Name: 出芽酵母におけるエンドサイトーシスの定量的、動力学的およびハイスループット分析のためのpHluorinの応用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: 学ぶ出芽酵母におけるエンドサイトーシスの定量的解析法。pHluorinを用いた蛍光顕微鏡とフローサイトメトリーにより、タンパク質変異や発現変化が小胞輸送効率に与える影響を直接定量化する手法です。

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この研究で試薬を生成するために使用したpHluorin cDNAを共有してくださったGero Miesenböck氏とTim Ryan氏、優れた技術支援を提供してくださったNathan Wright氏、Joanna Poprawski氏、Lydia Nyasae氏、有益な議論を提供してくださったWendland研究室のメンバー、そして顕微鏡検査とフローサイトメトリーに関するアドバイスと支援を提供してくださったIntegrated Imaging Center（ジョンズ・ホプキンス大学のMichael McCaffery氏とErin Pryce氏に感謝します。この研究は、国立衛生研究所(GM60979)および国立科学財団(B.W.、MCB 1024818)からの助成金によって支援されました。K.W.は、国立衛生研究所(National Institutes of Health)からの研修助成金(T32-GM007231)によって部分的に支援されました。AFOは、デュケイン大学の生物科学部と全米科学財団のキャリア助成金553143からの開発資金によって支援されました。

<ol><li>Kaksonen, M., Sun, Y., Drubin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pathway+for+association+of+receptors%2C+adaptors%2C+and+actin+during+endocytic+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A pathway for association of receptors, adaptors, and actin during endocytic internalization.</a> Cell. 115 (4), 475-487 (2003).</li>
<li>Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+design+for+the+clathrin-+and+actin-mediated+endocytosis+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A modular design for the clathrin- and actin-mediated endocytosis machinery.</a> Cell. 123 (2), 305-320 (2005).</li>
<li>Boettner, D. R., Chi, R. J., Lemmon, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+yeast+for+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lessons from yeast for clathrin-mediated endocytosis.</a> Nat Cell Biol. 14 (1), 2-10 (2012).</li>
<li>Taylor, M. J., Perrais, D., Merrifield, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+High+Precision+Survey+of+the+Molecular+Dynamics+of+Mammalian+Clathrin-Mediated+Endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A High Precision Survey of the Molecular Dynamics of Mammalian Clathrin-Mediated Endocytosis.</a> PLoS Biol. 9 (3), e1000604(2011).</li>
<li>Hansen, C. G., Nichols, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+clathrin-independent+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of clathrin-independent endocytosis.</a> J Cell Sci. 122 (11), 1713-1721 (2009).</li>
<li>Sabharanjak, S., Sharma, P., Parton, R. G., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPI-anchored+proteins+are+delivered+to+recycling+endosomes+via+a+distinct+cdc42-regulated%2C+clathrin-independent+pinocytic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">GPI-anchored proteins are delivered to recycling endosomes via a distinct cdc42-regulated, clathrin-independent pinocytic pathway.</a> Dev Cell. 2 (4), 411-423 (2002).</li>
<li>Radhakrishna, H., Klausner, R. D., Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aluminum+fluoride+stimulates+surface+protrusions+in+cells+overexpressing+the+ARF6+GTPase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Aluminum fluoride stimulates surface protrusions in cells overexpressing the ARF6 GTPase.</a> J Cell Biol. 134 (4), 935-947 (1996).</li>
<li>Prosser, D. C., Drivas, T. G., Maldonado-Báez, L., Wendland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Existence+of+a+novel+clathrin-independent+endocytic+pathway+in+yeast+that+depends+on+Rho1+and+formin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Existence of a novel clathrin-independent endocytic pathway in yeast that depends on Rho1 and formin.</a> J Cell Biol. 195 (4), 657-671 (2011).</li>
<li>Prosser, D. C., Wendland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+roles+for+yeast+Rho1+and+mammalian+RhoA+GTPases+in+clathrin-independent+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Small+GTPases%22%5BJournal%5D)">Conserved roles for yeast Rho1 and mammalian RhoA GTPases in clathrin-independent endocytosis.</a> Small GTPases. 3 (4), 229-235 (2012).</li>
<li>Kohno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bni1p+implicated+in+cytoskeletal+control+is+a+putative+target+of+Rho1p+small+GTP+binding+protein+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Bni1p implicated in cytoskeletal control is a putative target of Rho1p small GTP binding protein in Saccharomyces cerevisiae.</a> EMBO J. 15 (22), 6060-6068 (1996).</li>
<li>Evangelista, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Yeast+Formin+Linking+Cdc42p+and+the+Actin+Cytoskeleton+During+Polarized+Morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">a Yeast Formin Linking Cdc42p and the Actin Cytoskeleton During Polarized Morphogenesis.</a> Science. 276 (5309), 118-122 (1997).</li>
<li>Kübler, E., Riezman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+and+fimbrin+are+required+for+the+internalization+step+of+endocytosis+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Actin and fimbrin are required for the internalization step of endocytosis in yeast.</a> EMBO J. 12 (7), 2855-2862 (1993).</li>
<li>Lin, C. H., MacGurn, J. A., Chu, T., Stefan, C. J., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrestin-Related+Ubiquitin-Ligase+Adaptors+Regulate+Endocytosis+and+Protein+Turnover+at+the+Cell+Surface%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Arrestin-Related Ubiquitin-Ligase Adaptors Regulate Endocytosis and Protein Turnover at the Cell Surface.</a> Cell. 135 (4), 714-725 (2008).</li>
<li>Nikko, E., Sullivan, J. A., Pelham, H. R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrestin-like+proteins+mediate+ubiquitination+and+endocytosis+of+the+yeast+metal+transporter+Smf1%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Arrestin-like proteins mediate ubiquitination and endocytosis of the yeast metal transporter Smf1.</a> EMBO Rep. 9 (12), 1216-1221 (2008).</li>
<li>Nikko, E., Pelham, H. R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrestin-Mediated+Endocytosis+of+Yeast+Plasma+Membrane+Transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Arrestin-Mediated Endocytosis of Yeast Plasma Membrane Transporters.</a> Traffic. 10 (12), 1856-1867 (2009).</li>
<li>O'Donnell, A. F., McCartney, R. R., Chandrashekarappa, D. G., Zhang, B. B., Thorner, J., Schmidt, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2-Deoxyglucose+impairs+Saccharomyces+cerevisiae+growth+by+stimulating+Snf1-regulated+and+%CE%B1-arrestin-mediated+trafficking+of+hexose+transporters+1+and+3%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">2-Deoxyglucose impairs Saccharomyces cerevisiae growth by stimulating Snf1-regulated and α-arrestin-mediated trafficking of hexose transporters 1 and 3.</a> Mol Cell Biol. 35 (6), 939-955 (2015).</li>
<li>O'Donnell, A. F., Huang, L., Thorner, J., Cyert, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+calcineurin-dependent+switch+controls+the+trafficking+function+of+%CE%B1-arrestin+Aly1%2FArt6%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A calcineurin-dependent switch controls the trafficking function of α-arrestin Aly1/Art6.</a> J Biol Chem. 288 (33), 24063-24080 (2013).</li>
<li>Prosser, D. C., Pannunzio, A. E., Brodsky, J. L., Thorner, J., Wendland, B., O'Donnell, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1-Arrestins+participate+in+cargo+selection+for+both+clathrin-independent+and+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">α-Arrestins participate in cargo selection for both clathrin-independent and clathrin-mediated endocytosis.</a> J Cell Sci. 128 (22), 4220-4234 (2015).</li>
<li>Lamaze, C., Dujeancourt, A., Baba, T., Lo, C. G., Benmerah, A., Dautry-Varsat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+2+receptors+and+detergent-resistant+membrane+domains+define+a+clathrin-independent+endocytic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Interleukin 2 receptors and detergent-resistant membrane domains define a clathrin-independent endocytic pathway.</a> Mol Cell. 7 (3), 661-671 (2001).</li>
<li>Prosser, D. C., Whitworth, K., Wendland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+endocytosis+with+cytoplasmic+pHluorin+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of endocytosis with cytoplasmic pHluorin chimeras.</a> Traffic. 11 (9), 1141-1150 (2010).</li>
<li>Bokman, S. H., Ward, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renaturation+of+green-fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Renaturation of green-fluorescent protein.</a> Biochem Biophys Res Commun. 101 (4), 1372-1380 (1981).</li>
<li>Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Use+of+pHluorins+for+Optical+Measurements+of+Presynaptic+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The Use of pHluorins for Optical Measurements of Presynaptic Activity.</a> Biophys J. 79 (4), 2199-2208 (2000).</li>
<li>Katzmann, D. J., Babst, M., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-dependent+sorting+into+the+multivesicular+body+pathway+requires+the+function+of+a+conserved+endosomal+protein+sorting+complex%5BTitle%5D)+AND+%22ESCRT-I.+Cell%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-dependent sorting into the multivesicular body pathway requires the function of a conserved endosomal protein sorting complex.</a> ESCRT-I. Cell. 106 (2), 145-155 (2001).</li>
<li>Longtine, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Additional+modules+for+versatile+and+economical+PCR-based+gene+deletion+and+modification+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).</li>
<li>Goldstein, A. L., McCusker, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+new+dominant+drug+resistance+cassettes+for+gene+disruption+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Three new dominant drug resistance cassettes for gene disruption in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 15 (14), 1541-1553 (1999).</li>
<li>Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAusubel%2C+FM+%22Curr+Prot+Mol+Biol%22">Curr Prot Mol Biol</a>. , John Wiley & Sons. New York. (1991).</li>
<li>Urbanowski, J. L., Piper, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+sorts+proteins+into+the+intralumenal+degradative+compartment+of+the+late-endosome%2Fvacuole%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin sorts proteins into the intralumenal degradative compartment of the late-endosome/vacuole.</a> Traffic. 2 (9), 622-630 (2001).</li>
<li>Newpher, T. M., Smith, R. P., Lemmon, V., Lemmon, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Dynamics+of+Clathrin+and+Its+Adaptor-Dependent+Recruitment+to+the+Actin-Based+Endocytic+Machinery+in+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">In Vivo Dynamics of Clathrin and Its Adaptor-Dependent Recruitment to the Actin-Based Endocytic Machinery in Yeast.</a> Dev Cell. 9 (1), 87-98 (2005).</li>
<li>Maldonado-Báez, L., Dores, M. R., Perkins, E. M., Drivas, T. G., Hicke, L., Wendland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+Epsin%2FYap180+adaptors+and+the+scaffolds+Ede1%2FPan1+is+required+for+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Interaction between Epsin/Yap180 adaptors and the scaffolds Ede1/Pan1 is required for endocytosis.</a> Mol Biol Cell. 19 (7), 2936-2948 (2008).</li>
<li>Aguilar, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epsin+N-terminal+homology+domains+perform+an+essential+function+regulating+Cdc42+through+binding+Cdc42+GTPase-activating+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Epsin N-terminal homology domains perform an essential function regulating Cdc42 through binding Cdc42 GTPase-activating proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (11), 4116-4121 (2006).</li>
<li>Isnard, A. D., Thomas, D., Surdin-Kerjan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+study+of+methionine+uptake+in+Saccharomyces+cerevisiae+reveals+a+new+family+of+amino+acid+permeases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The study of methionine uptake in Saccharomyces cerevisiae reveals a new family of amino acid permeases.</a> J Mol Biol. 262 (4), 473-484 (1996).</li>
<li>Wendland, B., McCaffery, J. M., Xiao, Q., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+fluorescence-activated+cell+sorter-based+screen+for+yeast+endocytosis+mutants+identifies+a+yeast+homologue+of+mammalian+eps15%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel fluorescence-activated cell sorter-based screen for yeast endocytosis mutants identifies a yeast homologue of mammalian eps15.</a> J Cell Biol. 135 (6), 1485-1500 (1996).</li>
<li>Alvaro, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+Alpha-Arrestins+Negatively+Regulate+Saccharomyces+cerevisiae+Pheromone+Response+by+Down-Modulating+the+G-Protein-Coupled+Receptor+Ste2%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Specific Alpha-Arrestins Negatively Regulate Saccharomyces cerevisiae Pheromone Response by Down-Modulating the G-Protein-Coupled Receptor Ste2.</a> Mol Cell Biol. 34 (14), 2660-2681 (2014).</li>
<li>Ghaddar, K., Merhi, A., Saliba, E., Krammer, E. M., Prevost, M., Andre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate-Induced+Ubiquitylation+and+Endocytosis+of+Yeast+Amino+Acid+Permeases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Substrate-Induced Ubiquitylation and Endocytosis of Yeast Amino Acid Permeases.</a> Mol Cell Biol. 34 (24), 4447-4463 (2014).</li>
<li>Becuwe, M., Léon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+control+of+transporter+endocytosis+and+recycling+by+the+arrestin-related+protein+Rod1+and+the+ubiquitin+ligase+Rsp5%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Integrated control of transporter endocytosis and recycling by the arrestin-related protein Rod1 and the ubiquitin ligase Rsp5.</a> eLife. 3, (2014).</li>
<li>Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Zhao, Y., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Endosomal+Sorting+Complex+ESCRT-II+Mediates+the+Assembly+and+Architecture+of+ESCRT-III+Helices%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Endosomal Sorting Complex ESCRT-II Mediates the Assembly and Architecture of ESCRT-III Helices.</a> Cell. 151 (2), 356-371 (2012).</li>
<li>Nickerson, D. P., Russell, M. R. G., Lo, S. -Y., Chapin, H. C., Milnes, J. M., Merz, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Termination+of+Isoform-Selective+Vps21%2FRab5+Signaling+at+Endolysosomal+Organelles+by+Msb3%2FGyp3%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Termination of Isoform-Selective Vps21/Rab5 Signaling at Endolysosomal Organelles by Msb3/Gyp3.</a> Traffic. 13 (10), 1411-1428 (2012).</li>
<li>Nickerson, D. P., Merz, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LUCID%3A+A+Quantitative+Assay+of+ESCRT-Mediated+Cargo+Sorting+into+Multivesicular+Bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">LUCID: A Quantitative Assay of ESCRT-Mediated Cargo Sorting into Multivesicular Bodies.</a> Traffic. 16 (12), 1318-1329 (2015).</li>
<li>Dulic, V., Egerton, M., Elguindi, I., Raths, S., Singer, B., Riezman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+endocytosis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Yeast endocytosis assays.</a> Methods Enzymol. 194, 697-710 (1991).</li>
<li>Silve, S., Volland, C., Garnier, C., Jund, R., Chevallier, M. R., Haguenauer-Tsapis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+insertion+of+uracil+permease%2C+a+polytopic+yeast+plasma+membrane+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane insertion of uracil permease, a polytopic yeast plasma membrane protein.</a> Mol Cell Biol. 11 (2), 1114-1124 (1991).</li>
<li>Miliaras, N. B., Park, J. -H., Wendland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Function+of+the+Endocytic+Scaffold+Protein+Pan1p+Depends+on+Multiple+Domains%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The Function of the Endocytic Scaffold Protein Pan1p Depends on Multiple Domains.</a> Traffic. 5 (12), 963-978 (2004).</li>
<li>Vida, T. A., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+vital+stain+for+visualizing+vacuolar+membrane+dynamics+and+endocytosis+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast.</a> J Cell Biol. 128 (5), 779-792 (1995).</li>
<li>Toshima, J. Y., Toshima, J., Kaksonen, M., Martin, A. C., King, D. S., Drubin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+dynamics+of+receptor-mediated+endocytic+trafficking+in+budding+yeast+revealed+by+using+fluorescent+alpha-factor+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Spatial dynamics of receptor-mediated endocytic trafficking in budding yeast revealed by using fluorescent alpha-factor derivatives.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (15), 5793-5798 (2006).</li>
</ol>

著者らは、競合する利益はないと宣言している。

酵母細胞におけるエンドサイトーシスイベントの定量化のためのpHluorinのアプリケーションは、蛍光タグは、タンパク質（ 図1A）の細胞質尾部に融合された貫通貨物を利用します。ここに記載のアッセイのために、貨物はpHluorinタグがニュートラルな環境にさらされたときに明るく蛍光であるが、pHluorinタグは酸性条件に遭遇したときに急冷になります。したがって、pHluorinタグ付きエンドサイトーシス貨物は容易に形質膜の細胞質面で、早期エンドソーム上で検出されたが、管腔MVB小胞または液胞の内腔への配送時に組み込まれた場合、「暗く」となります。一般的には、新たに合成されたエンドサイトーシス貨物は、おそらく、小胞体（ER）のままとGFPとその変異体の多くは完全に成熟する前に、原形質膜に達します。 ERまたはゴルジからの出口が私でない限り、このように、まだ細胞表面に達していないpHluorinタグ付き貨物は検出不可能なままであると予測されますmpaired。 このようなSTE3とMup1などpHluorinタグ付きエンドサイトーシス貨物の使用は、酵母...

小胞輸送は、真核細胞内小器官の同一性および機能を維持する上で重要な役割を果たし、個々の細胞区画のタンパク質および膜組成を調節するための重要なメカニズムです。エンドサイトーシスを介して生成された小胞は、その後のリサイクルまたはリソソームに標的化するための表面から膜およびタンパク質を除去に対し、原形質膜で、エキソサイトーシス小胞の融合は、細胞の表面に新たなタンパク質や膜を実現します。このように、エンドサイトーシスは、栄養摂取のためおよび細胞外環境への応答のために重要です。エキソサイトーシスおよびエンドサイトーシスは、形質膜の表面積を調節するため、および損傷を受けたタンパク質の代謝回転を可能にするようにバランスされています。 酵母および哺乳動物細胞での研究には、専用の様々なことに応答して、エンドサイトーシスに関与するタンパク質の大規模な数、ならびに特定の貨物の内在化を促進する複数のエンドサイトーシス経路またはその行為を同定していますvironmental条件。最もよく研​​究経路は、クラスリンおよびサイトゾルアクセサリータンパク質は、発生期のエンドサイトーシス小胞を安定化させるためにコート構造に集合したクラスリン依存性エンドサイトーシス（CME）、です。出芽酵母サッカロマイセス・セレビシエにおける実験は、力学と多くのエンドサイトーシスタンパク質1-3のための募集のために重要な洞察が得られています。特に、CMEの機械は非常に進化の過程で保存されているような酵母におけるCME関連タンパク質の大部分は人間のオルソログを持っていること。このように、出芽酵母は、高等真核生物に保存されているエンドサイトーシスのメカニズムを理解するための重要なツールとなっています。例えば、出芽酵母を用いた研究では、追加のエンドサイトーシスのアクセサリーの動員に続いて、CME構造（酵母における皮質アクチンパッチと呼ばれる）の形成と成熟がクラスリンと貨物結合アダプタータンパク質で始まる、多くのタンパク質の順次募集を伴う決定しましたタンパク質、ARP2 / 3媒介アクチン重合の活性化、および小胞の切断の1,2に関与するタンパク質の動員。皮質アクチンパッチにCME機械タンパク質の募集は、高度に秩序とステレオタイプのプロセスであり、多くのタンパク質のための募集の正確な順序は、CMEの機械の他の構成要素に関して確立されています。重要なことは、最近の研究では、哺乳動物細胞4でクラスリン被覆ピットでのCMEのタンパク質のための募集の同様の順序を確認しています。 CMEに加えて、多くの細胞型は、原形質膜5-7の小胞形成および内在化を促進するための代替メカニズムに頼る一つ以上のクラスリン非依存性エンドサイトーシス（CIE）の経路を有します。酵母では、我々は最近、低分子量GTPase Rho1とその活性化グアニンヌクレオチド交換因子（GEF）、ROM1 8,9を利用CIE経路を同定しました。 Rho1は、アクチン重合1を促進するためにformin Bni1を活性化させます酵母12でクラスリン非依存性エンドサイトーシスは、このフォームに必要とされる0,11、。また、タンパク質のα-アレスチンファミリーは、CME 13-17を通じて貨物のユビキチン化およびその後の内在化を促進し、またおそらくCIE 18に関与するタンパク質との直接的な相互作用を介して、CIE経路を介して貨物の内在化を促進するために、ユビキチンリガーゼRSP5を募集します。 CIE経路の様々なもRho1オルソログ、RhoAの9,19に依存しているクラスリン依存せず、食作用経路を含めた哺乳動物細胞、中に存在します。哺乳類CIEにおけるRhoAの役割は十分に理解されていません。従って、出芽酵母での研究は、哺乳類のCIEに適用可能な追加の機械的な洞察を提供してもよいです。 エンドサイトーシス事象の正確な定量は、エンドサイトーシスを調節する特定のタンパク質の役割に関する重要な情報を提供することができ、および貨物の内在またはprogressio上の変異の影響を明らかにすることができますエンドサイトーシス経路を介して、n個。この目的のために、生化学的方法は、リガンドの取り込みを監視するために、またはエンドサイトーシス積荷タンパク質の分解の速度を測定するために利用することができます。生細胞において、関心対象の貨物に緑色蛍光タンパク質（GFP）及びその変異体の融合は、貨物輸送の直接可視化を可能にします。 GFPは、（酵母または液胞）リソソームでの分解に耐性があるのでしかし、GFPタグ貨物は、エンドサイトーシスの定量化のための使用が制限されています。また、GFP蛍光は、pHの変化に部分的にのみ敏感であり、液胞ルーメン20,21内で検出可能なままです。その結果、GFPタグの蛍光は、貨物の残りの部分が劣化したずっと後に液胞に固執し、貨物の強度の全細胞ベースの定量化が原因液胞の長期的なGFP蛍光に不正確になることがあります。 液胞GFP蛍光の欠点を克服するために、我々は、以前にsuperecliptic pHを使用しましたluorin、中性pHで明るく蛍光を発するが、そのようなリソソーム液胞/ 20,22,23の内腔などの酸性環境下で蛍光を失うGFPのpH感受性変異体です。エンドサイトーシス貨物の細胞質尾部にpHluorinタグを配置することは、原形質膜でとpHluorinタグが細胞質（ 図1A）に露出したまま初期エンドソーム、上の荷物の可視化を可能にします。初期エンドソームが成熟するにつれ、エンドソームは、多胞体（MVBs）24を生成し 、エンドソームの内腔に出芽小胞への輸送のために必要な複雑な（ESCRT）機械パッケージ表面局在貨物を仕分け。内部MVB小胞に組み込まれている貨物については、pHluorinタグは小胞内腔に向いています。内部MVB小胞が酸性化されています。彼らはMVBs 20に成熟としてこのように、pHluorinタグ付きカーゴは、初期エンドソームの蛍光を失います。液胞とMVBのその後の融合は、MVB腔の内容を提供します分解のために、とpHluorinタグは液胞内腔の酸性環境中で急冷したまま。 本稿では、酵母における細胞質pHluorinタグで貨物を用いた定量的エンドサイトーシスアッセイの詳細な説明を提供します。 pHluorinタグ貨物を発現する株は、特定の貨物の性質および輸送の挙動に応じて、運動及び/又はエンドポイントアッセイに使用することができます。さらに、いくつかのpHluorinタグ貨物は、フローサイトメトリーなどのハイスループット分析法に適しています。重要なことは、pHluorinタグは、野生型と変異株におけるエンドサイトーシス機能のエンドサイトーシスとの比較の定量化を可能にする、生きた細胞内のエンドサイトーシス事象を研究するための汎用性の高いツールです。

<table><tbody><tr><td>アデニン</td><td>シグマ</td><td>A8626-25G</td><td>アミノ酸混合物および原液の調製に使用</td></tr><tr><td>バクト寒天</td><td>フィ</td><td>ッシャーBP1423-2</td><td>プレートメディアの調製に使用</td></tr><tr><td>BD Difco 酵母 窒素塩基(アミノ酸なし)</td><td>BD</td><td>291920</td><td>液体およびプレートメディアの調製に使用</td></tr><tr><td>コンカナバリンA</td><td>Σ</td><td>C5275-5MG</td><td>チャンバーのコーティングに使用スライド</td></tr><tr><td>デキストロー</td><td>ス フィッシャー</td><td>BP350-1</td><td>液体およびプレート媒体の調製に使用</td></tr><tr><td>L-ヒスチジン</td><td>フィッシャー</td><td>BP382-100</td><td>アミノ酸混合物および原液の調製に使用</td></tr><tr><td>L-ロイシン</td><td>アクロス</td><td>125121000</td><td>アミノ酸混合物および原液の調製に使用</td></tr><tr><td>L-リジン</td><td>フィッシャー</td><td>BP386-100</td><td>アミノ酸混合物および原液の調製に使用</td></tr><tr><td>L-メチオニン</td><td>フィッシャー</td><td>BP388-100</td><td>アミノ酸混合物および原液の調製に使用</td></tr><tr><td>L-トリプトファン</td><td>フィッシャー</td><td>BP395-100</td><td>アミノ酸混合物および原液の調製に使用</td></tr><tr><td>L-チロシン</td><td>アクロス</td><td>140641000</td><td>アミノ酸混合物の調製に使用</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek チャンバーカバーガラス (8ウェル)</td><td>Thermo Scientific</td><td>155411</td><td>Mup1-pHluorinの内在化の動力学およびエンドポイントアッセイに使用</td></tr><tr><td>ウラシル</td><td>シグマ</td><td>U0750-100G</td><td>アミノ酸混合物およびストック溶液の調製に使用</td></tr><tr><td>Axiovert 200倒立顕微鏡</td><td>カールツァイス</td><td>カスタムビルド</td><td></td></tr><tr><td>100X/1.4 プランアポクロマート油浸対物レンズ</td><td>カールツァイス</td><td></td><td>対物レンズは100倍にする必要があります、1.4NA以上</td></tr><tr><td>Sensicam</td><td>Cooke Corporation</td><td></td><td>カメラは12ビット以上のダイナミックレンジを持つ必要があります</td></tr><tr><td>X-Cite 120PC Q 照明源</td><td>Excelitas Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slidebook 5 ソフトウェア</td><td>Intelligent Imaging Innovations</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ ソフトウェア</td><td>国立衛生</td><td></td>研究所 <td>http://imagej.nih.gov/ij/</td></tr></tbody></table>

出芽酵母におけるエンドサイトーシスの定量的、動力学的およびハイスループット分析のためのphluorinの応用

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

緑色蛍光タンパク質（GFP）およびその変異体は、広くタンパク質の局在や、細胞骨格の再構築と生きた細胞内小胞輸送などのイベントのダイナミクスを研究するためのツールを使用しています。キメラGFP融合物を用いた定量方法は、多くの用途のために開発されています。しかし、GFPは、タンパク質分解に対して多少耐性があるので、その蛍光は、エンドサイトーシス経路に貨物輸送の定量化を妨げる可能性がリソソーム/液胞に持続します。エンドサイトーシスとエンドサイトーシス後の人身売買のイベントを定量化するための別の方法はsuperecliptic pHluorin、酸性環境中で急冷されるGFPのpH感受性の変異体を使用しています。多胞体（MVBs）およびリソソーム/液胞の内腔への配信への貨物の取り込み時に蛍光の減衰における膜貫通貨物タンパク質結果の細胞質尾部にpHluorinのキメラ融合。このように、液胞蛍光の消光はquantifiを容易にエンドサイトーシスとエンドサイトーシス経路における初期の事象のカチオン。本稿では、フローサイトメトリーを用いて、蛍光顕微鏡を介したエンドサイトーシスの定量化のためのpHluorinタグ付き貨物だけでなく、集団ベースのアッセイを使用する方法について説明します。

構成的に内在化エンドサイトーシス貨物タンパク質STE3の定常状態の局在化および定量化 生きている細胞、STE3、酵母におけるA因子フェロモン受容体の細胞質C末端テイルを有するキメラGFPとpHluorin融合の局在化pHluorinタグ貨物はエンドサイトーシスの定量化のために利用できることを実証するために、比較しました。 STE3は、構成的分解28液胞に、原形質膜に輸送内在化、および標的化されるGタンパク質共役受容体（GPCR）です。 STE3-GFP（ 図2A）を発現する野生型（WT）細胞に見られるようにこのように、定常状態の条件下で、STE3の大部分は、液胞の内腔に局在します。これとは対照的に、4クラスリン結合アダプタータンパク質ENT1、ENT2、Yap1801とYap1802をコードする遺伝子を欠く細胞（ENT1...

特定のタンパク質の役割や突然変異の影響について、しばしば重要な洞察を得ることができます。この論文では、定量的蛍光顕微鏡法とフローサイトメトリーを使用して、生細胞のエンドサイトーシスイベントを定量化するためのツールとして、pH感受性GFPバリアントである超黄道pHluorinを使用する方法を示します。

出芽酵母におけるエンドサイトーシスの定量的、動力学的およびハイスループット分析のためのpHluorinの応用

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

この手順の全体的な目的は、生細胞のエンドサイトーシス経路における小胞輸送イベントを定量化することです。この手法は、タンパク質の変異や発現量の変化が輸送イベントの速度や効率にどのように影響するかなど、小胞輸送分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、蛍光タグを付けたカーゴタンパク質の強度を測定することにより、生細胞におけるエンドサイトーシス輸送を直接定量化できることです。テキストのプロトコルに従って溶液と培地を調製した後、プラスミド選択を維持するための追加栄養素を含まない5 mLのYNB培地に、2〜3個の酵母細胞コロニーを接種します。培養液を30 °Cで振盪しながら16〜24時間培養します。イメージングの約3時間前に、各オーバーナイト培養液のOD 600を測定します。次に、プラスミド維持に必要な追加栄養素を含まないYNB培地を用いて、OD 600が0.35から0.4となるように5 mLの希釈液を調製し、30 °Cで振盪しながら3時間培養します。培養中に、顕微鏡のエンバイロメンタルチャンバーまたは加熱ステージを30 °Cに予熱して平衡化させます。テキストのプロトコルに従って、処理済みの8ウェルガラスポットとイメージング用のチャンバースライドを準備した後、プラスミド選択用の追加栄養素を含まないYNB培地を各ウェルに200 µLずつ加えます。培養が完了したら、1 mLをマイクロフリッジチューブに移し、8,000 RPMで2分間遠心分離して細胞をペレット化します。次に、上清を975 µL除去します。残った上清で細胞ペレットを再懸濁します。次に、細胞懸濁液 2.5 µLを8ウェルプレートの各ウェルの中心に滴下します。ピペッティングして細胞を分散させ、5〜10分間静置して細胞を沈降させます。チャンバースライドを、30 °Cに調整した倒立蛍光顕微鏡に設置します。次に、明視野照明を用いて細胞の視野を特定します。ウェル内の200 µLの培地に、100 µg/mLのメチオニンを含む予熱したYNB培地を50 µL添加し、最終的なメチオニン濃度を20 µg/mLにします。イメージングを開始する前に、細胞を2分間静置して平衡化させます。その後、イメージングの直前に、顕微鏡を目的の焦点面に調整します。明視野またはDIC画像でGFPを5分間隔で45〜60分間取得します。この際、タイムシリーズ内のすべての画像に対して同一の取得パラメータを使用してください。詳細については、テキストプロトコルを参照してください。各タイムポイントにおける個々の細胞の蛍光強度を定量し、値を最初の画像の初期強度のパーセンテージとして表します。ImageJのテキストプロトコルに従って画像をエクスポートした後、ファイルメニューの「Open」オプションを使用してファイルを開きます。定量には蛍光画像を用い、細胞の位置を特定するための参照として明視野画像またはDIC画像を使用します。DICで観察した際に生存細胞よりも暗く見え、GFPチャンネルで自家蛍光を発する死細胞は除外してください。背景が不均一な画像については、「Process」メニューから背景減算アルゴリズムを選択し、デフォルト設定を適用します。画像の取得後、定量手順に進む前に背景減算を行うことが重要です。背景信号によってサンプル間の差異が隠れたり、弱まったりする可能性があるため、このステップは特に重要となります。フリーハンド選択ツールを使用して、細胞全体を含めつつ、細胞外の領域をできるだけ少なくするように細胞を囲みます。次に、[Analyze]メニューの [set measurements]機能を使用して、面積、統合密度、および平均グレー値を測定します。[Analyze]から [Tools]をクリックして、ROIマネージャーを開きます。ROIマネージャーウィンドウで [Add]ボタンをクリックし、ハイライトされた領域を新しいROIとして登録します。画像内の残りの細胞についても、死細胞や画像の端に接している細胞を除いて、同様に外形描出と計測を繰り返します。測定ボタンをクリックして選択したROIをzipファイルとして保存すると、新しいウィンドウに測定値が表示されます。次に、詳細ボタンをクリックし、すべての測定値をスプレッドシートまたは統計解析ソフトウェアにエクスポートしてください。酵母細胞のコロニーを2〜3個、プラスミド選択の維持に必要な追加栄養素を欠いたYNB培地0.5 millilitersに接種する。ローラードラムを用いて30 degrees Celsiusで16〜24時間培養する。さらに、プラスミド維持用の追加栄養素を欠いたYNB培地1 milliliterを加え、さらに3時間培養する。次に、1 mLの細胞を5 mLのラウンドボトムチューブ2本にそれぞれ分注します。その後、1本目のチューブに0.25 mLのYNB Met培地を加え、2本目のチューブには最終濃度が20 µg/mLとなるよう、100 µg/mLのメチオニンを含むYNB培地0.25 mLを加えます。サンプル数が多い場合は、分析時間を考慮してメチオニンの添加時間をずらしてください。当社のフローサイトメーターでは、1回のランにつき最大40サンプルまで測定可能です。メチオニンはバッチごとに追加します。5分ごとに8サンプルずつ添加します。これにより、すべてのサンプルがメチオニン添加から45分から50分の間に測定されるようになります。細胞を45分間インキュベートします。その後、フローサイトメトリーで細胞を解析し、細胞サイズの指標として前方散乱光（FS）を選択し、貨物の内部移行の指標としてFITCフィルターによる蛍光強度をマッピングします。45分間のインキュベーション中に、スライダーボタンを使用してFSおよびFITCチャネルの電圧を調整し、使用している酵母細胞のサイズ範囲と蛍光強度に合わせて検出を最適化します。各条件について、10,000個の細胞のFSおよび蛍光強度を測定します。高流量設定を用いて、「グラフを追加」をクリックし、FSに対する蛍光強度の散布図を作成します。次に、x軸にFITCを、y軸にFSを選択し、1000個の点をグラフに表示します。ゲート機能を用いて、野生型Metの条件に基づき、最も明るい細胞の約5%がゲートの右側に位置するように垂直ゲートを設定します。このゲーティングを、本実験における他のすべての条件に適用します。ここに示すように、GFPまたはフルオリンでタグ付けされたMup1の内在化および蛍光強度の変化をモニタリングするため、メチオニンの存在下または不在下で、5分間隔の細胞タイムラプスイメージングを実施しました。予想通り、メチオニン不在下では、GFPおよびフルオリンでタグ付けされたMup1は細胞膜に留まっていました。対照的に、メチオニン存在下でイメージングした細胞では、貨物の内在化と一致して、細胞表面からの蛍光信号の漸次的な減少が認められました。しかし、メチオニン存在下での蛍光消失のキネティクスは、pHlourin Mup1細胞と比較してMup1 GFP細胞で遅延していました。これらの散布図は、垂直ゲートを適用した後の、メチオニン存在下または不在下における野生型または4つのdelta ENTH1細胞の蛍光強度を比較したものです。野生型Met細胞の4%が、集団の中で最も輝度の高い細胞に対応するゲートの右側に含まれていたのに対し、未処理の野生型細胞では65%がゲート内に含まれていました。対照的に、4つのdelta ENTH1細胞では、高輝度細胞と低輝度細胞の分布に差が見られず、これはエンドサイトーシスの欠陥と一致しています。この手法を習得すれば、適切に実施することで3〜4時間で完了させることができます。本手順を行う際は、すべてのサンプルで同一の処理時間後にエンドポイントデータを収集できるよう、同時に複数の実験を行う場合には開始時間をずらすことが重要です。この手順に続き、どのような新規因子が小胞輸送に寄与しているかといった追加の疑問を解決するために、花のような遺伝学的スクリーン（floral genetic screens）などの他の手法を実施することができます。本手法の開発後、小胞輸送分野の研究者は、出芽酵母におけるエンドソームの減衰（attrition）や、新たに発見されたクラスリン非依存的かつ酸性経路などの側面を探索することが可能となりました。このビデオを視聴することで、生細胞内でのエンドサイトーシス事象を定量化するために、florent型カーゴをどのように使用するかについて十分に理解できるはずです。

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JoVE Journal

Biology

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