出芽酵母におけるエンドサイトーシスの定量的、動力学的およびハイスループット分析のためのpHluorinの応用

この手順の全体的な目的は、生細胞のエンドサイトーシス経路における小胞輸送イベントを定量化することです。この手法は、タンパク質の変異や発現量の変化が輸送イベントの速度や効率にどのように影響するかなど、小胞輸送分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、蛍光タグを付けたカーゴタンパク質の強度を測定することにより、生細胞におけるエンドサイトーシス輸送を直接定量化できることです。

テキストのプロトコルに従って溶液と培地を調製した後、プラスミド選択を維持するための追加栄養素を含まない5 mLのYNB培地に、2〜3個の酵母細胞コロニーを接種します。培養液を30 °Cで振盪しながら16〜24時間培養します。イメージングの約3時間前に、各オーバーナイト培養液のOD 600を測定します。

次に、プラスミド維持に必要な追加栄養素を含まないYNB培地を用いて、OD 600が0.35から0.4となるように5 mLの希釈液を調製し、30 °Cで振盪しながら3時間培養します。培養中に、顕微鏡のエンバイロメンタルチャンバーまたは加熱ステージを30 °Cに予熱して平衡化させます。テキストのプロトコルに従って、処理済みの8ウェルガラスポットとイメージング用のチャンバースライドを準備した後、プラスミド選択用の追加栄養素を含まないYNB培地を各ウェルに200 µLずつ加えます。

培養が完了したら、1 mLをマイクロフリッジチューブに移し、8,000 RPMで2分間遠心分離して細胞をペレット化します。次に、上清を975 µL除去します。残った上清で細胞ペレットを再懸濁します。

次に、細胞懸濁液 2.5 µLを8ウェルプレートの各ウェルの中心に滴下します。ピペッティングして細胞を分散させ、5〜10分間静置して細胞を沈降させます。チャンバースライドを、30 °Cに調整した倒立蛍光顕微鏡に設置します。

次に、明視野照明を用いて細胞の視野を特定します。ウェル内の200 µLの培地に、100 µg/mLのメチオニンを含む予熱したYNB培地を50 µL添加し、最終的なメチオニン濃度を20 µg/mLにします。イメージングを開始する前に、細胞を2分間静置して平衡化させます。

その後、イメージングの直前に、顕微鏡を目的の焦点面に調整します。明視野またはDIC画像でGFPを5分間隔で45〜60分間取得します。この際、タイムシリーズ内のすべての画像に対して同一の取得パラメータを使用してください。

詳細については、テキストプロトコルを参照してください。各タイムポイントにおける個々の細胞の蛍光強度を定量し、値を最初の画像の初期強度のパーセンテージとして表します。ImageJのテキストプロトコルに従って画像をエクスポートした後、ファイルメニューの「Open」オプションを使用してファイルを開きます。

定量には蛍光画像を用い、細胞の位置を特定するための参照として明視野画像またはDIC画像を使用します。DICで観察した際に生存細胞よりも暗く見え、GFPチャンネルで自家蛍光を発する死細胞は除外してください。背景が不均一な画像については、「Process」メニューから背景減算アルゴリズムを選択し、デフォルト設定を適用します。

画像の取得後、定量手順に進む前に背景減算を行うことが重要です。背景信号によってサンプル間の差異が隠れたり、弱まったりする可能性があるため、このステップは特に重要となります。フリーハンド選択ツールを使用して、細胞全体を含めつつ、細胞外の領域をできるだけ少なくするように細胞を囲みます。

次に、[Analyze]メニューの [set measurements]機能を使用して、面積、統合密度、および平均グレー値を測定します。[Analyze]から [Tools]をクリックして、ROIマネージャーを開きます。ROIマネージャーウィンドウで [Add]ボタンをクリックし、ハイライトされた領域を新しいROIとして登録します。

画像内の残りの細胞についても、死細胞や画像の端に接している細胞を除いて、同様に外形描出と計測を繰り返します。測定ボタンをクリックして選択したROIをzipファイルとして保存すると、新しいウィンドウに測定値が表示されます。次に、詳細ボタンをクリックし、すべての測定値をスプレッドシートまたは統計解析ソフトウェアにエクスポートしてください。

酵母細胞のコロニーを2〜3個、プラスミド選択の維持に必要な追加栄養素を欠いたYNB培地0.5 millilitersに接種する。ローラードラムを用いて30 degrees Celsiusで16〜24時間培養する。さらに、プラスミド維持用の追加栄養素を欠いたYNB培地1 milliliterを加え、さらに3時間培養する。

次に、1 mLの細胞を5 mLのラウンドボトムチューブ2本にそれぞれ分注します。その後、1本目のチューブに0.25 mLのYNB Met培地を加え、2本目のチューブには最終濃度が20 µg/mLとなるよう、100 µg/mLのメチオニンを含むYNB培地0.25 mLを加えます。サンプル数が多い場合は、分析時間を考慮してメチオニンの添加時間をずらしてください。

当社のフローサイトメーターでは、1回のランにつき最大40サンプルまで測定可能です。メチオニンはバッチごとに追加します。5分ごとに8サンプルずつ添加します。

これにより、すべてのサンプルがメチオニン添加から45分から50分の間に測定されるようになります。細胞を45分間インキュベートします。その後、フローサイトメトリーで細胞を解析し、細胞サイズの指標として前方散乱光（FS）を選択し、貨物の内部移行の指標としてFITCフィルターによる蛍光強度をマッピングします。

45分間のインキュベーション中に、スライダーボタンを使用してFSおよびFITCチャネルの電圧を調整し、使用している酵母細胞のサイズ範囲と蛍光強度に合わせて検出を最適化します。各条件について、10,000個の細胞のFSおよび蛍光強度を測定します。高流量設定を用いて、「グラフを追加」をクリックし、FSに対する蛍光強度の散布図を作成します。

次に、x軸にFITCを、y軸にFSを選択し、1000個の点をグラフに表示します。ゲート機能を用いて、野生型Metの条件に基づき、最も明るい細胞の約5%がゲートの右側に位置するように垂直ゲートを設定します。このゲーティングを、本実験における他のすべての条件に適用します。

ここに示すように、GFPまたはフルオリンでタグ付けされたMup1の内在化および蛍光強度の変化をモニタリングするため、メチオニンの存在下または不在下で、5分間隔の細胞タイムラプスイメージングを実施しました。予想通り、メチオニン不在下では、GFPおよびフルオリンでタグ付けされたMup1は細胞膜に留まっていました。対照的に、メチオニン存在下でイメージングした細胞では、貨物の内在化と一致して、細胞表面からの蛍光信号の漸次的な減少が認められました。

しかし、メチオニン存在下での蛍光消失のキネティクスは、pHlourin Mup1細胞と比較してMup1 GFP細胞で遅延していました。これらの散布図は、垂直ゲートを適用した後の、メチオニン存在下または不在下における野生型または4つのdelta ENTH1細胞の蛍光強度を比較したものです。野生型Met細胞の4%が、集団の中で最も輝度の高い細胞に対応するゲートの右側に含まれていたのに対し、未処理の野生型細胞では65%がゲート内に含まれていました。

対照的に、4つのdelta ENTH1細胞では、高輝度細胞と低輝度細胞の分布に差が見られず、これはエンドサイトーシスの欠陥と一致しています。この手法を習得すれば、適切に実施することで3〜4時間で完了させることができます。本手順を行う際は、すべてのサンプルで同一の処理時間後にエンドポイントデータを収集できるよう、同時に複数の実験を行う場合には開始時間をずらすことが重要です。

この手順に続き、どのような新規因子が小胞輸送に寄与しているかといった追加の疑問を解決するために、花のような遺伝学的スクリーン（floral genetic screens）などの他の手法を実施することができます。本手法の開発後、小胞輸送分野の研究者は、出芽酵母におけるエンドソームの減衰（attrition）や、新たに発見されたクラスリン非依存的かつ酸性経路などの側面を探索することが可能となりました。このビデオを視聴することで、生細胞内でのエンドサイトーシス事象を定量化するために、florent型カーゴをどのように使用するかについて十分に理解できるはずです。