクルを転がして、幼虫を裏返しにします。

腸、脂肪体、唾液腺を含むすべての無関係な組織を慎重に取り除きます。口のフックをキューティクルからそっと引き離します。腹側神経索から筋肉や表皮に伸びる軸索突起を切断することにより、口のフックに取り付けられた眼-触角椎間板脳複合体を解放します。

組織を移すには、まずP20マイクロピペットチップに残りの死体を数回上下にピペッティングしてコーティングし、次に同じチップを使用して解剖した組織を移します。より大きな眼と触角の椎間板脳複合体を移植するには、P20の先端を事前にカットして開口部を拡大します。400μLの4%PFA固定液にサンプルを室温で25分間固定します。

次に、固定液を取り出し、サンプルをPBSTで3回、10分間、章動で洗浄します。次に、PBSTを500マイクロリットルのDAPI染色液と交換し、暗闇で15分間ヌタテーします。ティッシュペーパーをPBSTで10分間1回洗浄します。

解剖を完了するには、1ミリリットルのピペットを使用して、組織をPBS充填ガラス皿に戻します。2対の鉗子を使用して、視神経茎を切断することにより、侵襲性の定量化に使用される脳を眼触角椎間板から分離します。目の触角ディスクをマウスフックからクリップして解放します。

アブダクティブスライド上に封入剤を一滴垂らし、鉗子を用いて液体を薄い層に分散させます。侵襲性を定量化するには、各遺伝子型に対して少なくとも80個の固定された無傷の脳を1枚のスライド上に配置します。必要に応じて組織をまっすぐにして配置します。

カバースリップの一方の端を媒体にそっと触れ、泡が発生しないように鉗子を使用してゆっくりと下げます。ラボ用ワイプを使用して、端の余分な封入剤を吸収します。これで、共焦点イメージングを使用して組織を検査できます。

中立的な当事者にスライドを匿名化してもらい、スコアリングが偏りなく行われるようにします。また、スライドは少なくとも2人の研究者が独立して評価しています。遺伝子型は、スコアリングが完了した後にのみ開示してください。

GFPフィルターセットを装備した蛍光実体顕微鏡で悪性度を評価します。マーカーを使用して、すでに表示されている頭脳にラベルを付けて、二重カウントを回避します。蛍光共焦点画像は、DAPIで染色された悪性RAS V12落書き変異体GFP標識クローン腫瘍を有する幼虫から解剖された脳を示しています。

パネルは、腫瘍の浸潤性の4つの異なるグレードを表しています。偏りのない定量により、JNKシグナル伝達の阻害とRAS V12の走り書き1つのクローンが腫瘍の浸潤性を抑制することが明らかになりました。コントロールアイアンテナディスクでは、JNK感度のTRE-DsREDレポーターは、触角からアイパーツまで走る細い細胞のストライプのみをラベル付けします。

対照的に、TRE-DsRED活性はGFP陽性の悪性クローン腫瘍で顕著に増強されました。8日目までに、腫瘍細胞は眼触角椎間板を過成長させ、腹側神経索に拡がった。浸潤した腫瘍細胞は、周囲の組織と比較してJNK活性化の増加も示しました。

JNKを阻害すると腫瘍クローンのTRE-DsRED活性が明らかに低下しましたが、レーザー強度を上げるとクローンに隣接する上皮細胞の増強が明らかになりました。さらに、ヘモレクチンデルタDsREDレポーターは、対照の眼触角上皮のくぼみに見られるいくつかの血球クラスターとは対照的に、悪性腫瘍で構成される眼触角および脳組織に蓄積した血球であることを示しました。JNKを阻害すると、関連する免疫細胞の数が劇的に減少しました。

腫瘍の浸潤性、JNK活性、および血球浸潤の増強は、解剖されたモザイク眼触角椎間板から単離された全RNAを用いたQRTPCRによって決定されるMMP1 mNRAの有意なアップレギュレーションを伴った。一度マスターすると、60以上の眼椎間板ペアと脳を30分以内に解剖することができます。この手順を試行する際には、目的の遺伝子型の幼虫を十分な数生成することを覚えておくことが重要です。

RNA単離RNSを目的としたサンプルをフリーに保つために、解剖中は迅速かつ正確に行ってください。解剖手順に続いて、ウェスタンブロットを免疫染色の代替として使用して、異なる遺伝子型間のタンパク質発現の変化を評価することができます。遺伝子モザイクを作成し、説明された手順でそれらを分析することで、致命的な突然変異や癌遺伝子企業のメカニズムに関する研究が可能になり、このビデオを見た後、3番目の幼虫から眼触角椎間板と脳のモザイク組織を解剖する方法と、免疫染色、トランスジェニックおよびポート活性の視覚化のためにそれらを処理する方法についてよく理解する必要があります。 RNA抽出、および侵襲性の定量化。

PFA、フェノールクロロホルム、DAPIは非常に毒性が高いため、これらの薬剤を取り扱う際には、保護手袋や衣服の着用などの予防措置を常に講じる必要があることに注意してください。