出芽酵母におけるエンドサイトーシスの定量的、動力学的およびハイスループット分析のためのpHluorinの応用
2016年10月23日
特定のタンパク質の役割や突然変異の影響について、しばしば重要な洞察を得ることができます。この論文では、定量的蛍光顕微鏡法とフローサイトメトリーを使用して、生細胞のエンドサイトーシスイベントを定量化するためのツールとして、pH感受性GFPバリアントである超黄道pHluorinを使用する方法を示します。
この手順の全体的な目標は、生細胞のエンドサイトーシス経路における水疱輸送イベントを定量化することです。この方法は、タンパク質発現の突然変異や変化がトラフィックイベントの速度や効率にどのように影響するかなど、水疱性輸送分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、蛍光タグ付きカーゴタンパク質の強度を測定することにより、エンドサイトーシスの輸送細胞と生細胞を直接定量できることです。
テキストプロトコルに従って溶液と培地を調製した後、プラスミド選択を維持するための追加の栄養素が不足している5ミリリットルのYNB培地に酵母細胞の2〜3コロニーを接種します。30°Cで16〜24時間振とうしながら培養物を育てます。イメージングの約3時間前に、各一晩の培養物のOD600を測定します。
次に、プラスミド維持のための追加の栄養素が不足しているYNB培地で0.35〜0.4のOD600で5ミリリットルの希釈液を調製し、3時間振とうしながら摂氏30度で成長させます。インキュベーション中に、顕微鏡の環境チャンバーまたは加熱ステージを摂氏30度に事前に平衡化します。テキストプロトコルに従ってイメージング用の8ウェルガラスポットとチャンバースライドを処理した缶を準備した後、各ウェルに血漿選択のための追加の栄養素が不足しているYNB培地の200マイクロリットルを追加します。
培養物の準備ができたら、1ミリリットルをマイクロ冷蔵庫のチューブに移し、細胞を8, 000 RPMで2分間ペレット化します。次に、上清の975マイクロリットルを取り除きます。細胞ペレットを残りの上清に再懸濁します。
次に、2.5マイクロリットルの細胞懸濁液を8ウェルプレートの各ウェルの中央に滴下します。ピペットで上下に動かして細胞を分散させ、細胞を5〜10分間沈殿させます。チャンバースライドを、摂氏30度に平衡化した倒立蛍光顕微鏡に置きます。
次に、明視野照明を使用して細胞のフィールドを見つけます。100マイクログラム/ミリリットルのメチオニンを含む予め加温したYNB培地をウェル内の200マイクロリットルの培地に加え、最終メチオニン濃度20マイクログラム/ミリリットルを得る。イメージングを開始する前に、細胞を2分間平衡化させます。
次に、イメージングの直前に、顕微鏡を目的の焦点面に調整します。GFPを明視野またはDIC画像で5分間隔で45〜60分間取得します。時系列内のすべての画像に対して同一の取得パラメータを使用する。
詳細については、テキストプロトコルを参照してください。各時点における個々の細胞の蛍光強度を定量化し、最初の画像の初期強度に対する割合として値を表します。画像jのテキストプロトコルに従って画像をエクスポートした後、ファイルメニューの[開く]オプションを使用してファイルを開きます。
蛍光画像を定量に使用し、明視野またはDIC画像を参照として使用して細胞の位置を特定します。DICで観察すると生細胞よりも暗く見え、GFPチャネルの下で自家蛍光を発する死細胞は除外します。プロセスメニューの背景が不均一な画像の場合は、背景減算アルゴリズムを選択し、デフォルト設定を選択します。
画像を取得したら、定量化手順に進む前にバックグラウンド減算を実行することが重要です。この手順は、バックグラウンド信号がサンプル間の違いをマスクまたは減衰させる可能性があるため、特に重要です。フリーハンド選択ツールを使用して、セル全体が含まれるようにセルの輪郭を描きますが、セルの外側の領域はできるだけ少なくします。
次に、[分析]メニューで、測定設定機能を使用して、面積、積分密度、および平均グレー値を測定します。ROI マネージャーを開くには、[分析]、[ツール] の順にクリックします。ROIマネージャーウィンドウで、追加ボタンをクリックして、強調表示された領域を新しいROIとして入力します。
画像内の残りのセルに対してアウトラインと測定を繰り返します。デッドセルや画像の端に接触するセルは除外します。測定ボタンをクリックすると、新しいウィンドウに測定値が表示され、選択したROIをzipファイルとして保存します。次に、[その他]ボタンをクリックして、すべての測定値をスプレッドシートまたは統計分析ソフトウェアにエクスポートします。
酵母細胞の2〜3コロニーとYNB培地0.5ミリリットルを接種しますが、プラスミド選択を維持するための追加の栄養素が不足しています。ローラードラムで30°Cの細胞を16〜24時間増殖させます。プラスミドの維持のために追加の栄養素が不足しているYNB培地を1ミリリットル加え、さらに3時間成長させます。
次に、1ミリリットルの細胞を2本の5ミリリットルの丸底チューブのそれぞれに移します。次に、0.25ミリリットルのYNBメット培地を最初のチューブに加え、100マイクログラム/ミリリットルのメチオニンを含む0.25ミリリットルのYNB培地を2番目のチューブに加えて、最終濃度を20マイクログラム/ミリリットルにします。サンプル数が多い場合は、事実分析の時間に合わせてメチオニンの添加をず
らします。当社のフローサイトメーターは、1回あたり最大40サンプルを測定できます。メチオニンをバッチで追加します。5分ごとに8つのサンプル。
これにより、メチオニン添加後45分から50分の間にすべてのサンプルが測定されます。細胞を45分間インキュベートします。次に、フローサイトメトリーで細胞を解析し、細胞サイズの尺度として前方散乱またはFSを選択し、カーゴの内在化の尺度としてFITCフィルターからの1つの流れる蛍光強度をマッピングします。
45分間のインキュベーション中に、スライダーボタンを使用してFSおよびFITCチャンネルの電圧を調整し、使用する酵母細胞のサイズ範囲と蛍光強度の検出を最適化します。各条件から 10, 000 個の細胞の FS と蛍光強度を測定します。高流量設定を使用して、グラフの追加をクリックして、蛍光強度に対するFSの散布図を生成します。
次に、X 軸に FITC、Y 軸に FS を選択し、1000 ポイントをグラフ化します。ゲート関数と野生型のMet条件を使用して、最も明るいセルの約5%がゲートの右側に落ちるように垂直ゲートを割り当てます。このゲーティングは、実験の他のすべての条件に使用します。
ここに示すように、GFPまたはフッ素タグ付きMup1の内在化と蛍光の変化を監視するために、メチオニンの非存在下または存在下で細胞のタイムラプスイメージングを5分間隔で行いました。予想通り、GFPとフッ素タグ付きMup1は、メチオニンの非存在下で原形質膜に留まりました。対照的に、メチオニンの存在下でイメージングされた細胞は、カーゴの内在化と一致する細胞表面からの蛍光シグナルの進行性の枯渇を示しました。
しかし、メチオニンの存在下で失われる蛍光の動態は、pHlourin Mup1細胞と比較してMup1 GFP細胞で遅延していました。これらの散布図は、垂直ゲートを適用した後のメチオニンの存在下または非存在下での野生型または4つのデルタENTH1細胞の蛍光強度を比較したものです。野生型のMet細胞の4%は、集団内で最も明るい細胞に対応するゲートの右側に含まれていましたが、未処理の野生型細胞の65%がゲートに含まれていました。
対照的に、4つのデルタENTH1細胞は、明るい細胞と暗い細胞の分布に差を示さず、エンドサイトーシスの欠陥と一致しました。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば3〜4時間で完了します。この手順を試行する際には、すべてのサンプルについて同じ処理時間後にエンドポイントデータを収集できるように、同時実験の実行から開始時間をずらすことを忘れないでください。
この手順に続いて、花の遺伝子スクリーニングなどの他の方法を実行して、水疱密売に寄与する新しい要因などの追加の質問に答えることができます。その開発後、この技術は、小胞輸送の分野の研究者がエンドソームの消耗の側面を探求する道を開き、また、出芽酵母におけるクラスリン非依存の酸性経路を新たに発見しました。このビデオを見れば、フローランタイプのカーゴを使用して生細胞のエンドサイトーシスイベントを定量化する方法について十分に理解できるはずです。
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概要
この研究は、pH感受性GFP変異体であるスーパーエクリプティックpHルオリンを使用して、生きた細胞における小胞トラフィッキング事象を定量化する方法を提示しています。この技術により、研究者は定量的蛍光顕微鏡法とフローサイトメトリーを通じて、変異とタンパク質発現の変化がエンドサイトーシス過程に与える影響を調査することができます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 蛍光顕微鏡法
背景
- 小胞トラフィッキングは細胞機能にとって重要です。
- トラフィッキングを理解することでタンパク質の役割についての洞察が得られます。
- 変異はトラフィッキングの効率に影響を与える可能性があります。
- 正確な分析には定量的方法が必要です。
研究の目的
- 生きた細胞におけるエンドサイトーシスのトラフィッキング事象を定量化する。
- タンパク質の変異がトラフィッキングに与える影響を評価する。
- 小胞ダイナミクスを研究するための信頼できる方法を提供する。
使用された方法
- 蛍光タグにスーパーエクリプティックpHルオリンを使用。
- イメージングに定量的蛍光顕微鏡法を使用。
- トラフィッキング事象の分析にフローサイトメトリーを使用。
- 実験用酵母培養物の準備。
主要な結果
- エンドサイトーシス事象の直接的定量化を実現。
- この方法はタンパク質発現の変化に対する感度を示します。
- 小胞トラフィッキングのダイナミクスに関する洞察を提供。
- 様々な細胞の文脈に適用可能。
結論
- この技術は小胞トラフィッキングを研究するための強力なツールを提供します。
- 細胞プロセスにおけるタンパク質機能の理解を深めます。
- 将来の応用は他の細胞タイプや条件に拡張される可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantifying endocytic trafficking in living cells enables mechanistic de-risking of target validation by linking protein function to vesicular dynamics. The pHluorin-based method provides predictive confidence in early discovery by directly measuring cargo internalization kinetics and efficiency. This supports go/no-go decisions in lead identification by reducing ambiguity in trafficking phenotypes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying how mutations or expression changes affect endocytic rates.
- Operational Value: Enables functional target validation through direct measurement of cargo trafficking in live yeast.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by distinguishing trafficking-competent from defective variants.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated pHluorin-tagged cargo systems for quantitative fluorescence and flow cytometry.
- Reproducibility: Standardizes endocytosis measurement via background-subtracted intensity tracking and gated FITC/FS analysis.
- Scalability: Supports high-throughput screening through flow cytometry capable of 40 samples per run with methionine batch addition.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses budding yeast as a disease-relevant system to model conserved endocytic mechanisms.
- Translational Continuity: Bridges discovery to preclinical validation by quantifying trafficking defects in genetic mutants like four delta ENTH1.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs decisions by showing delayed fluorescence loss in trafficking-defective strains.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing quantitative trafficking data that informs lead optimization and mechanistic de-risking prior to mammalian validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring how protein perturbations alter endocytic efficiency in live cells.
- Screening: Delivers assay-ready systems with quantitative outputs compatible with flow cytometry and microscopy.
- Analytics: Generates fluorescence intensity and scatterplot data enabling statistical comparison of trafficking conditions.
- Translational Research: Connects yeast endocytic mechanisms to higher eukaryotes through conserved vesicular trafficking principles.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for trafficking analysis across genetic backgrounds and compound treatments.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by directly linking cargo fluorescence quenching to endocytic progression.
- Operational Value: Ensures standardization via identical acquisition parameters and background subtraction protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid screening of trafficking phenotypes.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization through quantifiable internalization kinetics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast culture maintenance and fluorescence microscopy.
- Needs inverted microscope with environmental chamber and flow cytometer with FITC detection.
- Demands cross-team standardization of methionine timing and gating strategies.
- Involves adaptation considerations for different cargo-pHluorin fusions and genetic backgrounds.
- Includes practical limitations such as photobleaching during long acquisitions and background fluorescence in autofluorescent strains.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:34
Kinetic Assay for Quantification of Endocytosis of Cargos that Undergo Regulated Endocytosis
3:17
Post-acquisition Analysis
5:15
Population Analysis of Mup1-pHluorin Endocytosis by Flow Cytometry
7:37
Results: Quantitative, Kinetic, and High-throughput Analysis of Endocytosis of pHluorin-tagged Proteins
9:03
Conclusion
